基因工程

geneticengineering生物工程微生物工程基因工程細胞工程酶工程緒論學科誕生的理論和技術基礎基因工程的概念和研究內容基因工程的應用和發展基因工程的研究動態基因工程技術誕生的3大理論基礎▼

20世紀40年代，O.T.Avery發現生物遺傳信息的化學本質是DNA而非protein(肺炎球菌轉化實驗)

▼20世紀50年代，Watson-Crick提出DNA的雙螺旋結構模型；半保留復制機理；解決了基因的自我復制和傳遞問題

▼20世紀60年代，相繼提出“中心法則”和操縱子學說,成功破譯遺傳密碼43，闡明遺傳信息的流向和表達問題20世紀40-60年代的3大理論發現，從理論上確立了基因工程的可能性，但在進行基因工程技術操作時，

科學家仍面臨3個基本技術問題：①如何從生物體龐大的雙鏈DNA分子中將所需要的基因片段切割下來；②如何將所切割下來的DNA片段進行繁殖擴增；③如何將所獲得的基因片段重新進行連接。

▼“基因剪刀”－限制性內切酶

1970年H.O.Smith和K.W.Khorana在流感嗜血桿菌(Haemophilusinffuenzae)中分離純化了第1個核酸限制性內切酶HindⅡ1972年H.W.Boyer實驗室首先發現EcoRI核酸內切酶

基因工程技術誕生的5大技術基礎

1970年Baltimove和Temin等同時各自發現了逆轉錄酶，完善了遺傳學中心法則，使真核基因的制備成為可能▼逆轉錄酶1、真核基因組龐大而復雜，基因圖譜不易制得，2、基因多有內含子，不能在原核表達系統剪接出成熟的mRNA，難以獲得相應的產物，逆轉錄酶的用途：mRNA→cDNA(complementoryDNA）→構建文庫、分離目的基因▼連接酶

1967年世界上5個實驗室幾乎同時發現DNA連接酶：該酶參與DNA單鏈裂口(gap)或缺口(nick)的修復，連接DNA分子的自由末端

1970年Wisconsin大學H.G.Khorana實驗室發現T4DNA連接酶活性更高，能催化完全分離的兩段DNA分子進行平末端的連接▼載體

早期載體工作的研究對象：噬菌體；側重于研究病毒和寄主細菌間的關系1946年L.Berg研究細菌性因子(F因子),50-60年代相繼發現抗藥性R因子：分子量小，具有抗藥性選擇標記和易于操作等優點1973年S.Cohen將質粒作為基因工程載體使用20世紀40年代Avery發現外源DNA分子導入細菌細胞的轉化現象(肺炎鏈球菌實驗，發現DNA是遺傳信息的攜帶者而非蛋白質)▼受體1970年Mandel和Higa發現，大腸桿菌的細胞經過氯化鈣的適當處理后，便能夠吸收λ噬菌體的DNA1972年以后，大腸桿菌成為分子克隆的良好受體20世紀70年代的上述發現，從技術層面上解決了用基因工程改良生物的實際問題，最終促成了基因工程學科的誕生第一個重組體的構建

1972年，美國斯坦福大學P.Berg等在PNAS上發表了題為∶“BiochemicalmethodeforinsertingnewgeneticinformationintoDNAofSimianVirus40:circularSV40DNAmoleculescotaininglamdaphagegenesandthegalactoseoperonofEscherichiacoli.Proc.Natl.Acad.Sci.USA69:2904-2909,1972”，標志著基因工程技術的誕生2個重大歷史事件1972年，美國斯坦福大學

P.Berg博士等用E.coRⅠ酶切猿猴病毒SV40DNA和λphageDNA后，用T4DNA連接酶將兩種消化片段連接成重組體分子

意義：世界上第一次成功的DNA體外重組實驗

P.Berg的貢獻：

第一個有功能的重組體的構建◆雖然Berg的工作具有劃時代的意義，但是他們并沒有證明體外重組的DNA分子具有生物學功能◆1973年，S.N.Cohen等在PNAS上發表文章“ConstructionofBiologicallyFunctionalBacterialPlasmidInVitro”（S.N.Cohen,A.C.Y.Chang,H.W.Borer,andR.B.Helling,Proc.Natl.Acad.Sci.USA70:3240-3244,1973）宣布體外構建的細菌質粒能夠在細胞中進行表達，完善了Berg開創的基因重組技術Cohen的貢獻：

1973年,斯坦福大學

S.N.Cohen等將E.coli的R6-5質粒DNA：編碼卡那霉素（kanamycin）抗性基因pSC101質粒：編碼四環素（tetracycline）抗性基因

體外切割并連接成重組體分子，轉化E.coli，篩選出了具雙抗抗性的菌落,實現了細菌遺傳性狀的轉移中國的胰島素生產之路：1998年，中國成功研發出具有自主知識產權的基因重組人胰島素。世界上三個能生產基因重組人胰島素的國家：美國、丹麥和中國1982年，第一個基因工程藥物在美國批準上市：基因重組人胰島素

（通化東寶-甘舒霖：95年開始研發，98年成功，2008年規模生產，亞洲最大）徐州萬邦？BoyerandCohen

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研究策略基因和基因工程的概念

基因（gene）是遺傳學家約翰（W.Johannsen）在1909年提出來的，他用基因這一名詞來表示遺傳的獨立單位，相當于孟德爾在豌豆試驗中提出的遺傳因子孟德爾的遺傳因子階段；摩爾根的基因階段；順反子階段；現代基因階段（操縱子、移動、假、斷裂、重疊基因）基因(gene)核酸分子中儲存遺傳信息的遺傳單位，包括編碼功能蛋白質或RNA序列信息及表達這些信息所必需的全部核苷酸序列基因工程(geneticengineering)：“重組DNA技術”

將外源基因通過體外重組后，導入受體細胞，使該基因在受體細胞內復制、轉錄、翻譯表達的現代生物技術目的：獲得由外源基因所編碼的蛋白質

改變受體生物的遺傳性狀,創造新的生命特點:分子水平操作，細胞水平表達基因工程實施的4個要素：

工具酶載體基因受體細胞載體目的基因構造DNA重組分子(載體+目的基因)轉化/轉染/轉導(使重組DNA分子進入寄主細胞)表達(外源基因在寄主細胞內轉錄、表達)基因工程產品的分離純化基因工程的操作流程或促使生物體遺傳性狀發生改變基因工程研究的主要內容基礎研究：針對基因工程技術的操作流程應用研究：基因工程藥物、轉基因植物、轉基因動物、酶制劑工業、食品工業、化學與能源工業及環境保護等。基因工程的安全性研究1、基因工程載體：核心環節；適于高等動植物基因的表達載體和定位整合載體有待大力開發；2、基因工程工具酶：DNA的體外合成、切割、修飾和連接等一系列過程中需要的酶；3、基因工程新技術：特殊用途的PCR技術、電泳技術、轉化技術（如基因槍和電激儀）；4、基因工程受體系統：原核生物大腸桿菌、藍細菌、酵母菌、高等植物的部分組織和器官、動物的生殖細胞或胚細胞-體細胞、人的體細胞-異