第14章核酸的物理化學性質一、核酸的水解二、核酸的酸堿性質三、核酸的紫外吸收四、核酸的變性、復性及雜交一、核酸的水解（一）酸水解對酸的敏感性：糖苷鍵＞磷酸酯鍵

嘌呤糖苷鍵＞嘧啶糖苷鍵脫嘌呤：

pH1.6，37℃，對水透析

pH2.8，100℃，1h脫嘧啶：

98-100%甲酸，175℃，2h

三氟乙酸，155℃，60min（DNA）或

80min（RNA）利用酸水解可以研究核酸的堿基組成2（二）堿水解RNA的磷酸酯鍵對堿敏感室溫，0.3～1mol/LKOH，18-24h，可將RNA完全水解，得到2′-或3′-核苷酸的混合物。DNA抗堿水解生理意義：DNA更穩定，遺傳信息。RNA是DNA的信使，完成任務后迅速降解。3（三）酶水解非特異的磷酸二酯酶：蛇毒磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得5′-核苷酸牛脾磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得3′-核苷酸特異的磷酸二酯酶：核酸酶N-糖苷酶4核酸酶的分類底物專一性：核糖核酸酶RNase脫氧核糖核酸酶DNase作用方式：核酸外切酶（exonuclease)、核酸內切酶(endonuclease)單鏈核酸酶、雙鏈核酸酶、雜鏈核酸酶磷酸二酯鍵的斷裂方式：5′-（寡）核苷酸3′-（寡）核苷酸

5

核酸酶（nuclease）ATCGTCCCGGTAGA化學本質是蛋白質5′3′外切酶內切酶限制性核酸內切酶具有序列特異性的核酸酶稱為限制性核酸內切酶6二、核酸的酸堿性質磷酸和堿基均能發生兩性解離。DNA等電點4～4.5RNA等電點2～2.5兩性電解質：酸性的磷酸基和堿性的堿基

電泳和離子交換分離純化核酸7三、核酸的紫外吸收堿基、核苷、核苷酸和核酸在240～290nm的紫外波段有強烈的光吸收。λmax=260nm8鑒定純度純DNA的A260/A280應為1.8（1.65-1.85）純RNA的A260/A280應為2.0。若溶液中含有雜蛋白或苯酚，則A260/A280比值明顯降低。含量計算1ABS值相當于：50ug/mL雙螺旋DNA

或：40ug/mL單鏈DNA（或RNA）

或：20ug/mL寡核苷酸判斷DNA是否變性在DNA的變性過程中，摩爾吸光系數增大（增色效應）在DNA的復性過程中，摩爾吸光系數減小（減色效應）9四、核酸的變性、復性及雜交(一)變性(denaturation)核酸變性指核酸雙螺旋區的氫鍵斷裂，變成單鏈，不涉及共價鍵斷裂。102202402602800.10.20.30.4波長（nm）光吸收123天然DNA變性DNA核苷酸總吸收值123變性因素：熱變性酸堿變性（pH小于4或大于11）變性劑（尿素、鹽酸胍、甲醛）

變性后的理化性質：260nm吸收值升高。粘度降低，浮力密度升高。二級結構改變，部分失活。11DNA的變性是爆發式的，變性作用發生在一個很窄的溫度范圍內。DNA的雙螺旋結構失去一半時對應的溫度稱為解鏈溫度（meltingtemperature,Tm）。12影響DNA的Tm值的因素①DNA均一性均一性高，變性的溫度范圍越窄，據此可分析DNA的均一性。②G-C含量與Tm值成正比測定Tm，可推知G-C含量。G-C%=（Tm-69.3）×2.4413③介質中離子強度

離子強度高，Tm高。14（二）復性(renaturation)

變性的DNA在適當的條件下，兩條彼此分開的DNA單鏈重新締合成為雙螺旋結構的過程。15（三）核酸分子雜交(Hybridization)16不同來源的DNA單鏈間或單鏈DNA與RNA之間只要有堿基配對的區域，在復性時可形成局部雙螺旋區，稱核酸分子雜交（hybridization）。制備特定的探針（probe）通過雜交技術可進行基因的檢測和定位研究。175’3’5’3’5’3’5’3’提取DNA限制性內切酶消化瓊脂糖凝膠電泳、堿變性轉移到NC膜，高溫烘烤與DNA雜交放射自顯影Southernblotting可用于DNA之間同源性分析，確定特異性DNA序列的大小和定位。Southern印跡法

19NorthernBlotting研究對象是mRNA，探針一般是DNA。總RNA或mRNA需在變性條件下電泳（乙二醛、甲醛）。WesternBlotting抗原與抗體的雜交研究對象是蛋白質，“探針”是抗體。20基因芯片21小結

核酸