1.“分子手術刀”是_______________，主要來源于_________________。經限制酶切割產生的DNA片段末端通常有兩種形式：________和_____

_。2.“分子縫合針”是__________，分為兩類：

和

。3.“分子運輸車”是__________，種類：_______________、____________________、_________________。4.載體具備的條件①能夠在宿主細胞中______________并穩定保存。②有一個或多個___________切割位點，供外源基因插入。③具有特殊的________________________，共重組DNA的鑒定和選擇。

④對受體細胞

。5.—GAATTC——CTTAAG—被切割后形成的片段是：

和

。基因工程的基本操作程序餐前小菜原核細胞的基因結構(補充內容）非編碼區非編碼區編碼區編碼區上游編碼區下游與RNA聚合酶結合位點啟動子終止子①不編碼蛋白質。：編碼蛋白質,連續不間斷編碼區非編碼區原核細胞的基因結構②調控遺傳信息表達,上游有啟動子，下游有終止子真核細胞的基因結構（補充內容）編碼區非編碼區非編碼區與RNA聚合酶結合位點內含子外顯子啟動子終止子編碼區上游編碼區下游真核細胞的基因結構編碼區非編碼區外顯子：能編碼蛋白質的序列內含子：不能編碼蛋白質的序列：有調控作用,上游有啟動子，下游有終止子非編碼序列：包括非編碼區和內含子原核細胞與真核細胞的基因結構比較連續不連續編碼區非編碼餐前小菜味道如何？思考：啟動子與起始密碼子，終止子與終止密碼子是否相同，如不同有何區別？啟動子、終止子：在

上，分別表示

的開始與結束起始密碼子、終止密碼子：在

上，分別表示

的開始與結束轉錄翻譯DNARNA正餐開始。。。基因工程的基本操作程序1、目的基因的獲取2、基因表達載體的構建3、將目的基因導入受體細胞4、目的基因的檢測與鑒定一、目的基因的獲取1、目的基因主要是指______________________編碼蛋白質的基因，也可以是一些具有調控作用的因子。2、獲取目的基因的常用方法（1）從基因文庫中獲取（2）利用PCR技術擴增（3）人工合成(1)從基因文庫中獲取目的基因1、什么是基因文庫？2、什么是基因組文庫？3、什么是部分基因文庫？4、怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因？5、目的基因的有關信息與什么相聯系？閱讀課本第9頁的相關內容，回答以下問題自主學習(1)從基因文庫中獲取目的基因2、什么是基因組文庫？3、什么是部分基因文庫？4、怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因？5、目的基因的有關信息與什么相聯系？閱讀課本9頁的相關內容，回答一下問題自主學習

基因文庫：將含有某種生物不同基因的許多DNA片段,導入受體菌的群體中儲存,各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因,稱為基因文庫(genelibrary)(1)從基因文庫中獲取目的基因3、什么是部分基因文庫？4、怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因？5、目的基因的有關信息與什么相聯系？閱讀課本9頁的相關內容，回答一下問題自主學習

基因文庫：將含有某種生物不同基因的許多DNA片段,導入受體菌的群體中儲存,各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因,稱為基因文庫(genelibrary)基因組文庫：基因文庫中包含了一種生物所有的基因,這種基因文庫叫做基因組文庫(1)從基因文庫中獲取目的基因4、怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因？5、目的基因的有關信息與什么相聯系？閱讀課本9頁的相關內容，回答一下問題自主學習

基因文庫：將含有某種生物不同基因的許多DNA片段,導入受體菌的群體中儲存,各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因,稱為基因文庫(genelibrary)基因組文庫：基因文庫中包含了一種生物所有的基因,這種基因文庫叫做基因組文庫部分基因組文庫：基因文庫中包含了一種生物的一部分基因,這種基因文庫叫做部分基因文庫.（如cDNA文庫）基因組文庫與部分基因文庫的關系閱讀課本P10生物技術資料卡

提出你的疑問？提取某種生物的某器官或特定發育時期的mRNA單鏈DNA雙鏈cDNA片段重組載體與載體連接cDNA文庫反（逆）轉錄酶DNA聚合酶導入受體菌中儲存cDNA文庫的構建-----反（逆）轉錄法：

基因組文庫和cDNA文庫的比較小大無有無有某種生物的部分基因某種生物的全部基因可以部分基因可以①概念：PCR全稱為_______________，是一項在生物____復制___________的核酸合成技術③前提：_______________________②原理：__________④方式：以_____方式擴增，即____（n為擴增循環的次數）聚合酶鏈式反應體外特定DNA片段DNA雙鏈復制指數2n要有一段已知目的基因的核苷酸序列自主學習閱讀課本P10-P11頁的相關內容，回答一下問題（2）利用PCR技術擴增目的基因⑤過程：

過程高溫變性（解旋為單鏈）低溫退火（引物與單鏈互補結合）適溫延伸（在Taq酶的作用下合成與模板互補的DNA雙鏈）重復循環進一步思考：在這個過程中都需要什么條件？模板DNA；四種脫氧核苷酸；熱穩定DNA聚合酶（Taq酶）；能量；DNA引物；具體過程PCR技術擴增與DNA復制的比較堿基互補配對四種脫氧核苷酸模板、能量、酶、原料、引物DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化體外復制主要細胞核內熱穩定的DNA聚合酶細胞內的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整個DNA分子目的基因的mRNA單鏈DNA(cDNA）雙鏈DNA(即目的基因)反轉錄合成1）反轉錄法：

以目的基因轉錄成的信使RNA為模板，反轉錄成互補的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。蛋白質的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結構基因的核苷酸序列目的基因推測推測化學合成2）根據已知的氨基酸序列合成DNA法：（3）、人工合成的目的基因牛刀小試《同步練習冊》P6基礎鞏固1、3從前你要擴增DNA，

總有培養大批細胞的重任要你背。

這時有個家伙叫KaryMullis博士的，

他鉆出來說體外合成也一樣OK！

只要把你的模板混上緩沖液，再加些引物，

還有核苷和聚合酶。

變性，退火，和延伸。

加熱~冷卻~加熱~太神奇了！

當你想要檢測突變，來啊做PCR吧！

當你想要基因重組，來啊做PCR吧！

當你想知道孩子他爹到底是誰，來啊做PCR吧！

當你想要偵破大案，來啊做PCR吧！二、基因表達載體的構建——核心問題1．為何要構建基因表達載體？

問題2．作為基因工程表達載體，只需含有目的基因就可以完成任務嗎？為什么？問題3．基因表達載體的構建需要哪些工具酶，如何將目的基因與運載體連接起來形成重組DNA分子（以質粒為運載體）？問題4．將目的基因與載體混合并用DNA連接酶處理后，會出現幾種結果，怎樣從中篩選處所需要重組質粒？

小組討論：a、使目的基因在受體細胞中穩定存在并遺傳給子代b、同時使目的基因能表達和發揮作用問題2：作為基因工程表達載體，只需含有目的基因就可以完成任務嗎？為什么？二、基因表達載體的構建——核心問題1：為何要構建基因表達載體？1.基因表達載體的作用：2.基因表達載體的組成：它們有什么作用？a、目的基因b、啟動子c、終止子d、標記基因位于基因的首端,是mRNA聚合酶結合位點位于基因的尾端,終止轉錄檢測目的基因是否導入受體細胞問題3：基因表達載體的構建需要哪些工具酶？如何將目的基因與運載體結合起來形成重組DNA分子（以質粒為運載體）？工具酶：限制酶、DNA連接酶質粒目的基因限制酶處理一個切口兩個黏性末端兩個切口獲得目的基因DNA連接酶表達載體同種過程:問題4：將目的基因與載體混合并用DNA連接酶處理后，會出現幾種結果，怎樣從中篩選處所需要重組質粒？

目的基因-目的基因連接物目的基因-載體連接物載體-載體連接物例1．圖為某種質粒表達載體簡圖，小箭頭所指分別為限制性內切酶EcoRI、BamHI的酶切位點，ampR為青霉素抗性基因，tetR為四環素抗性基因，P為啟動子，T為終止子，ori為復制原點。已知目的基因的兩端分別有包括EcoRI、BamHI在內的多種酶的酶切位點。據圖回答：（1）將含有目的基因的DNA與質粒表達載體分別用EcoRI酶切，酶切產物用DNA連接酶進行連接后，其中由兩個DNA片段之間連接形成的產物有_______________、_______________、_______________三種。若要從這些連接產物中分離出重組質粒，需要對這些連接產物進行_______________。（2）用上述3種連接產物與無任何抗藥性的原核宿主細胞進行轉化實驗。之后將這些宿主細胞接種到含四環素的培養基中，能生長的原核宿主細胞所含有的連接產物是_______________；若接種到含青霉素的培養基中，能生長的原核宿主細胞所含有的連接產物是___________

____。（3）目的基因表達時，RNA聚合酶識別和結合的位點是___________，其合成的產物是___________。（4）在上述實驗中，為了防止目的基因和質粒表達載體在酶切后產生的末端發生任意連接，酶切時應選用的酶是_______________。

分離純化載體-載體連接物目的基因-載體連接物、載體-載體連接物啟動子mRNAEcoRI和BamHI目的基因-目的基因連接物目的基因-載體連接物載體-載體連接物①載體與表達載體的區別：二者都有標記基因和復制原點兩部分DNA片段。表達載體在載體基礎上增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結構②用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學鍵都是磷酸二酯鍵③啟動子、終止子對于目的基因表達必不可少④目的基因不能單獨進入受體細胞，必需以表達載體的方式攜帶進去。注意轉化

——方法將目的基因導入植物細胞將目的基因導入動物細胞將目的基因導入微生物細胞農桿菌轉化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——用Ca+處理細胞目的基因進入_________內，并且在受體細胞內維持

和

的過程受體細胞穩定表達步驟三：將目的基因導入受體細胞1、將目的基因導入植物細胞（1）農桿菌轉化法特點:能感染雙子葉植物和祼子植物,對單子葉植物無感染能力Ti質粒的T—DNA可轉移至受體細胞并整合到其染色體上轉化過程:Ti質粒目的基因構建表達載體導入植物細胞插入植物細胞染色DNA表達新性狀轉入農桿菌（2）基因槍法（成本高）（3）花粉管通道法2、將目的基因導入動物細胞①方法：顯微注射法②程序：目的基因表達載體提純取卵（受精卵）顯微注射受精卵移植到子宮或輸卵管受精卵發育新性狀動物受體細胞是什么？為什么采用受精卵？體積大，易操作；全能性高3、將目的基因導入微生物細胞常用法：Ca2+處理常用菌：大腸桿菌微生物作受體細胞原因：繁殖快、多為單細胞、遺傳物質相對少過程：Ca2+處理大腸桿菌感受態細胞表達載體與感受態細胞混合感受態細胞吸收DNACa2+處理：可增大細胞壁的通透性，使重組質粒能夠導入到受體細胞將目的基因導入受體細胞中的方法的比較農桿菌轉化法,基因槍法，花粉管通道法顯微注射法Ca2＋處理法體細胞受精卵原核細胞目的基因插入Ti質粒的T-DNA上→農桿菌→導入植物細胞→整合到受體細胞的染色體DNA→表達目的基因表達載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發育→獲得具有新性狀的動物Ca2＋處理細胞→感受態細胞→重組表達載體與感受態細胞混合→感受態細胞吸收DNA分子(四)目的基因的檢測與鑒定檢測①導入檢測：目的基因是否導入受體細胞方法——DNA分子雜交知識延伸——DNA分子雜交技術

該方法是根據堿基互補配對原則，把互補的雙鏈DNA解開，把單股的DNA小片段用同位素、熒光分子或化學發光催化劑等進行標記，之后同被檢測的DNA中的同源互補序列雜交，從而檢出所要查明的DNA或基因。返回(四)目的基因的檢測與鑒定檢測①導入檢測：目的基因是否導入受體細胞方法——DNA分子雜交②表達檢測轉錄檢測——分子雜交翻譯檢測——抗原-抗體雜交2、檢測目的基因是否轉錄出了mRNA3、檢測目的基因是否翻譯成蛋白質①方法:分子雜交方法:抗原-抗體雜交②過程:

用上述探針和轉基因生物的mRNA雜交,若出現雜交帶,表明目的基因轉錄出了mRNA(四)目的基因的檢測與鑒定檢測①導入檢測：目的基因是否導入受體細胞方法——DNA分子雜交②表達檢測轉錄檢測——分子雜交翻譯檢測——抗原-抗體雜交分子檢測法鑒定抗蟲鑒定抗