有害物質的環境毒理學研究方法1第五章第六節

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5.6有害物質的環境毒理學

研究方法司萬童內蒙古科技大學E-mail:siwt02@163.com生物分子細胞器細胞組織器官器官系統個體種群群落

生態系統2生物系統的各級生物學水平：污染物在生物化學和分子水平上的影響污染物在細胞和器官水平上的影響污染物在個體水平上的影響污染物在種群和群落水平上的影響化學污染物對生物的聯合作用3主要內容：5.6.1污染物在生物化學和分子水平上的影響45污染物進入機體后導致的生物化學變化包括：防護性生化反應和非防護性生化反應。作用類型例子后果防護性混合功能氧化酶的誘導加快新陳代謝，生成水溶性代謝物，從而加速排泄金屬硫蛋白的生成增加對金屬的束縛速度，從而降低金屬的生物利用率非防護性乙酰膽堿酯酶的抑制作用50％以上因抑制而產生可見的毒性效應DNA加合物的生成若導致突變會發生損害作用表2－1對污染物的防護性和非防護性生化反應什么是酶（enzyme）？酶是一種特殊的蛋白質，在生物體內對代謝活動起催化作用，本身不發生變化。受酶作用的物質稱為基質（底物），在酶作用下的反應稱為酶促反應。酶和污染物的相互作用污染物進入機體后，一方面在酶的催化下，進行代謝轉化，另一方面也導致體內酶活性改變，影響酶的數量和活性。另外有些環境污染物對酶有誘導作用。目前已發現多種環境污染物能誘導生物體內一些酶的活性增加，例如：有機氯農藥、多氯聯苯、多環芳烴、表面活性劑、增塑劑和染料中間體等，均可對酶產生誘導作用。6(1)污染物對生物機體酶的影響污染物對酶輔助因子的影響一些污染物能與酶的輔助因子——金屬離子作用，從而使輔助因子失活，影響到酶的活性。例如：氰化物等能與細胞色素酶中的鐵離子結合，形成穩定絡合物，而抑制細胞色素的酶活性，使其不能傳遞電子，則細胞內的氧化代謝過程中斷，使機體不能利用氧，出現內窒息性缺氧。對酶活性中心的影響污染物還能和酶的其它活性基團結合，如汞和砷與某些酶的活性基團結合就很牢固，從而使酶失去活性。破壞酶的結構有些污染物能夠取代酶分子中的某些成分，從而使酶失去活性。如鈹的毒作用機理就是能取代某些酶分子中的鎂和錳，破壞了酶的正常結構，使酶失去活性。7與酶激活劑作用有些酶需要激活劑才能表現活性。酶激活劑往往是金屬離子，凡是能與激活劑作用的污染物都能抑制酶的活性。污染物與基質競爭同種酶而抑制酶的作用污染物與底物有相似的結構，也能與酶形成復合物，從而競相和酶發生作用。酶的抑制不可逆性抑制非競爭性抑制競爭性抑制8混合功能氧化酶（MFO）MFO是污染物在體內進行生物轉化相I過程中的關鍵酶系，它們對人工化學品解毒發揮了重要作用。MFO引起的生物轉化的反應特征相同，但底物、產物的化學特性差別很大，即具有多種催化功能。混合功能氧化酶（MFO）的作用MFO存在于所有的脊椎動物和大部分的無脊椎動物中，其作用是代謝非極性的親脂性有機化合物，包括內源性化合物和外源性化合物。從解毒作用來看，許多外源性化合物進入體內，經MFO作用后發生各種變化，大多數被轉化成低毒易溶的代謝產物排出體外。但有的則變成高毒甚至致癌物。9①

混合功能氧化酶（MFO）活性氧（ActivatedOxygen）帶有2~3個電子的分子氧還原產物，主要有：·OH、O2-、H2O2活性氧的控制和消除由體內產生的活性氧可為抗氧化防御系統控制，消除活性氧對機體的傷害作用。某些污染物如多環芳烴、多氯聯苯在生物體內進行生物轉化時產生大量活性氧。在一定范圍內，這些活性氧可被體內的抗氧化防御系統清除，但當體內的抗氧化防御系統不能消除這些活性氧時，它們可使DNA鏈斷裂、脂質過氧化、酶蛋白失活等，從而引起機體氧化應激或氧毒性。抗氧化防御系統酶超氧化物歧化酶（SOD）谷胱甘肽氧化酶（GPx）過氧化氫酶（Ct）10②抗氧化防御系統酶污染物對生物大分子的影響主要表現在以下方面：干擾正常的受體——配體的相互作用受體（receptor）是許多組織細胞膜上的大分子成分，配體（ligand）是生物體內的一些具有生物活性的化學物。正常情況下，受體與配體結合形成受體－配體復合物，產生一定的生物學效應。生物膜損傷不少環境化學物通過改變膜脂流動性，影響膜的通透性和鑲嵌蛋白質的活性，改變其結構和穩定性，從而產生生物效應干擾細胞內鈣穩態正常情況下細胞內的鈣濃度較低（10－7～10－8mol/L），細胞外濃度較高（103mol/L

）。各種細胞毒物，如硝基酚、過氧化物、汞、鉛等重金屬離子均能干擾細胞內鈣穩態，引起細胞損傷和死亡。11（2）

污染物對生物大分子的影響干擾細胞能量的合成一些環境污染物可干擾糖類的氧化，使細胞不能合成能被生物利用的ATP，ATP使細胞生命活動得不到充足的能量供給脂質過氧化(lipidperoxidation)與自由基

脂質過氧化是細胞損傷的一種特殊方式,是由于產生了自由基而引起的,正常情況下,生物體內氧化、還原和酶促反應過程中，均可產生少量自由基，一般可被體內存在的抗氧化物質（如維生素C、維生素E）所對抗，對生物危害不大。當大量污染物（自由基）進入機體，造成機體抗氧化作用失衡，即可發生脂質過氧化，對生物體造成危害。與生物大分子共價結合共價結合可改變生物大分子的結構和功能，引起一系列生物學改變，特別是與酶蛋白、脂肪、核酸等重要生物大分子共價結合，能改變其化學結構，影響其生理功能，甚至導致變性和細胞死亡。12污染物對蛋白質的影響主要表現在以下方面：導致蛋白質化學損傷：細胞膜結構及通透性改變；影響酶的催化功能等誘導生物機體內一些功能蛋白的產生：如應激蛋白（StressProteins）和金屬硫蛋白（Metallothionein）的產生，這些蛋白質的產生可保護生物機體抵抗污染物的損害。注：金屬硫蛋白對二價金屬離子具有極高的親和力，在細胞內起貯存必需的微量金屬如Zn、Cu和結合有毒金屬如Cd、Hg的作用，它與必需金屬的結合起調節這些金屬在細胞內濃度的作用，而與有毒金屬結合則可以保護細胞免受金屬毒性影響。13例：污染物對蛋白質的影響外源性化合物及其代謝產物能引起DNA損傷，它們與DNA的相互作用過程有以下四個階段：形成DNA加合物（DNAAddcuts）發生DNA的二次修飾DNA結構的破壞被固定當細胞分裂時，外源性化合物造成的危害可導致DNA突變及其基因功能的改變DNA加合物的形成是產生DNA損傷最早期的作用，隨后產生的最重要影響是DNA結構的改變，如堿基置換、堿基丟失、鏈斷裂等。DNA加合物作為一項生物指標來評價環境中化學污染物的遺傳毒性的研究日益受到重視。14污染物對DNA的影響對細胞膜的影響主要表現在以下方面：污染物引起的脂質過氧化作用導致的損傷污染物可影響膜的離子通透性污染物與膜上的受體結合，干擾正常的生理功能155.6.2污染物在細胞和器官水平上的影響

（1）對細胞膜的影響在逆境脅迫下，植物體內產生大量活性氧自由基。活性氧很容易使植物細胞內膜發生過氧化作用或脫脂作用，而丙二醛則是細胞內膜脂過氧化或脫脂的產物，會嚴重地損傷細胞的生物膜，降低膜中不飽和脂肪酸的含量，使膜的流動性降低，作為間接衡量植物體內氧化損傷程度的指標。16鎘-鋅-砷單一及復合污染對浮萍的毒性效應

同一濃度處理水平下，單一重金屬污染對浮萍丙二醛含量影響的大小依次為Cd>Zn>As。與單一污染相比，復合污染對浮萍丙二醛的生態毒性效應情況則較復雜，As+Cd對浮萍丙二醛含量的影響是因為兩者呈現拮抗作用的結果，對浮萍細胞膜增透作用較弱。而其他3種復合污染在低濃度時對浮萍丙二醛含量影響較大，在高濃度時影響作用下降。同一濃度處理水平下，單一重金屬污染對浮萍的生態毒性效應表現在對葉綠素的損傷程度為Cd>Zn>As，與單一污染相比，As+Cd和Zn+Cd復合污染對浮萍毒性增強，表現為協同作用，加強了對浮萍葉細胞的傷害；而As+Zn和As+Zn+Cd復合污染對浮萍的聯合毒性作用趨向于毒性減少的拮抗作用。17線粒體線粒體是細胞供能的場所。污染物可引起其結構改變，從而影響線粒體的氧化磷酸化和電子傳遞功能光面內質網和糙面內質網光面內質網和糙面內質網是進行激素和外源性化合物的代謝場所。糙面內質網：通過附著或解離核糖體控制蛋白質的合成例：多種化學致癌物如黃曲霉毒素能引起核糖體脫落，導致蛋白質合成控制的改變。18（2）對細胞器的影響三個概念：靶器官、效應器官和蓄積器官注1：靶器官不同于效應器官，污染物的毒作用可以通過靶器官表現處來，也可由另外的效應器官表現出來。注2：靶器官不同于蓄積器官，污染物在蓄積器官內的濃度高于其他器官，但對蓄積器官并不一定顯示毒作用。對組織器官的影響對植物，表現為葉面出現點、片傷害斑，造成葉、蕾、花、果實等的脫落對動物，以重金屬污染為例：鉛可損害造血器官和神經系統，鎘可損害肝臟、腎臟，導致骨痛病。19（3）

污染物對組織器官的影響污染物對植物在個體水平上的影響：主要表現為生長減慢、發育受阻、失綠黃化、早衰等污染物對動物在個體水平上的影響：主要表現為死亡、行為改變、繁殖下降、生長和發育抑制、疾病敏感性增加、代謝率變化205.6.3污染物在個體水平上的影響衡量致死效應的指標死亡率：死亡比例的大小，為評價污染物毒性大小的生物學指標。致死劑量（LethalDose）或致死濃度（LethalConcentration）：能引起動物死亡的污染物的劑量或濃度。半數致死劑量（LD50）或半數致死濃度（LC50）：能引起50％的動物死亡的污染物的劑量或濃度。影響致死效應的主要因素：污染物的種類及其物理化學性質生物的種類作用時間、水質條件，如溫度、硬度、溶解氧等多種污染物的綜合作用21（1）致死效應行為毒性（BehavioralToxicity）的概念指一種污染物或其他因素（如溫度、光照、輻射）使得動物一種行為超過正常變化的范圍。水環境污染可影響的生物行為：回避行為捕食行為學習行為警惕行為社會行為對鳥類行為的影響有機磷農藥可影響鳥的神經系統，導致鳥的平衡和協調性的損害。受污染的鳥類還可表現出對領地的失控和不能照顧后代。22（2）對行為的影響污染物對繁殖的影響主要表現為：產卵數、孵化率、幼體存活率下降以及繁殖行為下降等。概念：環境激素（EnvironmentalEndocrineDisrupters）指具有動物和人體激素的活性，能干擾和破壞野生動物繁殖障礙、誘發人類重大疾病的天然物質或人工合成物質。也叫做外源性雌激素或環境內分泌干擾物。環境激素的種類包括：天然雌激素、合成雌激素、植物雌激素、具有雌激素活性的環境化學物質。注：具有雌激素活性的環境化學物質：如殺蟲劑、多氯聯苯、多環芳烴、洗滌劑、塑料添加劑、食品添加劑等，工業廢水和生活污水往往含有上述物質。23（3）對繁殖的影響污染物對生長和發育的影響可通過生長指示器來測定生長指示器（ScopeforGrowth）是反映生物機體能量獲取利用和代謝的綜合指標。

P=A-(R+U)注：P——SFG；A——從食物獲得的能量；R——呼吸作用的能量損失；U——排泄作用的能量損失24（4）對生長和發育的影響概念：種群（Population）是指在一定時空中同種個體的組合。污染物對種群的影響表現為：種群數量的密度改變結構和性別比例的變化：年齡結構、種群大小、性逆轉遺傳結構的改變：在進化過程中通過改變基因頻率以適應環境的改變。競爭關系的改變255.6.4污染物在種群和群落水平上的影響

（1）

對生物種群的影響基本概念群落（Community）優勢種（DominantSpecies）優勢度？？耐污種敏感種污染物對群落的影響表現在：群落組成和結構改變對物種多樣性（SpeciesDiversity）的影響注：物種多樣性指群落中物種的數目（豐富度）和各個物種的相對密度（群落的異質性）。26（2）對生物群落的影響聯合作用(CombinedEffect)的概念指兩種或兩種以上化學污染物共同作用所產生的綜合生物學效應。聯合作用的類型：相加作用（AdditiveEffect）：污染物的總作用強度等于其各個成分單獨作用強度的總和。協同作用（SynergisticEffect）：污染物的總作用強度大于其各個成分單獨作用強度的總和。獨立作用（IndependentEffect）各污染物對機體的侵入途徑、方式、作用部位、產生毒作用的機理各不相同，因此產生的生物學效應彼此無關。拮抗作用（AntagonisticEffect）：污染物的總作用強度小于其中任何一種成分的單獨作用強度。275.6.5化學污染物對生物的聯合作用細胞色素P450的研究進展DNA加合物的形成與診斷研究進展28（1）研究進展細胞色素P450（cytochromeP450或CYP450,簡稱CYP450）：一類以還原態與CO結合后在波長450nm處有吸收峰的含血紅素的單鏈蛋白質。固醇類生物合成、脂肪酸和類固醇激素等內源性底物的氧化代謝；大部分藥物和外源物的生物氧化等；它使進入機體的外源物經代謝后向兩個方向發展：代謝解毒和代謝活化；代謝活化后的產物有較強的毒性,甚至產生致畸、致癌效應。29（2）細胞色素P450參與的生化反應與作用30（3）細胞色素P450的生化背景31（4）細胞色素P450作用原理32反應式據統計,人類每年合成數以千計的新化合物并排放到環境之中,這些化合物許多具有遺傳毒性。如何對這些化學物質進行監測和評價是一項十分艱難而重要的工作。檢測周圍媒體(大氣、水、土壤等)中化合物含量水平來評價有毒物和人體健康之間的關系是不夠的,因為這種外劑量的評價方法只能給出生物體可能接受的大概劑量,而不能給出一定的信息來說明生物體對毒物的吸收、代謝、生物效應等的差異。隨著研究的深入,人們提出應用大分子(蛋白質、RNA、DNA)加合物來研究和評價具有遺傳毒性的化學物質致癌風險性。它們不僅能反映化學物質及其代謝產物在組織或體液中的劑量,而且能夠提供實際到達的作用部位或與關鍵的細胞大分子反應的確切劑量。其中DNA加合物由于意義重大而成為多學科如環境科學、預防醫學、臨床醫學等領域當前的國際研究熱點。33（5）加合物的研究意義

DNA加合物的形成毒性機理形成過程

DNA加合物的診斷色譜-質譜法

32P-后標記法免疫學法34（6）DNA加合物的形成與診斷研究進展DNA加合物就是親電性的化合物或其代謝產物和生物體內大分子形成共價相連的化合物,是DNA化學損傷的最重要和最普遍的形式。這種加合物一旦逃避自身的修復,就可能成為致突、致畸、致癌的最小因子,因此DNA加合物的形成被認為是致腫瘤過程的一個重要起始階段。研究表明DNA加合物的形成與腫瘤的發生、發展之間存在著因果聯系和劑量——反應關系。35（7）DNA加合物與腫瘤DNA加合物的形成是遺傳毒性物質導致生物體遺傳毒性的前提,含DNA加合物的DNA分子未能被修復或被細胞錯誤地復制,將會導致一系列基因突變而產生遺傳毒性。大多數遺傳毒性化學物質如PAHs在生物體內一般首先經過存在于許多生物組織中的混合功能細胞色素氧化酶P450的代謝。它們形成DNA加合物的途徑有2種：1)通過單電子氧化途徑;2)通過混合功能細胞色素氧化酶P450的激活。化合物氧化途徑活化并且生成嘌呤加合物,大多數通過單電子氧化途徑形成的DNA加合物具有不穩定的糖苷結構,能自動地使嘌呤脫落而形成一無嘌呤位點,這個位點被認為DNA分子上的一個致突變損傷,同時這些無嘌呤位點也有可能是一些化合物致癌的主要原因。36（8）毒性機理

許多污染物是親電化合物,它們具有低電子密度中心,因此可以與具有高電子密度的分子(如具有親核中心的DNA分子或蛋白質分子Y)反應,形成生物大分子加合物.大多數親電子劑(RX)的加合物形成機理是親核替代,親電子基團通過親核原子(O、N、S等)的一對不共享的電子(∶或-與之形成一個新的共價鍵.如式(1)所示被替代基團(X)。根據反應物性質的不同或被親核基團(Y)中和或帶上了負電：37（9）形成過程（10）DNA加合物與致癌關系DNA加合物是化學致癌過程的一個早期、可檢測的重要步驟，通過DNA加合物與突變和致癌關系的研究，人們認識到DNA加合物可能是化學致癌物與癌癥之間的一個分子橋梁。有可能用于腫瘤防治的早期生物監測，對化學致癌機理的探討及腫瘤病因的研究具有重要意義，并可最終為腫瘤的預防和治療服務。38（11）DNA加合物的形成機制DNA呈雙鏈超螺旋結構存在于細胞中,嘌呤和嘧啶堿基重于螺旋內側。在DNA的4個堿基中,存在著N、O、P、等原子,這些原子都含有孤對電子,容易受到親電試劑的攻擊。研究表明,在DNA分子至少有12個位點易受到化學致癌劑的攻擊。對于大多數致癌物都是經過代謝活化后變成親電的代謝物后,再與DNA發生共價結合的,但也有直接結合的化合物。39

目前最常用的診斷、檢測及定量分析加合物的方法,原理是根據復雜樣品中的各組分在流動相和固相間具有不同的分配系數,當兩相作相對運動時,各組分便在兩相中進行溶解、吸附、脫附的多次反復分配,達到彼此分離的結果.這種色譜分離技術與適當的檢測手段(如電化學檢測器等)相結合時,就構成了色譜分析法.當前最成熟的聯用儀是色譜/質譜聯用儀。該法的優點是靈敏度高、特異性強、用于檢測極微量加合物的存在及研究其形成機理。GC-MC和LC-MC在分析蛋白質加合物中有重要作用.毛細管氣相色譜與質譜聯合分析是目前靈敏度最高的技術之一,目前已研制出毛細管區帶電泳分離與質譜聯用技術,并被應用于加合物的診斷、分離和檢測。40（12）色譜-質譜法DNA加合物的診斷高效液相色譜法(HPLC)和氣相色譜法(GC)聯合其它敏感的檢測法檢測DNA損傷已成為一種趨勢。如HPLC-32P后標記方法是非常敏感的方法。氣/質聯用法(GC/MS)雖然靈敏度稍低，但可以提供加合物準確的結構信息，這一點是其它方法不能比擬的。目前該方法多用于尿中排泄的DNA加合物的檢測，需水解DNA才能測定。其敏感性與熒光法相似。41（13）高效液相色譜法及氣/質譜法Gupta于1982年就建立32P后標記法(32P-PostlabelingAssay)來診斷、檢測生物體中形成的DNA加合物.一種非常靈敏的診斷方法,靈敏度為1個DNA加合物/1×109～1×1010核苷酸.該法的基本原理是,與外源性物質形成加合物的單核甘酸,可抵制酸酶的降解,并被標記上32P,從而通過放射性的定量分析診斷、檢測所形成的DNA加合物.此法的優點是檢測能力強所需DNA的樣品量少,非常適合只能提供少量DNA的人體樣本(幾個微克)的檢測,不需要事先制備加合物標樣,用空白對照可以定量計算加合物含量,既可用于單一加合物的檢測,也可用于復雜混合物的測定,及未知的內源性親電性物質所形成的加合物的測定,應用范圍廣,可適用于檢測不同類型的化學污染物,如PAH、芳香胺、烷基化物、不飽和醛類以及活性氧、紫外線輻射等所引發的DNA加合物,尤其是可用于生態毒理學研究中生物樣品的加合物測定以及判斷化合物的生態毒性.其缺點是特異性較差,步驟比較多,穩定性不易掌握,不同的實驗室所測定的結果差別很大。在定量水平上存在局限性,因此有必要同其它檢測方法結合起來進行應用.42（14）32P-后標記法

--為國際公認的最有發展前途的方法DNA加合物的診斷Sabtella等于1988年創建了酶聯免疫吸附測定法(ELISA),該方法用生物大分子加合物抗體(單克隆體或多克隆體)來診斷、檢測靶組織中的相應加合物及其含量,可以在特異的組織或細胞中進行定位研究。其測定DNA加合物的靈敏度為1個DNA加合物/1×107～1×108核苷酸。該方法的基本原理為抗原抗體反應,通常需要結合其它的富集、分離及檢測加合物的方法來得出最佳測定效果。其優點是費用低,簡便易行,無須接觸高水平的暴露量,適用于大量人群流行病學調查的研究。其缺點為所需樣本量大,抗體間存在交叉反應,對于非抗原性加合物和未知抗原的加合物不能進行檢測。43（15）免疫學法DNA加合物的診斷基本原理是抗原與抗體的反應。已發展的方法有競爭性放射免疫測定(RIA)；固相競爭或非競爭性酶聯免疫吸附測定法(ELISA)；超敏酶促放射免疫測定(USERIA)等。其檢測限一般為1個加合物/1×107～1×108核苷酸,目前已有20多種單克隆多克隆抗體可供使用。免疫法的優點是簡便易行,價廉,不需要酶解DNA鏈,用免疫沉淀技術可以將有加合物的DNA鏈和無加合物的DNA鏈分離，適用于大量人群流行病學調查的研究。其缺為點是抗體存在交叉反應,所需DNA量較大(25～60Lg)。另外對于非抗原性加合物和未知抗原加合物的檢測無能為力。44免疫學法熒光測定法的原理是通過某些化合物的加合物具有熒光特性而進行定量,其靈敏度為1個加合物/106～108核苷酸,所需樣品量為100μg左右.

熒光法的優點是不破壞生物大分子鏈,并可區分出加合物的不同立體異構體及大分子鏈不同位點上的加合物.熒光法還可用于研究DNA加合物的形成或修復與時間之間的動態關系,但不適用于檢測發光的化合物.45（16）熒光測定法DNA加合物的診斷原理是通過某些化合物(特別是多環芳烴)的DNA加合物具有熒光的特性來測定,其檢測限為1個加合物/106-8核苷酸,目前發展的技術有同步熒光色譜法,激發-發射熒光法,低溫激光法。熒光法的優點是不破壞DNA鏈就可以測定,另外可以確定加合物的不同立體異構體及DNA鏈上的不同位點上的加合物,