實驗七

血液葡萄糖的測定（福林-吳憲氏法）一、實驗目的掌握無蛋白濾液的制備方法；掌握采用福林-吳憲氏法測定血液中葡萄糖的原理；進一步熟悉分光光度計的使用。吳憲的科學貢獻吳憲的博士論文為基礎的一系列工作，為現代臨床血液化學分析提供了重要的分析手段，在國際上長時間被廣泛采用。其中關于血糖測定的方法被國際上沿用長達70年，為此他被譽為國際血液分析的權威。在20世紀20年代以前，測驗血中的非蛋白氮組分對病人來說是個沉重的負擔，例如僅一次尿酸測定就需耗血25毫升。而福林—吳的新方法只需10毫升就足以進行包括尿素、肌氨酸、肌氨酸酐、尿酸和糖的測定（其中只需一滴血就能測定血糖）。二、實驗原理磷鉬酸鉬藍（藍色）C6H12O6+2Cu(OH)2C5H11O5COOH+Cu2O↓3Cu2O+3H3PO4·2MoO3·12H2O6CuO+3H3PO4·Mo2O3·12H2ONa2CO3＋H2O＝NaOH+NaHCO3

NaOH+CuSO4=Cu(OH)2+Na2SO4堿性銅試劑鉬藍溶液顯藍色，其藍色的深淺與血濾液中葡萄糖的濃度成正比，選用顏色深淺較接近于測定管的標準管一同比色，即可求出測定管中葡萄糖的含量。血糖管的使用：血糖管下部的管徑較細，以避免還原生成的氧化亞銅被空氣中的氧再氧化，降低實際結果。鎢酸法

原理：血液中的蛋白質在pH小于其等電點時，可用鎢酸來沉淀。鎢酸鈉與硫酸混合產生鎢酸和硫酸鈉，游離的鎢酸被，蛋白質吸附，形成不溶性的鎢酸蛋白而沉淀，經過濾或離心，除去沉淀即得無蛋白的血濾液。試劑：①10%鎢酸鈉溶液；②0.333mol／L硫酸溶液。儀器與器材：錐形瓶、吸管、奧氏吸管、濾紙、漏斗或離心管及離心機。方法與步驟：①取50ml錐形瓶1只，加入蒸餾水7份；②用奧氏吸管吸取抗凝血l份，擦去管壁外血液，將吸管插人錐形瓶中水的底部，緩慢地放出血液。放完血液后，將吸管提高吸取上清液再吹人，反復洗管3次。充分混合，使紅細胞完全溶解；③加入1/3mol／L硫酸溶液1份，隨加隨搖，充分混勻。此時血液由鮮紅變成棕色，靜置5～10min，使其酸化完全；④加入10％鎢酸鈉溶液1份，邊加邊搖，血液由透明變成凝塊狀。當振搖到不再產生泡沫為止；⑤放置數分鐘后用定量濾紙過濾或離心除去沉淀，即得完全澄清的無蛋白血濾液，供測定用。用此法制得的無蛋白血濾液為10倍稀釋的血濾液。即每毫升血濾液相當于全血0.ml，適用于葡萄糖、非蛋白氮、尿素氮、肌酸酐和氯化物等的測定。三、實驗步驟1、全血無蛋白濾液的制備抗凝血1ml蒸餾水7ml混勻1/3mol/L硫酸1ml振搖10%鎢酸納1ml振搖過濾放置5min無蛋白血濾液2、按表操作混勻，置沸水浴中煮8min。取出用流動自來水冷卻3min無蛋白血濾液蒸餾水標準葡萄糖應用液堿性銅試劑空白管標準管測定管1.02.01.01.0---1.0-2.02.02.0血糖管試劑ml磷鉬酸試劑2.02.02.01：4磷鉬酸溶液加至混勻后放置2min12.512.512.53、比色測定將各管顛倒混勻后，用空白管調零，在420nm處測定吸收度。四、操作注意1、等水沸騰后，才能放入血糖管。加熱要準確8分鐘。2、冷卻時切不可搖動血糖管，以免還原的氧化亞銅被空氣中的氧再氧化，降低實際結果。3、加入磷鉬酸后迅速比色。4、分光光度計的使用。五、結果計算測定管吸收度標準管吸收度葡萄糖（mg/100ml）×0.1

×1000.1

六、分析討論=1、分光光度計的原理分光光度計是根據物質對光的選擇性吸收來測量微量物質濃度的儀器，具有靈敏度、準確度高，操作方便、快速等特點。其工作原理為光的吸收定律（朗伯—比爾定律）：一束單色光(強度為I0)通過某吸光物質的溶液時，其光能量的被吸收與該物質濃度的關系符合朗伯—比爾定律，即當入射光波長、溫度和溶液的厚度一定時，吸光度與溶液的濃度成正比。用公式表示為：T=I／I0

則A=lg（1／T）=Kbc

式中T—透光率

I—透過光強度

I0—入射光強度

A—吸光度

K—比例常數

b—溶液的厚度

c—溶液的濃度7200分光光度計分光光度計的組成

分光光度計種類很多，一般包括光源、單色器、吸收池、檢測器和指示器五大部件組成。1.光源：是一種可以發射出供溶液或吸收物質選擇性吸收的光。光源光強度應大，有良好的穩定性，在整個光譜區域內光的強度不應隨波長有明顯的變化。2.單色器：

將來自光源的光按波長的長短順序分散為單色光并能隨意改變波長的一種分光部件，包括入口狹縫、色散元件、出口狹縫和準直鏡四部分組成。3.吸收池：

又稱為比色皿或比色杯等。常用吸收池是用無色透明、耐腐蝕的玻璃或石英材料制成，前者用于可見光區，后者用于紫外光區，吸收池光程0.1~10cm不等，其中以1cm為最多。4.檢測器：檢測器的作用是檢測通過溶液后的光強度、并把光信號轉變成電信號。常見的檢測器有硒光電池、光電管和光電倍增管，后二者主要用于分光光度計。5.指示器：

常用儀器指示器有光點檢流計、微安表、記錄器和數字顯示器等。光點檢流計和微安表指示器的標尺上刻有百分透光度（T%）和吸光度A。

7200型分光光度計使用方法1．準備

在接通電源前，應對儀器的安全性進行檢查，電源線、接線應牢固，接地線通地要良好，各個調節旋鈕的起始位置應該正確。通電：指示燈亮，儀器自檢，預熱20min;用鍵設置測試方式:透射比(T),吸光度(A),已知標樣濃度方式(C)和已知標樣濃度斜率(K)方式;波長選擇：用波長調節旋鈕設置所需的單色光波長;放樣順序：打開樣品室蓋，在1~4號放置比色皿槽中，依次放入%T校具(黑體)，參比液，樣品液1和樣品液2.

?容積光面對準光路手握毛面

7200型分光光度計的使用方法2．校正

校具(黑體)校“0.000”：將%T校具(黑體)置入光路，在T方式下按“%T”鍵，此時儀器自動校正后顯示"0.000"

參比液校“100”%（T）或“0.000”（A）：將參比液拉入光路中，按“0A/100%T”鍵調0A/100%T，此時儀器顯示“BLA”，表示儀器正在自動校正，校正完畢后顯示“100”%T或“0.000”A后，表示校正完畢，可以進行樣品測定。該模式下使空白試樣透光率100%該模式下使空白試樣吸光度為0.000拉動滑竿測定樣品的吸光度3.測定

將兩樣品液分別拉入光路中,此時若在“T”方式下則可依次顯示樣品的透射比(透光度)若在“A”方式下，則顯示測得的樣品吸光度。

4．結束

測量完畢，關閉電源，將各調節旋鈕恢復至初始位置。取出吸收池，維持其干凈，不能有液體。比色皿洗凈，晾干，存于專用盒內。5.注意事項：使用前，使用者應該首先了解本儀器的結構和原理，以及各個旋鈕之功能。儀器接地要良好，否則顯示數字不穩定。如果大幅度改變測試波長時，在調整“00.0”和“100”后稍等片刻（因光能量變化急劇，光電管受光后響應緩慢，需一段光響應平衡時間），當穩定后，重新調整“00.0”和100”。儀器左側下角有一只干燥劑筒，應保持其干燥，發現干燥劑變色應立即更新或烘干后再用。儀器停止工作時，關掉電源，電源開關需同時切斷，并罩好儀器比色皿的清潔程度,直接影響實驗結果.不要用手摸比色皿的光滑的表面，更不要用毛刷刷洗比色皿，因此,特別要將比色皿清洗干凈.先用自來水將用過的比色皿反復沖洗,然后用蒸餾水淋洗,倒立于濾紙片上,待干后再收回比色皿盒中.必要時,還要對比色皿進行更精細的處理,如用濃硝酸或鉻酸洗液浸泡,沖洗.比色皿與分光光度計應配套使用,否則會引起較大的實驗誤差.

比色皿不能單個調換預熱是保證儀器準確穩定的重要步驟.比色皿內盛液應為其容量的2/3,過少會影響實驗結果,過多易在測量過程中外溢,污染儀器.

比色皿中試樣裝入量應為2/3～3/4之間拿放比色皿時,