分子生物學與生物化學實驗

操作、設計與技能電泳技術李剛副教授contents影響遷移率的幾大因素2電泳的原理1低熔點瓊脂糖的優點3不同類型瓊脂糖分離DNA片段的范圍4電泳緩沖液5contents電泳步驟7凝膠載樣緩沖液6凝膠中DNA定量的方法8兩種核酸染色方法9電泳的主要用處10contents電泳切膠小竅門12

核酸回收的幾種經典方法11電泳的原理帶電荷的物質在電場中的趨向運動稱為電泳。利用帶電樣品分子（DNA、RNA、蛋白質等）在電泳裝置中的支持介質上（瓊脂糖、聚丙酰酰胺等）遷移率（帶電荷顆粒在一定電場強度下，單位時間內在介質中的遷移距離）的不同而將樣品中不同大小的分子分離開。影響遷移率的幾大因素1、DNA分子的大小。分子越大，遷移得越慢。2、瓊脂糖濃度。給定大小的線性DNA片段在越低濃度瓊脂糖的凝膠中遷移率越快。3、DNA的構象。一般超螺旋DNA（I型)>切口環狀DNA>線狀DNA，但在一些情況下，順序可能顛倒。所以確定DNA的大小，很多時候要依靠Marker（分子量標記）。4、溴化乙錠（EB）。EB插入雙鏈DNA造成其負電荷減少、剛性和長度增加。因此線狀DNA－染料復合物在凝膠中的遷移率約降低15％。影響遷移率的幾大因素5、所用的電壓。低電壓時，DNA片段遷移率與所用的電壓成正比。電場強度升高時，高分子質量片段的遷移率不成比例的增加。所以當電壓增大瓊脂糖凝膠所分離的有效范圍反而減少。要獲得大于2KbDNA片段的良好分辨率，則所用電壓不得超過5－8V／cm。6、瓊脂糖種類。常見的瓊脂糖主要有兩種：標準瓊脂糖(Agarose)和低熔點瓊脂糖（LMPAgarose）。一般低熔點瓊脂糖比標準瓊脂糖具有更佳的分辨率。瓊脂糖品牌的推薦一般來說，瓊脂糖的品牌對電泳結果影響不大，但好的瓊脂糖做出來的膠韌性比較好，照出來的照片效果好，很清晰，背景很干凈。推薦：最好用的瓊脂糖品牌：Sigma，日本的一些牌子，強度也很高。性價比比較高的有BioWestAgarose（西班牙品牌），這幾乎是目前國內使用最普遍的一種瓊脂糖。另外，Promega的Agarose不好用，強度較差。Agarose和Agar的區別注意：Agarose和Agar的區別：瓊脂糖（Agarose）是經過挑選，以質地較純的瓊脂（Agar）作為原料而制成的。瓊脂在化學上是由瓊脂糖和瓊脂膠組成的復合物。瓊脂膠是一含有硫酸根和羥基的多糖，它具有離子交換性質，這種性質會給電泳及凝膠過濾以不良的影響。瓊脂糖是直鏈多糖，它由D-半乳糖和3,6-脫水-L-半乳糖的殘基交替排列組成。瓊脂糖主要通過氫鍵而形成凝膠。電泳時因凝膠含水量大（98－99%），近似自由電泳，因為固體支持物的影響少，故電泳速度快，區帶整齊。而且由于瓊脂糖不含帶電荷的基團，電滲影響很少，是一種較好的電泳材料，分離效果較好。Agarose一般僅用于電泳實驗，當然如果不怕浪費的話，也可以用于配固體培養基。效果很好！Agar一般僅用于配固體培養基，絕對不能用于電泳！低熔點瓊脂糖的優點標準瓊脂糖一般凝結溫度在40－42C，熔化溫度在85－90度。低熔點瓊脂糖一般凝結溫度在25－35C，熔化溫度在63－65C，甚至更低。一般在30－35C仍呈液態，所以在回收膠內的DNA時，加熱溶解膠后不損傷DNA。另外它比標準（普通）瓊脂糖有更高的篩分能力。其分辨率接近聚丙烯酰胺凝膠，因此可用于PCR產物、小片段DNA和小RNA（<1kb）的分離。現在它能分辨少至4bp的DNA和分離200－800bp范圍內相差2％的DNA片段。但低熔點瓊脂糖價格非常昂貴，遠高于標準瓊脂糖。不同類型瓊脂糖分離DNA片段的范圍瓊脂糖／％

標準

高強度

低熔點

低黏性低熔點0.30.5700bp-25kb0.8500bp-15kb800bp-10kb800bp-10kb1.0250bp-12kb400bp-8kb400bp-8kb1.2150bp-6kb300bp-7kb300bp-7kb1.580bp-4kb200bp-4kb200bp-4kb2.0100bp-3kb100bp-3KB3.0500bp-1kb500bp-1kb4.0100bp–500bp6.010bp-100bp電泳緩沖液DNA的泳動受電泳緩沖液的組成和離子強度的影響。缺乏離子（如用水代替電泳槽及凝膠中的緩沖液）則電導率降至很低，DNA不是不動就是遷移極慢。高離子強度時（如錯用了10電泳緩沖液），電導率升高，即使應用適中的電壓也會產生大量的熱能。最嚴重時，凝膠會熔化，DNA會變性。常用的兩種電泳緩沖液緩沖液

工作液

貯存液／LTAE140mMTris-乙酸鹽

501mMEDTA242gTris57.1mL冰乙酸

100mL0.5MEDTA(pH8.0)TBE0.545mMTris-硼酸鹽

51mMEDTA54gTris27.5g硼酸

20mL0.5MEDTA(pH8.0)

選擇TAE還是TBE？TAE的緩沖容量最低，長時間電泳會被消耗完，應短期更換。TBE成本比TAE稍貴些，但緩沖容量比TAE大得多，可以很長時間不用更換。對于低分子量DNA電泳，TAE分辨率稍低于TBE，而高分子量DNA電泳，TAE的分辨率略高于TBE。因此Southernblot操作中均用TAE作為電泳緩沖液制備凝膠和電泳。超螺旋DNA在TAE中的分辨率要好于TBE。

凝膠載樣緩沖液電泳樣品上樣前需要和載樣緩沖液混合。載樣緩沖液有三個作用：它增加樣品密度以保證DNA沉入加樣孔內；使樣品帶有顏色便于檢查上樣過程；其中的染料在電場中可以以預測的速率向陽極遷移。溴酚藍在瓊脂糖凝膠中遷移速率是二甲苯氰FF的2.2倍，這一特性與瓊脂糖濃度無關。在0.5TBE瓊脂糖凝膠電泳中溴酚藍遷移速率約與300bp的線狀雙鏈DNA相同，而二甲苯氰FF約與長4000bp的DNA相同。上述關系在濃度范圍0.5%-1.4%的瓊脂糖凝膠中基本不受濃度變化的影響。用哪種載樣緩沖液是個人的習慣。6載樣緩沖液緩沖液類型

6緩沖液

貯存溫度I

0.25%溴酚藍4C

0.25％二甲苯氰FF40％（m/V）蔗糖水溶液II0.25%溴酚藍室溫

0.25％二甲苯氰FF15％Ficoll（Type400，Pharmacia）水溶液III

0.25%溴酚藍4C0.25％二甲苯氰FF30％（V/V）甘油水溶液IV

0.25%溴酚藍4C40％（m/V）蔗糖水溶液電泳步驟1、用相應的電泳緩沖液加入適量瓊脂糖熔化（水浴或微波）配膠，待膠熔化后取一定量（通常20－30mL）加入一個專用的三角瓶中，加入EB使其終濃度為0.5g/ml，混勻后加入一個預先密封好、放好合適的梳子（以形成加樣孔）的膠板中灌膠（防止漏膠是要點：用雙層膠帶紙封膠板或使用現在的防漏膠膠板）。2、讓凝膠溶液完全凝膠，一般室溫下需要30－45分鐘。3、小心拔掉梳子（要點：雙手拔），撕去封邊膠帶，將凝膠安放到電泳槽內。4、向電泳槽內加入電泳液，剛好沒過凝膠約1mm。5、混合DNA樣品和0.2倍體積6載樣緩沖液。（一般在eppendorf管中混勻,要點:快速加樣用封口膜加緩沖液）電泳步驟6、用微量移液器及一次性吸頭將混合液加入凝膠中的加樣孔中，分子量標準應加入加樣孔左右兩側的兩個孔內。（初學者常常在點樣的時候看不清膠上透明的加樣孔，一個有效的解決辦法是在電泳槽下面墊一張黑色的紙版或塑料膜，這樣由于背景是黑色的，很容易發現加樣孔。）7、調到合適電壓（通常1－5V/cm，實際上有時為了省時間可適當增加電壓）電泳。看電極插頭有沒有插反？陽極和陰極有沒有氣泡冒出？待溴酚藍和二甲苯氰FF遷移到適當距離后再停止電泳。（一般等溴酚藍遷移到膠板的三分之二位置以上即可停止電泳）8、在紫外透射儀下觀察凝膠，并用凝膠成像系統照相。電泳過程的動畫播放gelelectrophoresis.exe凝膠中DNA定量的方法1、紫外分光光度計法，根據OD260值換算。（定量測定DNA或RNA時需要讀取260nm和280nm兩個波長下的讀數。根據在260nm處的讀數可計算出樣品中的核酸濃度，1個OD值相當于50μg／mL雙鏈DNA、40μg／mL單鏈DNA和RNA及33μg／mL單鏈寡核苷酸。利用260nm和280nm兩處讀數的比值可估計核酸的純度。DNA和RNA純制品的OD260：OD280值分別為1.8和2.0。）必須指出：盡管上述方法測得的DNA濃度一般是很精準的，但有些時候由于儀器或操作的原因，其誤差往往遠遠超過根據肉眼判斷的DNA濃度。凝膠中DNA定量的方法2、根據DNAmarker估算。（以DL2000為例）。DL2000由100bp、250bp、500bp，750bp、1000bp、2000bp六條帶組成。一般每次取5μl電泳，每條帶的DNA量都是相同的，約為50ng，所以5μlDL2000的DNA片段總量約為300ng。如果目標DNA的帶與DL2000的某條帶差不多大，且亮度相似，則可認為目標DNA的量也為50ng，再除以目標DNA的體積，即為目標DNA的濃度。如果目標DNA的帶比markerDNA某條帶的亮度高很多倍，可通過系列稀釋，使之亮度相似。再考慮稀釋倍數計算其濃度；如果目標DNA的帶比markerDNA某條帶的亮度低很多倍，可通過減少或稀釋markerDNA，使之亮度相似。再根據markerDNA的量計算其濃度。3、有些計算機軟件可根據上述原理，直接根據所拍凝膠電泳圖中marker條帶與目標DNA條帶大小和亮度的差異，直接計算出目標DNA的濃度。兩種核酸染色方法溴化乙錠（EB）染色法：靈敏度：10ngDNA條帶。配制：通常用水將溴化乙錠配制成10mg/mL的貯存液，于室溫（或4C）保存在棕色瓶或用鋁箔包裹的瓶中。電泳時的工作濃度是0.5g/ml，大多數情況下可以預先加入膠中。但當需要知道DNA片段的準確大小（如DNA限制酶切圖譜的鑒定時片段大小很接近）時，凝膠應該在無EB條件下電泳。電泳結束后用EB染色。染色時，將凝膠浸入含有EB0.5g/ml）的電泳緩沖液中，室溫下染色30－45min。染色完畢后，通常不需要脫色。但在檢測小量DNA（<10ng）片段時，通常要將染色后的凝膠浸入水中或1mMMgSO4中,室溫脫色20分鐘更容易觀察到。廢棄溴化乙錠EB凈化和處理方法1、嚴禁隨便丟棄。因為EB是強致癌性，而且易揮發，揮發至空氣中，危害很大。2、

廢EB溶液的處理方法：

(1)

對于EB含量大于0.5mg/ml的溶液，可如下處理：

a.

將EB溶液用水稀釋至濃度低于0.5mg/ml；

b.

加入一倍體積的0.5mol/L

KMnO4

，混勻，再加入等量的2.5mol/L

HCl，混勻，置室溫數小時；

c.

加入一倍體積的2.5mol/L

NaOH，混勻并廢棄。

(2)

EB含量小于0.5mg/ml的溶液可如下處理：

a.

按1mg/ml的量加入活性炭，不時輕搖混勻，室溫放置1小時；

b.

用濾紙過濾并將活性碳與濾紙密封后丟棄。3廢EB接觸物，如抹布，槍頭。一般回收至黑色的玻璃瓶中，定期進行焚燒處理。凝膠SYBRGold染色法SYBRGold是一種新型的極敏感的染料的商品名稱。它激發的熒光信號（300nm透射光下激發出亮黃色熒光）的強度是EB－DNA復合物的1000多倍，因此用SYBR－Gold可檢測出瓊脂糖凝膠中小于20pg的雙鏈DNA，少至100pg的單鏈DNA或300pg的RNA。SYBRGold以10000x的濃度貯存在無水的DMSO（二甲基亞砜）中，其昂貴的價格使其不適合用于常規凝膠染色。但是將該染料在某些實驗中（單鏈構象的多態性和變性梯度凝膠電泳）替代放射標記DNA是物有所值的。使用時，DNA片段經過凝膠電泳分離后，用SYBRGold貯存液的稀釋液（1：10000）浸染凝膠。不能將SYBRGod加入熔化的凝膠中或電泳前加入凝膠，這是由于在SYBRGold存在的情況下，凝膠中核酸的電泳條帶會發生嚴重變形。另外由于SYBRGold對熒光敏感，所以其工作液應該當天用電泳緩沖液新鮮配制，室溫存放。

電泳的主要用處1、質粒或基因酶切圖譜的鑒定。2、核酸或蛋白質大小的檢測。3、DNA酶切片段或蛋白質的純化和回收。核酸回收的幾種經典方法1、低熔點瓊脂糖凝膠中有機試劑抽提。2、用玻璃珠從瓊脂糖凝膠中回收DNA。3、瓊脂糖酶消化法。4、凝膠切槽法。5、凍融法。6、Kit法。1、低熔點瓊脂糖凝膠中有機試劑抽提由于低熔點瓊脂糖在37C仍保持液態，一些酶學反應操作如連接、合成放射性探針以及限制性酶切等反應，均可通過將含有目的DNA片段的凝膠直接加入到反應體系中來完成。然而總體上講，DNA聚合酶、連接酶以及限制酶在液膠狀態下比在常規的緩沖液中工作效率要低，一般不建議這么做，所以很多實驗要從凝膠中回收DNA片段后再進行下面的實驗。步驟：1、利用低熔點瓊脂糖制備膠塊，電泳，使目的片段與其它條帶完全分開。在紫外燈下，用一鋒利的刀片切下含有目的條帶的低熔點瓊脂糖凝膠切片，轉移到一個干凈的一次性使用的塑料管中（盡量將多余的凝膠切掉，以減少抑制劑對DNA的污染量）。（要點：節省低熔點凝膠的方法）2、加5倍體積的LMT洗脫緩沖液[20mMTris.Cl(pH8.0),1mMEDTA(pH8.0)]至瓊脂糖切片中。蓋好管蓋，于65C溫育5分鐘熔化凝膠。3、待凝膠冷卻至室溫后，加等體積的Tris平衡酚，將混合液混旋20S。在20C以4000g離心10分鐘，回收水相（界面的白色物質是瓊脂糖）。4、再用等體積的酚：氯仿、氯仿各抽提一次。5、水相轉移到另一新的離心管中。加0.2倍體積的10M乙酸銨和2倍體積4C的無水乙醇。混合液在室溫下放置10分鐘。然后4C，5000g(SorvallSS-34轉子相當于6500r/min)離心20min，沉淀回收DNA。6、用70％的乙醇洗滌沉淀，并溶于適當體積的TE（pH8.0）中。低熔點瓊脂糖凝膠中回收純化的DNA適于分子克隆中的大多數酶學操作，但對于一些要求更嚴格的實驗，如轉染、顯微注射等需要高純度的DNA，此時需要用商品化的各種樹脂進行純化。節省低熔點凝膠的方法用普通Agarose配制膠塊進行電泳，待各DNA條帶在膠上完全分開后，關掉電泳儀，取出膠板，在緊靠目的條帶正前方的泳道上用刀片挖一個長方形的小槽，注意要將膠塊的底物挖通，然后用低熔點瓊脂糖和電泳緩沖液配制少量膠塊，融化后，趁熱倒入所挖的長方形小槽內，室溫放置數分鐘，使其完全凝固。然后將補好的膠塊重新放入電泳槽中進入電泳。同時用手提式紫外燈實時監控目的條帶，直至目的條帶完全進入挖好的槽中。停止電泳，將低熔點瓊脂糖膠塊中含有目的DNA的條帶切下，即可進行后續操作。2、用玻璃珠從瓊脂糖凝膠中回收DNA原理：在高鹽狀態下，可使呈液態的低熔點瓊脂糖切片中的DNA結合到玻璃珠（粉）上。洗滌液清洗后，利用低鹽緩沖液洗脫結合到玻璃珠上的DNA，從而可以有效回收DNA。優點：比有機試劑抽提法更快速，純度更高；缺點：回收產量往往較低。步驟：1、將切好的凝膠切片轉移到一聚丙烯管中。2、加3－5倍體積的碘酸鈉溶液，55C溫育5分鐘熔化凝膠。當凝膠完全熔化后，不宜再進行加熱。3、對于5g的DNA樣品，加入5l玻璃珠。對于>5g的DNA樣品，每增加1g的DNA需額外增加2l玻璃珠。室溫溫育5min,并不時搖動。4、微量離心機以最大轉速離心5s,棄上清。5、用500l洗滌液[20mMTris.Cl(pH7.4),1mMEDTA,100mMNaCl,加等體積的乙醇，0C可保存3－4個月。]連洗沉淀3次，以0.5gDNA/l重懸于TE（pH8.0）。6、45C溫育DNA／玻璃珠混合物3ml,使DNA從玻璃珠上洗脫。7、微量離心機以最大轉速離心1min,將含DNA的上清移至另一新的離心管中，4C（或－20C）保存。3、瓊脂糖酶消化法

原理：瓊脂糖酶使瓊脂糖多聚體水解成雙糖。這樣獲得的DNA再經酚抽提、乙醇沉淀進行純化。由于該法較為溫和，因此特別適用于從脈沖場瓊脂糖凝膠中回收高分子量的DNA，從恒強電場瓊脂糖凝膠中回收小分子DNA也同樣有效。1、將切好的凝膠切片轉移至微量離心管中，加入20倍體積（1微克加入20微升）的凝膠平衡緩沖液［10mMBisTris-Cl(pH6.5)］,5mMEDTA(pH8.0),0.1MNaCl],室溫靜置30min。2、將凝膠切片轉移至另一加有等體積凝膠平衡緩沖液的新微量離心管中。3、65C溫育10min，使凝膠切片熔化。冷卻至40C，加入無DNA酶的瓊脂糖酶，每200l凝膠加入1－2單位。40C溫育1h。4、此時的DNA溶液可直接用于連接、酶切及轉化等實驗。此外，如果需要，DNA溶液還可作進一步的純化和濃縮。純化小片段DNA（<20kb）A.用平衡酚抽取DNA溶液兩次。B.將水相轉移至一新管中，加入兩倍體積的TE（pH8.0），這一步操作有助于防止寡糖沉淀。C.加入0.05倍體積的5MNaCl，隨后加入2倍體積的乙醇（指上步中的DNA終體積）l。置0C預冷15分鐘，微量離心機4C以最大轉速離心15分鐘收集沉淀。D.小心地吸出乙醇，加入0.5ml處于室溫的70％乙醇。混合均勻，按步驟C所述離心。E.吸去上清，打開離心管。置于操作臺上數分鐘，揮發去除殘留乙醇，將DNA溶于適當體積的TE（pH8.0）中。純化大片段（>20kb）A.將瓊脂糖酶消化過的樣品移至一透析袋中，扎好或封好后將透析袋放在含100mlTE(pH8.0)的燒杯或三角瓶中。B.4C透析樣品數小時。為防止大片段DNA的斷裂損傷，應盡可能避免酚抽提、渦旋以及乙醇沉淀。在透析緩沖液中加入30M的精胺和70M的亞精胺可提高大分子DNA的回收效率。4、凝膠切槽法1、待各DNA條帶在膠上完全分開后，關掉電泳儀，取出膠板，在緊靠目的條帶正前方的泳道上用刀片挖一個長方形的小槽，注意切勿將槽的底部挖開，底部應保留一薄層膠。2、將電泳槽中的緩沖液倒掉（吸取）一些，使得緩沖液不要沒過膠表面。將膠板重新放入電泳，在挖好的槽中加滿15％PEG4000溶液（以電泳緩沖液配制），用手提式紫外燈實時監控目的條帶，直至目的條帶完全進入挖好的槽中。3、關閉電泳儀，用移液器小心將膠槽里的含目的DNA片段的PEG溶液吸出，加入一個新的離心管中。4、酚：氯仿抽提1－2次。5、無水乙醇沉淀和70％乙醇洗滌步驟同方法1（有機試劑抽提）中的步驟。優點：不需LMTAgarose，步驟少，