ICS11220

B41.

中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)

GB/T27639—2011

結(jié)核病病原菌實時熒光PCR檢測方法

Real-timePCRmethodforthedetectionoftuberculosispathogenicorganisms

2011-12-30發(fā)布2012-04-01實施

中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局發(fā)布

中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會

GB/T27639—2011

前言

本標(biāo)準(zhǔn)按照給出的規(guī)則起草

GB/T1.1—2009。

本標(biāo)準(zhǔn)由全國動物防疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口

(SAC/TC181)。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位中華人民共和國廣東出入境檢驗檢疫局華中農(nóng)業(yè)大學(xué)中國檢驗檢疫科學(xué)研究

:、、

院北京盈九思科技發(fā)展有限公司

、。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人陳茹劉中勇楊國海郭愛珍曾碧健韓雪清高小博林祥梅吳曉薇

:、、、、、、、、。

Ⅰ

GB/T27639—2011

結(jié)核病病原菌實時熒光PCR檢測方法

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群結(jié)核分枝桿菌牛分枝桿菌實時熒光檢測方法的技術(shù)要

、、PCR

求和操作規(guī)范

。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于快速檢測細(xì)菌培養(yǎng)物血樣奶樣痰液組織器官糞便等臨床樣品中結(jié)核分枝桿菌

、、、、、

復(fù)合群結(jié)核分枝桿菌牛分枝桿菌

、、。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的凡是注日期的引用文件僅注日期的版本適用于本文

。,

件凡是不注日期的引用文件其最新版本包括所有的修改單適用于本文件

。,()。

分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

GB/T6682—2008

實驗室生物安全通用要求

GB19489—2008

3縮略語

下列縮略語適用于本文件

。

值熒光信號量達(dá)到設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)

Ct:。

脫氧核苷三磷酸

dNTP:deoxyribonucleosidetriphosphate,。

二甲基亞砜

DMSO:dimethylsulfoxide,。

乙二胺四乙酸

EDTA:ethylenediaminetetraaceticacid,。

磷酸鹽緩沖液

PBS:phosphatebuffersolution,。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

PCR:polymerasechainreaction,。

酶聚合酶

Taq:TaqDNA。

酶尿嘧啶糖基化酶

UDG:uracilDNAglycosylase,DNA。

4原理

本標(biāo)準(zhǔn)方法采用了探針實時熒光技術(shù)原理反應(yīng)體系中包括一對用于擴(kuò)增

TaqManPCR。DNA

的引物和一條能與產(chǎn)物特異雜交的熒光標(biāo)記探針探針的端標(biāo)記了被稱為報告基團(tuán)的熒光

,PCR。5’

素端標(biāo)記了淬滅基團(tuán)在進(jìn)行延伸反應(yīng)時酶的外切酶活性將端熒光基團(tuán)從探針上

,3’。PCR,Taq5’5’

切割下來使其與淬滅基團(tuán)分離從而儀器能檢測到端熒光基團(tuán)所發(fā)出的熒光信號一分子擴(kuò)

,,5’,PCR

增產(chǎn)物的生成伴隨一分子熒光信號的產(chǎn)生隨著擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)的增加儀器檢測到的熒光信號的累積

。,

反應(yīng)了擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化

。

本標(biāo)準(zhǔn)提供特異檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌共四套實時熒光檢測

、PCR

方法見表其中結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群特異的實時熒光方法分別以插入基因

(1)。,PCRIS6110、IS1081

序列為模板設(shè)計特異擴(kuò)增引物與探針結(jié)核分枝桿菌牛分枝桿菌特異的實時熒光方法分別以菌