《分子生物學實驗》實驗四、大腸桿菌感受態細胞的制備分子生物學實驗實驗四大腸桿菌感受態細胞的制備實驗結果與討論實驗步驟實驗儀器與試劑實驗原理實驗目的分子生物學實驗實驗目的1、掌握大腸桿菌感受態細胞的制備原理。2、學習CaCl2法制備大腸桿菌感受態細胞的方法和技術。分子生物學實驗實驗原理

1、感受態細胞制備原理：受體細胞經過一些特殊方法(如電擊法、CaCl2、RbCl等化學試劑法)處理后，細菌會膨脹成球形，細胞膜的通透性發生了暫時性的改變，成為允許外源DNA分子進入的感受態細胞(Compenentcells)。（Ca2+會使細胞膜磷脂雙分子層形成液晶結構，促使細胞外膜與內膜間隙中的部分核酸酶解離開來，離開所在區域）分子生物學實驗2、感受態轉化原理：細菌處于0℃的CaCl2低滲溶液中，細胞膜的通透性發生變化，同時轉化混合物中的質粒DNA會形成抗DNase的羥基-鈣磷酸復合物黏附于細胞表面，經過42℃短時間的熱激處理，促進感受態細胞吸收DNA復合物，在培養液中生長數小時后，球狀細胞復原并分裂增殖，在選擇培養基上可獲得所需的轉化子。抗Amp宿主細菌含Amp培養基實驗儀器超凈工作臺離心設備臺式高速冷凍離心機制冰機分子生物學實驗實驗試劑1、實驗材料：E.

coliJM109。2、實驗試劑：LB液體培養基：稱取胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，加雙蒸水至總體積1L，高壓下蒸氣滅菌。(2)0.1mol/LCaCl2溶液：稱取1.1098gCaCl2(無水,分析純)，溶于90mL重蒸水中，定容至100mL，高壓滅菌。(3)30%甘油：量取30mL甘油，加入70mL雙蒸水，混勻，定容至100mL，高壓滅菌。分子生物學實驗實驗步驟菌體的培養(事先已做)受體菌的培養從

LB平板上挑取新活化的E.coli

JM109單菌落，接種于3～5

mLLB液體培養基中，37℃下振蕩培養

12hr左右，直至對數生長后期。將該菌懸液以

1:

100～1:

50

的比例接種于50mLLB液體培養基中，37℃振蕩培養2～3hr，至OD600為0.3～0.4。分子生物學實驗取2個1.5mL離心管，分別轉入1mL菌液，4℃12000rpm，離心2min。棄去上清，每管加入1mL預冷的

0.1mol/L

CaCl2

溶液，懸浮細胞，冰上放置

30min。4℃

，12000rpm，離心2min。棄去上清，每管加入50μL預冷的0.1mol/LCaCl2

溶液，輕緩懸浮細胞,50μL預冷的30%甘油，冰上放置5min，即為感受態細胞懸液。將感受態細胞懸液，放置于-80℃，可保存半年。2.感受態細胞的制備(CaCl2

法，超凈臺內)分子生物學實驗第二天，CaCl2

法前一天晚上，第二天早上菌體的活化感受態的制備分子生物學實驗每人2管感受態細胞結果分子生物學實驗注意事項細胞生長狀態和密度：不要用經過多次轉接或儲于４℃的培養菌，最好從-80℃甘油保存的菌種中直接轉接用于制備感受態細胞的菌液。細胞生長密度以剛進入對數生長期時為宜，可通過監測培養液的OD600來控制。JM109菌株的OD600為0.3－0.4密度比較合適，密度過高或不足均會影響轉化效率。實驗操作時要格外小心，懸浮細胞時要輕柔