真菌鑒定操作常規標本的采集和處理1.皮膚、指甲、毛發和組織在收集標本前用75%酒精消毒病變部位。如果損害處已用了軟膏、冷霜或粉劑應事先清潔。取材應用鈍手術刀刮取表皮皮屑，或用透明膠帶粘取皮屑直接移至載玻片上，水皰取皰壁組織，膿皰則取膿液。皮膚粘膜交界處或菲薄的皮膚部位如龜頭、大陰唇、口周、肛周等處以浸有生理鹽水的濕棉拭子，檫拭局部后送檢。指甲標本應取變色、萎縮或變脆的部位，以鈍手術刀刮除表層，采集病甲邊緣下病甲置載玻片上，滴封固液，微加熱，使甲溶解。毛發標本應取無光澤、脆而松動，根部折斷的毛發。毛發置載玻片滴加10%KOH溶液，微加熱使角質溶解。組織取病變部位，置無菌生理鹽水中送檢。以無菌鑷子和剪刀剪碎后進行培養或鏡檢，避免使用組織研磨器對真菌菌絲的折斷及機械性損害皮膚、指甲、毛發和組織標本一般采用直接鏡檢。2．眼、耳部標本懷疑真菌性角膜炎時，應在手術顯微鏡下以眼科小匙刮取潰瘍的基底和邊緣部位。懷疑真菌性內眼炎時，應盡可能收集玻璃體液。結膜標本可用消毒生理鹽水浸濕的棉拭子拭取。耳部標本應從耳道中刮屑取材，也可采用拭子取材。3．腦脊液標本取3-5ml經腰穿獲取的腦脊液標本至無菌管內立即送檢。將標本2500rpm離心15分鐘，上清液可用于血清學實驗，沉淀部分用于培養和涂片鏡檢。4．血液、骨髓標本抽取5－10毫升血液或骨髓注入需氧菌血培養瓶中，盡快送檢。如血培養儀器報告陽性，及時取樣接種于沙氏培養基并涂片革蘭染色鏡檢，如發現真菌孢子報告病房并登記。5．體液（包括胸腔、腹腔及關節腔積液）：將無菌抽取胸水、腹水和關節腔液及時送檢。標本放無菌離心管中，2500rpm離心10分鐘，取沉渣培養或涂片鏡檢。6．尿液將清洗外陰后留取的中段尿，或經導尿管導出的中段尿，或經皮膀胱穿刺尿立即送檢。尿標本應先2500rpm離心10分鐘，取沉淀部分進行培養及涂片鏡檢。7．陰道分泌物或男性尿道標本女性由婦科醫師用窺器取陰道或宮頸的偽膜或豆渣樣凝塊。男性則以尿道拭子伸入尿道2.5cm處旋轉取出盡可能多的尿道脫落細胞及分泌物，立即送檢。8．呼吸道標本（咳出痰、誘導痰、氣管吸痰、支氣管肺泡灌洗液、肺組織）取清晨新鮮咳出的痰，如病人不能咳痰，可用支氣管鹽水誘導咳痰，插管病人采用氣管吸出痰，必要時在纖維支氣管鏡檢的同時獲取支氣管肺泡灌洗液或支氣管毛刷標本。對于局灶性肺部病變，高度懷疑肺部真菌感染的患者可經皮穿刺，在影像學指導下獲取病變部位的肺組織。9．膿液或潰瘍、竇道、瘺管等標本用75%酒精消毒病變部位后刮取膿液，竇道壁及周圍盡可能深的部位，若膿腫未破，應以無菌注射器抽出膿液送檢。注意尋找并收集膿液中或竇道開口部位的顆粒送檢。10．大便留取新鮮大便，盡快送檢。收到標本后，應根據申請項目將檢驗信息錄入計算機并獲取檢驗號記錄在申請單上二、真菌的顯微鏡檢查：1．直接檢查：將待檢標本（皮膚、甲屑、毛發或組織）置載玻片上，加一滴載液（根據不同需要選用相應載液），蓋上蓋玻片，放置片刻或在火焰上快速通過2-3次（不可煮沸），輕壓蓋玻片，驅逐氣泡并將標本壓薄，用吸紙吸去周圍溢液，置顯微鏡下鏡檢。檢查時先在低倍鏡下檢查有無菌絲和孢子，然后用高倍鏡觀察菌絲和孢子的形態、特征、位置、大小和排列。結果報告依據鏡下情況報：“找到真菌孢子”或者“找到真菌菌絲”或者“找到真菌菌絲及孢子”。如未找到真菌孢子及菌絲報告“未找到真菌”。注意：毛發標本不可過度施壓以免破壞毛發的結構而影響對菌絲孢子與毛干相對位置關系的判斷。載液：=1\*GB3①生理鹽水：用于稀釋標本；=2\*GB3②KOH液：可溶解角蛋白并能清除標本中的膿細胞及其他成分而不破壞菌絲和孢子。一般采用10%-20%溶液。甲屑、毛發等角質厚的標本可用20%溶液；=3\*GB3③乳酸酚棉藍染色液：可使真菌染成藍色，鏡下易于分辨。絲狀真菌直接鏡檢也使用此載液。2．涂片染色鏡檢：將標本或菌液均勻涂于載玻片上（必要時加生理鹽水或KOH液），火焰固定，革蘭氏染色（或其他特殊染色），鏡檢。如發現真菌報“找到（圓形或卵圓形）真菌孢子（及假菌絲）”。如未找到真菌孢子及假菌絲報告“未找到真菌”。3．墨汁涂片：用于檢查新型隱球菌和其他有莢膜的真菌孢子。以優質繪圖用黑墨汁少許置載玻片上，加腦脊液沉渣，加蓋玻片。稍待2-3分鐘，用顯微鏡先低倍再高倍鏡檢查；如發現帶莢膜真菌孢子，報告“找到隱球菌”。如未找到帶莢膜真菌孢子報告“未找到隱球菌”。三、真菌的分離培養：病原真菌除鼻孢子菌和鏈狀芽生菌外，大多數都可人工培養。1．平板培養法：分區劃線：呼吸道、膿、血液、體液等標本使用此法培養。用接種環挑取適量標本，在沙氏培養基上分區劃線，一般分2-3區。置25℃培養，有真菌生長及時鑒定，5天無菌生長報告“真菌培養未生長”2．試管培養法：=1\*GB3①直接種植：皮膚、指甲、毛發和組織使用此法培養。用無菌鑷子夾取待檢標本點種在2根沙氏斜面上，可等距離點種幾塊標本。置25℃和37℃培養，有真菌生長及時鑒定，14天無菌生長報告“真菌培養未生長”。=2\*GB3②腦脊液離心后的腦脊液用接種環接種2根沙氏斜面上，分別置25℃和37℃。有真菌生及時鑒定，14天無菌生長報告“真菌培養未生長”。在沙氏瓊脂斜面上菌落初為白色、奶油狀，時間長顏色漸變為淡褐色。有的菌株有粘液化趨勢，甚至似鼻涕樣流向直立的斜面下部。培養物墨汁涂片，不易見莢膜，即使有莢膜也較小。注意：標本應至少接種2支沙氏瓊脂斜面，分置于25℃及37不長方可報告陰性。新型隱球菌在上述兩種溫度下皆可生長，某些非致病隱球菌只在25℃或30℃生長，卻不能在37℃生長。但初代培養在25℃生長而于3．玻片培養法（小培養）：=1\*GB3①取無菌平皿倒入適量溶化的培養基（厚約1mm），凝固后以無菌刀片劃成1cm2大小的小塊。取一小塊移在無菌載片上，在小塊四周接種待鑒定的菌株，蓋上消毒的蓋片。放入無菌平皿中的V形玻棒上，底部鋪上無菌濾紙，濾紙以無菌蒸餾水濕潤（也可用無菌濕棉球替代濾紙保濕）。將平皿置溫箱培養。也可以在無菌載片上均勻地澆上溶化的培養基，凝固后接種待鑒定菌株，蓋無菌蓋片，其余同上。=2\*GB3②待菌落生長后，取出載片直接鏡檢。也可揭下蓋片加95%酒精脫水，干后滴PVA乳酸酚棉藍液封固，鏡檢。四、酵母樣真菌的鑒定酵母樣真菌是以芽殖為主的單細胞真菌，菌落平滑、濕潤，乳酪樣或薄膜樣，無毛樣氣生菌絲。其中主要致病菌見于念珠菌屬、隱球菌屬、球擬酵母屬、酵母屬和絲孢酵母屬。按是否具有有性繁殖過程及有性孢子產生的方式、特點、形狀和數目，酵母菌可歸為3類：1.子囊菌亞門(Ascomycotina)：可產生子囊孢子，如酵母屬、漢遜酵母屬、裂殖酵母屬；2.擔子菌亞門(Basidiomycotina):可產生冬孢子或擲孢子，如冬孢酵母屬、擲孢酵母屬等；3.半知菌類(Derteromycotina)：尚未發現有性期，如念珠菌屬、隱球菌屬、紅酵母屬、球擬酵母屬、絲孢酵母屬等。（一）念珠菌屬（Candida）的鑒定：1.涂片檢查革蘭染色鏡檢可見圓形或卵圓形芽生孢子，一般為念珠菌。亦有從孢子的芽延長而成假菌絲者。有大量假菌絲存在說明念珠菌處于生長活躍狀態。大小約3-7×3-14μm不等，單個、成堆或呈短鏈排列。孢子及菌絲皆為革蘭陽性，呈紫色。但有時著色不均，有時少數呈革蘭陰性。可報告“找到（圓形或卵圓形）真菌孢子（及假菌絲）”。2．分離培養沙氏平板或斜面以及中國藍平板上有酵母樣菌落長出后，采用以下方法鑒定：=1\*GB3①形態學方法：接種顯色培養基（37℃培養）和玉米粉-吐溫80培養基（25℃培養），根據菌落形態、顯色特征和假菌絲特征鑒定菌種。其中，顯色培養上生長綠色菌落為白色念珠菌，藍色菌落為熱帶念珠菌，粉紅干燥菌落為克柔念珠菌，紫色=2\*GB3②生化方法：形態學無法鑒定的菌種可使用VitekYST鑒定卡以及API20C生化鑒定系統鑒定。操作方法見該產品使用說明書。（二）隱球菌屬（Cryptococcus）的鑒定：隱球菌較念珠菌少見，但由新型隱球菌引起的腦膜炎卻是一種嚴重的疾病。該菌存在于鴿糞、土壤、腐爛的水果中，亦見于動物和人體。主要侵犯中樞神經系統，也可以侵及肺、骨、皮膚，甚至引起敗血癥。其他隱球菌也可引起嚴重的臨床感染。1.鏡下特征：=1\*GB3①直接鏡檢：標本一般為腦脊液、痰或其他分泌物。鏡下可見圓形5-12-20μm直徑之厚壁芽生孢子，一般少有假菌絲；=2\*GB3②革蘭染色：為革蘭陽性圓形芽生真菌孢子。注意勿將其誤作染料小滴。=3\*GB3③墨汁染色：如有新型隱球菌，在黑色背景下可見圓形孢子，其周圍繞以透光的厚莢膜，厚度可與菌體直徑相當。菌體的大小和莢膜的寬窄在同一張片子上可有較大不同。有時可看到出芽的孢子。注意切勿將淋巴細胞誤認為新型隱球菌。新型隱球菌在墨汁涂片中的形態可歸納為：●圓形或卵圓形的孢子，胞壁厚，邊緣清晰，用微調節觀察似有雙圈；●孢子周圍有透亮的厚莢膜，孢子與莢膜之間的界限和莢膜的外緣都非常整齊、清楚；●孢子內有反光顆粒；●有的孢子有芽生出，且芽頸甚細。注意：任何圓形物體邊緣模糊，內部無反光顆粒，外部有較窄、內外界線不清的透亮環者，不是隱球菌。但應注意新型隱球菌以外的其他隱球菌也有莢膜。2.生化鑒定：使用VitekYST鑒定卡以及API20C生化鑒定系統，方法見相應產品使用說明書。隱球菌對糖無發酵能力，菌種鑒定依賴于同化試驗及其他生化反應。其中尿素酶陽性，而常見念珠菌中絕大多數為陰性，僅解脂念珠菌和部分克柔念珠菌尿素酶陽性。隱球菌中僅新型隱球菌酚氧化酶試驗陽性，其他隱球菌陰性。常見隱球菌的生化特性見表3。（三）其他酵母菌的鑒定：盡管臨床標本中分離出的致病酵母菌主要是念珠菌屬及新型隱球菌，但其他酵母菌也可引起嚴重感染。如絲孢酵母屬、球擬酵母屬、漢遜酵母屬、紅酵母屬、畢赤酵母屬等。如標本取自正常無菌部位（如血液、胸腹水等）應根據其形態學特征或者使用VitekYST鑒定卡鑒定到種。鑒定步驟見表1、表2及表3。表1.不常見酵母菌鑒定程序表純培養1%Tween80玉米粉瓊脂(25℃假菌絲（＋）（—）(－)關節菌絲(＋)(＋)色素(－)念珠菌屬芽生孢子尿素酶莢膜(＋)(－)芽管及厚膜胞子(－)（＋）(＋)(－)隱球菌屬酚氧化酶子囊孢子37℃生長(＋)(－)(－)(＋)其白絲地紅新其球酵漢他念孢霉酵型他擬母遜念珠酵菌母隱隱酵屬酵珠菌母屬屬球球母母菌屬菌菌屬屬表2．臨床可見到的酵母菌各屬特性菌種在玉米粉吐溫80瓊脂上25子囊孢子孢子囊芽管莢膜生長假菌絲真菌絲沿菌絲芽生孢子關節孢子環痕分生孢子厚膜孢子含放線菌酮25在沙氏瓊脂37在沙氏肉湯芽裂殖酵母屬Blastoschizomyces+++OV+OOOOO++膜樣白念珠菌Candidaalbicans+少+OO+OO+O++NSG其他念珠菌OtherCandidaspp.+V少+OOOOVOOOV+V某些種表面生長隱球菌屬CryptococcusOOOOOOOO+OVNSG地霉屬GeotrichumO+O+OOOOOOOOW膜樣漢遜酵母屬HansenulaOVOOOO+OOOOVNSG無綠藻ProtothecaOOOOOO+OOVO+V表面生長紅酵母屬RhodotorulaOROOOOOOOVOV+VNSG酵母屬SaccharomycesVOOOO+OOOO+NSG球擬酵母屬TorulopsisOOOOOOOOOO+NSG絲孢酵母屬Trichosporon++++OOOOOO+V+V膜樣+：陽性；O：陰性；V：菌種或菌株變異；W：弱；R：極偶見發育不全的形態；NSG：無表面生長。表3.臨床標本中常見酵母菌生化反應菌種同化試驗尿素酶硝酸鉀酚氧化酶葡萄糖麥芽糖蔗糖乳糖半乳糖蜜二糖纖維二糖肌醇木糖棉子糖海藻糖衛矛醇白念珠菌Candidaalbicans+++*+++鏈狀念珠菌C.catenulata++++季也蒙念珠菌C.guilliermondii++++++++++乳酒念珠菌C.Kefyr+++++*+*+*克柔念珠菌C.krusei++*朗比念珠菌C.lambica++解脂念珠菌C.lipolytica++葡萄牙念珠菌C.lusitaniae+++++++近平滑念珠菌C.parapsilosis++++++皺落念珠菌C.rugosa+++*熱帶念珠菌C.tropicalis+++++++涎沫念珠菌C.zeylanoides+**+光滑念珠菌C.glabrata++白球擬酵母T.candida++++*+++++++*平托球擬酵母T.pintolopesii+新型隱球菌Cryptococcusneoformans++++++++*++++淺白隱球菌C.albidus++++*+*+++++++*++羅倫特隱球菌C.laurentii++++++*++++*+++淺黃隱球菌C.luteolus++++++++++++地生隱球菌C.terreus++*+*+*++++*++指甲隱球菌C.uniguttulatus+++**+++**+粘紅酵母Rhodotorulaglutinis++++*++++++深紅酵母R.rubra+++++*++++釀酒酵母Saccharomycescerevisiae++++++*異常漢遜酵母Hansenulaanomala++++++++白吉利絲孢酵母T。beigelii+++++*+*+*+++*+*+*+*茁芽絲孢酵母T.pullulans++++*++*++*+*+*+++白地霉Geotrichumcandidum+++頭狀芽裂殖酵母B。capitatus++小型無綠藻Protothecawickerhamii++++：陽性；–：陰性；*：菌種或菌株變異五、酵母菌的藥敏試驗（紙片擴散法）1．美藍儲存液：0.1g美藍加入20ml無菌水2．培養基：含2％葡萄糖和0.5μg/ml美藍的M-H瓊脂在1000mlM-H瓊脂中，加入100μl美藍儲存液和20g葡萄糖，121℃15分鐘高壓滅菌，水浴55℃倒實驗方法：制備菌液：挑取新鮮菌落至適量無菌水中，搖勻成菌懸液。將濁度調致0