維生素的測定概述

維生素是調節人體各種新陳代謝過程必不可少的重要營養素。人體如從膳食中攝入維生素的量不足或者機體由于某種原因吸收或合成發生障礙時，就會引起各種維生素缺乏癥。近幾年已經查明僅有少數幾種維生素可以在體內合成，大多數維生素都必須由食物供給。因此，維生素作為強化劑已在食品工業的某些產品中開始使用，測定食品中的維生素含量，不僅可評價食品的營養價值，同時還起到監督維生素強化食品的劑量，以防攝入過多的維生素而引起中毒，所以，測定食品中維生素在營養分析方面具有重要的意義。

第十一章維生素的測定

脂溶性微生物素（如A、D、E、K等）；水溶性維生素（如B1、B2、B6、C、B12等）。維生素A：是人體必需營養素，能促進人體發育，防止眼膜炎、夜盲癥等疾病。維生素B1：也叫硫胺素，對人體的功能主要是防腳氣病、神經炎，幫助消化，促進發育。維生素B2：對人體功能防口角炎、皮膚炎，防止怕光現象。維生素C：防壞血病，促進外傷愈合，使機體增強抵抗力。維生素D：調節體內礦物鹽的平衡，特別是對人體內鈣、磷的代謝，并能防止軟骨病。

目前已發現的維生素約有二、三十種，按維生素溶解性能可將它們分成兩大類：

分析方法維生素的分析方法可分為以下幾種：（1）涉及人體和動物的生物分析方法。（2）利用原生動物、細菌和酵母的微生物分析方法（3）分光光度法、熒光法、色譜、酶法和免疫等物理化學分析方法。

脂溶性維生素的測定一、維生素A目前維生素A都是合成的，來源：（1）從動物肝臟中得到；（2）從維生素前體而得到（維生素前體：主要指類胡蘿卜素，主要是β-胡蘿卜素）維生素A的測定常用的方法有三氯化銻比色法、紫外分光光度法、熒光分析法、液相色譜法。對于三氯化銻比色法適用于樣品中含VA高的樣品，方法簡便、快速、結果準確，但是對維生素A含量低的樣品，如每克樣品中含5～10μg維生素A時，這時樣品由于受其脂溶性物質的干擾，不應用比色法測定。對于紫外分光光度法不必加顯色劑顯色，可直接測定維生素A的含量，對樣品中含VA低的也可以測出可信結果，操作簡便、快速。

1、維生素A的性質

⑴因有許多不飽和鏈，故見光易分解；⑵在缺氧情況下，對熱較穩定，對光特別敏感。如測強化奶粉時，速度要快，一般要求測定時間短，因為時間長，見光時間長，見光分解，故測出的比出廠的含量要少；⑶對堿穩定；2.測定方法2.1三氯化銻光度法2.1.1測定原理在氯仿溶液中，維生素A與三氯化銻作用可生成藍色可溶性絡合物，在620nm波長處有最大吸收峰，其藍色的深淺與維生素A的含量在一定范圍內成正比，故可通過吸光度測定維生素A的含量。

2.1.2測定步驟

⑴樣品用有機溶劑萃取脂類樣品可以根據脂肪的測定處理脂肪，即索氏抽提法，采用乙醚作提取劑，也可用回流方法提取脂類。如果樣品中含蛋白質和淀粉多的情況下可采用乙醚提取法。⑵脂類的皂化脂類含有維生素和脂肪這兩部分，通過皂化（50%KOH、無水C2H5OH、熱回流）把它們分開，得到一部分皂化物和一部分不皂化物。皂化條件：（1）C2H5OH︰脂類=8︰1；（2）皂化溫度與時間：70℃、30分鐘在皂化時可以加入抗氧劑焦性沒食子酸，防止氧化。目前皂化有三種情況：低堿=脂肪︰KOH為1︰2.5的關系另外在皂化時加抗氧化劑與不加抗氧化劑回收率不一樣，加抗氧化劑的回收率高于不加抗氧化劑的回收率。

低溫（室溫）中溫（70℃±2℃）高溫（100℃15min）低堿低堿低堿回收率不完全回收率46%回收率70%⑶提取：不皂化物和皂化物經水、乙醚萃取可得到不皂化物。⑷柱層析分離干擾物質采用柱層析分離干擾物質，如果柱層析把β-胡蘿卜素也洗脫下來，那么這時維生素A與β-胡蘿卜素就是一個混合物，還要將它們分離開。如果樣品中只有維生素A而不含β-胡蘿卜素時，這時可直接定容。維生素A與β-胡蘿卜素分離：吸附劑：

8份中性Al2O3和2份堿性Al2O3混合，裝柱分離方法：a.用2%丙酮石油醚洗β-胡蘿卜素；

b.用乙醚洗VA。2.1.3計算SbCl3比色法維生素A／CHCl3＋SbCl3／CHCl3→形成蘭色物質→在620nm有最大吸光峰這種蘭色物質不穩定，很快褪色或變成其它物質，所以在分析時最好在暗室中進行，并且做標準曲線。計算：每百克樣品含VA的量=C×（V1/V2）×（100/W）C：從標準曲線上查得VA的量V1：CHCl3定容的量V2：測定所取樣液體積說明及討論（1）乙醚中是否含有過氧化物的檢驗方法（2）乙醇中是否含有醛的檢驗方法（3）三氯甲烷中是否含有分解產物2CHCl3+O22HCl+2CCl2O（4）所用氯仿不應含有水SbCl3+H2OSbOCl+2HCl（4）維生素A見光易分解，整個實驗應在暗處進行（5）由于三氯化銻與維生素A所產生的藍色物質不穩定，很快褪色或變成其它物質，所以在分析時最好在暗室中進行，并且做標準曲線。（6）三氯化銻腐蝕性較強，不能沾在皮膚上，用過的儀器應用鹽酸浸泡而后清洗。（7）本法適用于維生素A含量較高的樣品。紫外吸收光譜：分子價電子能級躍遷。波長范圍：100-800nm.(1)遠紫外光區:

100-200nm(2)近紫外光區:200-400nm(3)可見光區:400-800nm250300350400nm1234eλ可用于結構鑒定和定量分析。電子躍遷的同時，伴隨著振動轉動能級的躍遷;帶狀光譜。2測定方法

2.2紫外分光光度法

紫外吸收光譜的產生

Lamber-Beer定律：吸收光譜法基本定律描述物質對單色光吸收強弱與液層厚度和待測物濃度的關系假設一束平行單色光通過一個吸光物體

紫外分光光度法測定維生素A

原理：VA為脂溶性的，測定VA時必須先將樣品中的脂肪抽提出來進行皂化，萃取不皂化部分，在經柱層析除去雜質等干擾物質，在紫外328nm下測定，求出含量。二、維生素D

1.維生素D的性質維生素D是類固醇的衍生物，具有維生素D活性的物質約10余種，在功能上可以防治佝僂病。其中最主要的是維生素D2(麥角鈣化醇)和維生素D3(膽鈣醇)。

維生素D在魚肝油和雞蛋黃等食品中含量較多，一般成人不會缺VD，而嬰兒容易缺乏。2.測定方法2.1三氯化銻光度法原理：在三氯甲烷溶液中，維生素D與三氯化銻結合生成一種橙黃色化合物，并于500nm波長處有一個最大吸收，其呈色程度與維生素D含量成正比。

維生素D／CHCl3

＋SbCl3／CHCl3→形成橙黃色物質→500nm下測定

說明食品中維生素D含量一般較低，而其他維生素及物質含量大于維生素D，對測定產生干擾，測定前必須經柱層析除去這些物質。此法測定值為D2和D3的總量。2.2紫外分光光度法

VD／乙醇→265nm下測定

2.3高效液相色譜法（HPLC）基本原理：組分在固定相吸附劑上的吸附與解吸；適用于分離相對分子質量中等的油溶性試樣，對具有官能團的化合物和異構體有較高選擇性水溶性維生素的測定一、維生素B1的測定VB1又叫硫胺素1、食品中VB1的存在形式⑴常以游離態存在；⑵復合脂形式存在（磷蛋白）；⑶輔羧酶形式存在

VB1在酵母、米糠、麥胚、花生、黃豆以及綠色的蔬菜和牛乳、蛋黃中比較豐富，動物組織不如植物含量豐富。2、VB1的性質⑴VB1在中性、堿性下不穩定，易分解；⑵VB1在酸性條件下穩定，即使加熱酸性也穩定；⑶VB1為白色結晶，微溶于C2H5OH，不溶于乙醚或CHCl3，易溶于水。

3、VB1的測定

世界各國都用熒光法測定一、熒光與磷光的產生過程

1.分子能級與躍遷分子能級比原子能級復雜；在每個電子能級上，都存在振動、轉動能級；基態(S0)→激發態(S1、S2、激發態振動能級)：吸收特定頻率的輻射；量子化；躍遷一次到位；激發態→基態：多種途徑和方式(見能級圖)；速度最快、激發態壽命最短的途徑占優勢；第一、第二、…電子激發單重態S1、S2…

；第一、第二、…電子激發三重態T1、T2…

；S2S1S0T1吸收發射熒光發射磷光系間跨越內轉換振動弛豫能量l2l1l

3

外轉換l

2T2內轉換振動弛豫二、激發光譜與熒光(磷光)光譜

excitationspectrumandfluore-scencespectrum1.熒光(磷光)的激發光譜曲線固定測量波長(選最大發射波長),化合物發射的熒光(磷光)強度與照射光波長的關系曲線（圖中曲線I）。激發光譜曲線的最高處，處于激發態的分子最多，熒光強度最大；2.熒光光譜(或磷光光譜)

固定激發光波長(選最大激發波長),化合物發射的熒光(或磷光強度)與發射光波長關系曲線(圖中曲線II或III)。三、熒光的產生與分子結構的關系

1.分子產生熒光必須具備的條件（1）具有合適的結構；（2）具有一定的熒光量子產率。熒光量子產率（）：2.定量依據與方法(1)定量依據

熒光強度

If正比于吸收的光量Ia和熒光量子效率：

If=Ia由朗-比耳定律：Ia=I0(1-10-lc)If=I0(1-10-lc)=I0(1-e-2.3lc)濃度很低時，將括號項近似處理后：

If

=2.3I0lc

=Kc（2）定量方法標準曲線法：配制一系列標準濃度試樣測定熒光強度，繪制標準曲線，再在相同條件下測量未知試樣的熒光強度，在標準曲線上求出濃度VB1的測定原理：硫胺素在堿性鐵氰化鉀溶液中，被氧化成一種蘭色熒光物質，即為硫色素，在紫外光下，硫色素發出熒光。二、維生素B2的測定（1）VB2的特性（PropertiesofVB2）①對熱穩定，對酸和中性pH也穩定,在120℃加熱6h僅少量破壞。②在堿性條件下迅速分解。③在光照下轉變為光黃素和光色素,并產生自由基,破壞其它營養成分產生異味,如牛奶的日光臭味即由此產生。三、維生素C的測定

維生素C是一種已糖醛基酸，有抗壞血病的作用，所以被人們稱做抗壞血酸，主要為還原型及脫氫型兩種，廣泛存在于植物組織中，新鮮的水果、蔬菜，特別是棗、辣椒、苦瓜、柿子葉、獼猴桃、柑橘等食品中含量較多。它是氧化還原酶之一，本身易被氧化，但在有些條件下又是一種抗氧化劑。維生素C（還原型）純品為白色無臭結晶，熔點190～192℃，溶于水或乙醇中，不溶于油劑。在水溶液中易被氧化，在堿性條件下易分解，在弱酸條件中較穩定，維生素C開始氧化為脫氫型抗壞血酸（有生理作用）。如果進一步水解則生成2，3-二酮古樂糖酸，失去生理作用。根據它具有的還原性質可以測定維生素C的含量。常用的測定方法有（1）2，6-二氯靛酚法

（還原型VC）（2）2，4-二硝基苯肼法

（總VC）（3）碘酸法（4）碘量法（5）熒光法

1.2，6-二氯靛酚滴定法

1、原理：還原型抗壞血酸還原染料2，6-二氯靛酚，該染料在酸性中呈紅色，被還原后紅色消失。還原型抗壞血酸還原2，6-二氯靛酚后，本身被氧化成脫氫抗壞血酸。

在沒有雜質干擾時，一定量的樣品提取液還原標準2，6-二氯靛酚的量與樣品中所含維生素C的量成正比。

注意事項

⑴所有試劑的配制最好都用重蒸餾水；⑵滴定時，可同時吸二個樣品。一個滴定，另一個作為觀察顏色變化的參考；⑶樣品進入實驗室后，應浸泡在已知量的2%草酸液中，以防氧化，