第五章紫外可見分光光度法

UltravioletandVisible(UV-Vis)Spectrophotometry

1第五章紫外可見分光光度法第一節(jié)分子吸收光譜概述；第二節(jié)

光吸收基本定律；第三節(jié)儀器部件及其類型；第四節(jié)顯色反應及其影響因素第五節(jié)定性分析和定量分析方法及其應用。25.1概述一、分子吸收光譜的形成1.過程：運動的分子外層電子--------吸收外來輻射------產(chǎn)生電子能級躍遷-----分子吸收譜。2.能級組成：除了電子能級(Electronenergylevel)外，分子吸收能量將伴隨著分子的振動和轉(zhuǎn)動，即同時將發(fā)生振動(Vibration)能級和轉(zhuǎn)動(Rotation)能級的躍遷！據(jù)量子力學理論，分子的振-轉(zhuǎn)躍遷也是量子化的或者說將產(chǎn)生非連續(xù)譜。34分子的三種能級躍遷示意圖

分子吸收外來輻射能后，其能量改變（ΔE）為：ΔE=ΔEe+ΔEv+ΔEr對多數(shù)分子而言，ΔEe

（電子）約為1-20ev，紫外可見ΔEv

（振動）約為0.05-1ev，近紅外、中紅外區(qū)ΔEr

（轉(zhuǎn)動）小于0.05ev，遠紅外、微波區(qū)ΔEe>ΔEv>ΔEr5二、物質(zhì)對光的選擇性吸收●物質(zhì)的顏色由物質(zhì)與光的相互作用方式?jīng)Q定。●人眼能感覺到的光稱可見光，波長范圍是：400~760nm。●讓白光通過棱鏡，能色散出紅、橙、黃、綠、藍、紫等各色光。●單色光：單一波長的光●復合光：由不同波長的光組合而成的光，如白光。●光的互補：若兩種不同顏色的單色光按一定比例混合得到白光，

稱這兩種單色光為互補色光，這種現(xiàn)象稱為光的互補。6分子吸收現(xiàn)象CuSO4溶液吸收黃色光,其溶液呈現(xiàn)出藍色；KMnO4分子強烈地吸黃綠色光，對其他顏色的光吸收很少或不吸收，溶液呈紫紅色。問題：Na2SO4溶液無色透明,其分子吸光情況?

CuS(固態(tài))呈黑色，其分子吸光又如何？700nm530nm420nm580nm470nm620nm7物質(zhì)的顏色：是由于物質(zhì)對不同波長的光具有選擇性吸收而產(chǎn)生。

即物質(zhì)的顏色是它所吸收光的互補色。無色溶液：透過所有顏色的光有色溶液：透過光的顏色黑色：吸收所有顏色的光白色：反射所有顏色的光物質(zhì)的本色8

基于物質(zhì)吸收紫外或可見光引起分子中價電子躍遷、產(chǎn)生分子吸收光譜與物質(zhì)組分之間的關(guān)系建立起來的分析方法，稱為紫外-可見吸光光度法（UV-vis）三、紫外-可見吸光光度法特點（1）靈敏度高，可測到10-7g/ml。（2）準確度好，相對誤差為1%-5%，滿足微量組分測定要求。（3）選擇性好，多種組分共存，無需分離直接測定某物質(zhì)。（4）操作簡便、快速、選擇性好、儀器設備簡單、便宜。（5）應用廣泛，無機、有機物均可測定。91011三、電子躍遷的類型

121.-*躍遷能量差大所需能量高吸收峰在遠紫外(<150nm)

甲烷:125nm；乙烷:135nm2.-*躍遷能量差較小所需能量較低吸收峰紫外區(qū)(200nm左右)3.n-*躍遷能量較低收峰紫外區(qū)(200nm左右)（與-*接近）三甲基胺(CH3)3N-的n-*吸收峰在227nm134.n-*躍遷能量低吸收峰在近紫外、可見區(qū)(200~700nm)含有雜原子的不飽和基團，如-C=O，-CN等各種躍遷所需能量大小次序為：

-*>n-*

-*>n-*14基本概念1、生色團具有軌道的不飽和官能團稱為發(fā)色團。有“共軛大鍵”（離域鍵）時，與*間的能量差減小，生色作用大大增強。2、助色團

本身不“生色”，但能使生色團生色效應增強的官能團。含有孤對電子的基團：

—NH2—OH—SH153、紅移和紫移紅移：吸收峰向長λ移動的現(xiàn)象；紫移：吸收峰向短λ移動的現(xiàn)象；增強效應：吸收強度增強的現(xiàn)象；減弱效應：吸收強度減弱的現(xiàn)象。

16四、

吸收光譜

吸收光譜(吸收曲線):吸光度（A）~波長（）吸收峰：曲線上比左右相鄰處都高的一處；

max：吸收程度最大所對應的

谷：曲線上比左右相鄰處都低的一處；

min：最低谷所對應的；肩峰：介于峰與谷之間，形狀像肩的弱吸收峰；17吸收曲線示意圖

18五、無機化合物的吸收光譜1、金屬離子：d電子躍遷稀土離子：f電子躍遷2、配合物電荷轉(zhuǎn)移

Fe3+—SCN-Fe2+—SCNhv195.2Lambert-Beer定律一、透射比和吸光度I0=Ia+It+IrI0——入射光強度Ia

——吸收光強度It——透過光強度Ir

——反射光強度20

若吸收池的質(zhì)量和厚度都相同，則Ir

基本不變，在具體測定操作時Ir

的影響可互相抵消（與吸光物質(zhì)的c及b

無關(guān)）：

I0=Ia+It

采用空白溶液作為參比：測量前在比色皿中裝上空白溶液，測量此時的透過光強度It。21對光吸收程度表示：透光率：T=It/I0

吸光度：A=lg(1/T)=lg(I0

/It)T=10%時，A=1.0空白測定：設定空白溶液的吸光度為0，即透過率T＝100％。22二、Lambert-Beer定律

——光吸收基本定律“

Lambert-Beer定律”是說明物質(zhì)對單色光吸收的強弱與吸光物質(zhì)的濃度（c）和液層厚度（b）間的關(guān)系的定律，是光吸收的基本定律，是紫外-可見光度法定量的基礎。23Lambert-Beer定律推導24A=

lc吸收介質(zhì)之間沒有相互作用吸光度具有加合性25Lambert定律：A=k'lBeer定律：A=k"cLambert-Beer定律：A=klc當c用g/L、b

用cm為單位時，k用吸光系數(shù)a

表示，單位為L/g·cm當c用mol/L、b

用cm為單位時，k用摩爾吸光系數(shù)表示，單位為L/mol·cm

26光吸收定律的有關(guān)名稱和符號27吸光度的加和性

設某一波長（）的輻射通過幾個相同厚度的不同溶液c1，c2···cn，其透射光強度分別為I1，I2···In，根據(jù)吸光度定義：這一吸光體系的總吸光度為：

A=lgI0/In

A1+A2+···+An=lgI0/I1+lgI1/I2+···+lgIn-1/In=lgI0/In

A=lgI0/In=A1+A2+···+An28三、引起偏離Lambert-Beer定律的因素

1.吸收定律本身的局限性

稀溶液中才能成立（吸收介質(zhì)之間沒有相互作用）2.化學因素

Cr2O42-+H2O2CrO42-+2H+

3.儀器因素（非單色光的影響）4.其它光學因素：散射和反射、非平行光295.3紫外-可見分光光度計

一、主要部件

光

源

單色器

信號輸出

檢測器

樣品池301.光源：提供入射光的裝置；（1）鎢燈或碘鎢燈

>350nm，可見光（2）氫燈或氘燈：

150~400nm，紫外光（3）氙燈

200~700nmUVregionVisibleregion312.單色器：色散元件：光柵狹縫準光鏡聚焦元件光源色散元件入射狹縫323.吸收池：

光學玻璃吸收池

——只能用于可見區(qū)

石英吸收池

——可用于紫外及可見區(qū)334.檢測器：硒光電池光電管光電倍增管二極管陣列photochathodeanodehighvoltagevoltagedividernetworkdynodeslightelectrons34LightLensEntranceSlitRotatingGratingExitSlitDetectorMeasureonewavelengthbandatatime.Serialdetectionscheme.ArrayDetectorMeasurealargerangeofwavelengthssimultaneously.Paralleldetectionscheme.355.顯示器：電表指針數(shù)字顯示熒光屏顯示電腦36二.分光光度計的類型

1.單波長、單光束分光光度計（721、722、752型等）一個單色器；一種波長的單色光；一束單色光。2.單波長雙光束分光光度計從一個單色器獲取一個波長的單色光用切光器分成二束強度相等的單色光，消除了光源不穩(wěn)定性。373.雙光束雙波長分光光度計二個單色器得到二個波長不同的單色光。兩束波長不同的單色光（

1、

2

）交替地通過同一試樣溶液（同一吸收池）后照射到同一光電倍增管上，最后得到的是溶液對

1和

2兩束光的吸光度差值?A。38SinglebeamDoublebeamDoubleλ,doublebeamSourceλselectorSampleTransducerOutputSourceλselectorSampleTransducerOutputBlankSourceλ2selectorTransducerOutputλ1selectorSample39三、分光光度計的校正通常在實驗室工作中，驗收新儀器或?qū)嶒炇沂褂眠^一段時間后都要進行波長校正和吸光度校正。建議采用下述的較為簡便和實用的方法來進行校正：A.鐠銣玻璃或鈥玻璃都有若干特征的吸收峰，可用來校正分光光度計的波長標尺，前者用于可見光區(qū)，后者則對紫外和可見光區(qū)都適用。B.也可用K2CrO4標準溶液來校正吸光度標度。40§5—4顯色反應及其影響因素一．顯色反應和顯色劑：（一）顯色反應：在光度分析中將試樣中的待測組分轉(zhuǎn)變成有色化合物的反應叫顯色反應。顯色反應一般分為兩大類：一類是配位反應；另一類是氧化還原反應。Fe3＋＋SCN－=FeSCN－；Mn2＋－5e＋4H2O=MnO4－＋8H＋在這兩類反應中，用得較多的是配位反應。41（二）顯色劑：與待測組分生成有色化合物的試劑叫顯色劑；1．無機顯色劑：許多無機試劑能與金屬離子形成有色化合物，如銅離子與氨可生成深藍色的化合物。但由于多數(shù)無機顯色劑的選擇性和靈敏度不夠高，所以無機顯色劑用的比較少。其中較好的，現(xiàn)在還在使用的無機顯色劑主要有硫氰酸鹽、鉬酸鹽、過氧化氫等少量幾種。422．有機顯色劑：1）優(yōu)點：

a．具有鮮明的顏色，ε都很大（一般可達到104以上），所以測定的靈敏度很高；b．生成的一般為螯合物，穩(wěn)定性很好，一般離解常數(shù)都很小；c．選擇性好d．有些有色配合物易溶于有機溶劑，可進行萃取光度分析，提高了測定的靈敏度和選擇性。433．常見的有機顯色劑：1．磺基水楊酸：其結(jié)構(gòu)式如下：它可用于測定三價鐵離子。442．鄰二氮菲（鄰菲羅啉，1，10—二氮菲）：結(jié)構(gòu)式為：直接在PH=3～9時與Fe2+生成紅色螯合物。用于鐵的測定。453．雙硫腙：也叫二苯—硫腙。結(jié)構(gòu)式為：測定很多重金屬離子，如：鉛、鋅、銅、銀、汞、鎘等。46二．選擇顯色反應的標準：1．選擇性要好：2．靈敏度要高：3．有色化合物的組成要恒定，化學性質(zhì)穩(wěn)定。4．顯色劑的顏色與有色化合物的顏色差別要大5．反應的條件要易于控制。47三．影響顯色反應的因素：（一）顯色劑用量：顯色反應就是將待測組分轉(zhuǎn)變成有色化合物的反應，其反應一般可用下式代表：M＋R=MR反應具有一定的可逆性，當加入過量R的用量時，有利于反應向右進行。48但要注意，加入的顯色劑用量也不能太多，否則產(chǎn)生副反應，對測定產(chǎn)生不利。例如：用SCN-與Fe3+反應生成紅色配合物測定鐵時，當加入的顯色劑太多時，就會對測定產(chǎn)生不利。對于不同的情況，顯色劑的用量對顯色反應的影響是不同的。在實際選用時，一般是通過實驗來確定的。49實驗的方法為：固定待測組分的濃度和其它條件，分別加入不同量的顯色劑，分別測定它們的吸光度，以吸光度為縱坐標，顯色劑用量為橫坐標作圖，可得到吸光度—顯色劑用量的曲線，其結(jié)果分為三種情況：50（二）溶液酸度：酸度對顯色反應的影響很大，因為溶液酸度直接影響著金屬離子、顯色劑的存在形式和有色化合物的組成、穩(wěn)定性等。1．酸度對金屬離子存在形式的影響：很多高價金屬離子都要水解，酸度較低時，不利于顯色反應的進行。512．酸度對顯色劑濃度的影響：很多顯色劑都是有機弱酸，在溶液中有如下平衡：HRH+＋R－而顯色反應為M＋RMR所以酸度太高對反應不利。523．酸度對顯色劑顏色的影響：很多顯色劑本身就是酸堿指示劑，酸度不同時，它們的顏色不同。如果控制不好酸度，就會使指示劑顏色與有色化合物的顏色相近而影響測定。比如：用二甲酚橙為顯色劑，它與金屬離子形成的配合物為紅色，它本身在PH<6.3時為檸檬黃色，而在PH＞6.3時為紅紫色。所以在PH＞6.3時，就無法進行測定。534．酸度對配合物組成的影響：有些顯色反應當酸度不同時，要生成配位比不同的配合物，其顏色也有所不同。如：Fe3+與水揚酸的配合物：PH＜4 Fe(C7H4O3)+

紫色4＜PH＜9 Fe(C7H4O3)2－ 紅色PH＞9 Fe(C7H4O3)

33－黃色由上可見，酸度對顯色反應的影響是很大的，適宜的酸度要由實驗來確定。54（三）顯色時間：顯色反應的速度有快有慢，快的幾乎是瞬間完成，顏色很快達到穩(wěn)定狀態(tài)，并且能保持較長時間。大多數(shù)顯色反應的速度是比較慢的，需要一定時間才能達到穩(wěn)定。而且有些有色化合物放置過久也會褪色。適宜的顯色時間要由實驗來確定。55（四）溫度：一般顯色反應在室溫下進行，但是也有一些反應要加熱到一定溫度下才能進行。而且還有一些有色配合物在室溫下要分解。（五）溶劑的影響：1．影響有色化合物的溶解度；2．影響有色化合物的顏色；3．影響顯色反應進行的速度；56（六）干擾離子的影響和消除方法：

1．與試劑生成有色配合物及大量干擾離子與試劑生成穩(wěn)定的配合物；2．干擾離子本身有色；3．與被測離子形成難離解化合物。57消除干擾的方法主要有以下幾種：1．控制酸度：2．加入掩蔽劑；3．分離干擾離子；4．進行同時測定；5．利用氧化還原反應改變價態(tài)；6、用參比溶液消除顯色劑和某些共存有色離子的干擾；7、選擇適當?shù)牟ㄩL；8、分離：以上方法均不奏效時，采用預先分離的方法。58二．測量條件的選擇：1．測量波長的選擇：一般選用待測物質(zhì)的最大吸收波長作為測量波長（入射光）但當在最大吸收波長處有干擾時，則應根據(jù)“吸收最大干擾最小”的原則來選擇波長。592．控制適當?shù)奈舛确秶河蓽y量誤差可知，當吸光度在0.2～0.8之間時，測量誤差最小，所以應盡量控制吸光度在此范圍進行測定。控制的方法為：1）控制溶液的濃度；2）選用適當厚度的比色皿；60

3．選擇適當?shù)膮⒈热芤海篴.如果僅有顯色劑與被測組分反應的產(chǎn)物有吸收，則可以用純?nèi)軇┳鲄⒈热芤海籦.如果顯色劑和其他試劑有顏色，則用試劑溶液作參比液；c.如果顯色劑與試劑中干擾組分反應，其反應產(chǎn)物有吸收，則按如下方式配置參比液：(1)吸收較弱時，直接用試劑溶液作參比液；(2)吸收較強時，可選用合適的掩蔽劑將被測組分掩蔽后再加顯色劑和其他試劑，以此配制的溶液作參比液。61§5—5紫外—可見分光光度法的應用一．紫外-可見分光光度法在定性分析中的應用（一）定性分析：（二）結(jié)構(gòu)分析：62（三）分析方法：

1．比較光譜法，2．制作試樣的吸收曲線并與標準紫外光譜對照；3．利用Woodward-Fieser經(jīng)驗規(guī)則求最大吸收波長。631.定性分析(輔助方法)

在相同的條件下測定相近濃度的待測試樣和標準品的溶液的吸收光譜，然后比較二者吸收光譜特征：吸收峰數(shù)目及位置、吸收谷及肩峰所在的位置等；分子結(jié)構(gòu)相同的化合物應有完全相同的吸收光譜。641、Woodward-Fieser規(guī)則計算共軛二烯、多烯烴及共軛烯酮類化合物躍遷最大吸收波長的經(jīng)驗規(guī)則。共軛二烯、多烯烴:共軛烯酮類化合物:2、Scott規(guī)則類似于Woodward-Fieser規(guī)則，用于計算芳香族羰基衍生物的躍遷最大吸收波長的經(jīng)驗規(guī)則。65共軛二烯、多烯烴類化合物躍遷最大吸收波長計算

基值217nm基值253nm66增加一個共軛雙鍵30環(huán)外雙鍵5每個烷基取代5-O-乙酰基0-O-R6-S-R30-Cl,-Br5-NR260溶劑校正值067基值253nm環(huán)外雙鍵5nm烷基取代(3×5)15nm273nm

68基值253nm環(huán)外雙鍵5nm烷基取代(4×5)20nm共軛系統(tǒng)延長30nm308nm

692.14有兩種異構(gòu)體，α異構(gòu)體的吸收峰在228nm(ε=14000)，而β異構(gòu)體的吸收峰在296nm(ε=11000)。試指出這兩種異構(gòu)體分別屬于下面兩種結(jié)構(gòu)中的哪一種。(1)(2)70二、結(jié)構(gòu)分析1、判別順反異構(gòu)番茄紅素、偶氮苯反式異構(gòu)體的lmax和emax大2、判別互變異構(gòu)烯醇式——酮式烯醇式的lmax和emax大712），不飽和酮最大吸收位置的計算值六元環(huán)或非環(huán)，不飽和酮基準值215nm位移增量（nm）同環(huán)共軛雙鍵39

環(huán)外雙鍵（C=C）5

延伸雙鍵3072共軛體系上取代基α：10；β：12；

γ位或更高位：18

OCORαβγδ：6OHα：35；β：30；γ：50

Clα：15：β：12Brα：25；β：30NR2β：9573

基值

217四個烷基取代4520二個環(huán)外雙鍵2510計算值(max)247nm實測值(max)247nm74三、定量分析半定量：比色法75定量分析方法的依據(jù)是Lambert-Beer定律（一）單組分定量1.標準曲線法：配制一系列（5~10）個不同c的標準溶液，在適當

(通常為max)下，以適當?shù)目瞻兹芤鹤鲄⒈龋謩e測定A，然后作A-c

曲線同條件下測定試樣溶液吸光度Ax，查找對應的cx

。2.直接比較法：已知試樣溶液基本組成，配制相同基體、相近濃度的標準溶液，分別測定吸光度A標、A樣

76（二）多組分定量吸光度具有加合性的特點。混合組分的吸收光譜相互重疊的情況不同，測定方法也不相同，常見混合組分吸收光譜相干擾情況有以下三種：

771.第一種情況：各種吸光物質(zhì)吸收曲線不相互重疊或很少重疊，則可分別在1及2處測定a

及

b組分的c；2.第二種情況：部分重疊，先在1

處測得

ca，再在2處測得混合組分的吸光度Aa+b

，根據(jù)吸收定律加和性：

Aa+b(2)

=Aa(2)

+Ab(2)

=a(2)

·b·ca+b(2)

·b·

cb應先求得a(2)與b(2)

，并使用相同b,即可求得cb。3.第三種情況：兩吸收曲線互相重疊78如何提高分光光度法的檢測極限？A=ebc

或c=A/eb，欲使待測組分濃度c盡可能小，決定于以下因素①可準確測量的吸光度A值愈小:這始終是儀器制造商追求的目標，目前，高精度分光光度計可準確測量到0.0001吸收單位。②增大吸收池光程:用1～4m全反射長光路毛細吸收管用于天然水中超痕量磷，可測至0.1ppt級。③增大有色化合物的e:目前，有不少二元或三元配合物的顯色反應生成的有色絡合物的e為105級,少數(shù)達106級。可以估算出常規(guī)分光光度法的極限測定濃度:

假定可準確測量的A=0.0001,采用5cm的比色皿