核酸的提取及相關技術質粒DNA的提取、分離和純化基因組DNA的提取總RNA的提取、分離和純化mRNA的分離和純化核酸電泳技術限制性內切酶I.質粒DNA的提取、分離和純化一、質粒的基本性質

質粒是一種染色體外的穩定遺傳因子，大小從1-200kb不等，為雙鏈、共價閉合環狀DNA分子（covalentlyclosedcircularDNA,簡稱cccDNA）

，并以超螺旋狀態存在于宿主細胞中。質粒主要發現于細菌、放線菌和真菌細胞中，它具有自主的復制和轉錄系統，但質粒的復制和轉錄需要宿主細胞編碼的某些酶和蛋白質。此外，質粒還具有編碼某些酶的基因，如對抗生素的抗性等。

質粒在細胞內的復制一般有二種：緊密控制型（stringentcontrol）和松弛控制型（relaxedcontrol）。前者只在細胞周期的一定階段進行復制，通常每個細胞內只含有一個或幾個質粒分子；后者在整個細胞周期中隨時可以復制，在每個細胞中有許多拷貝，一般在20個以上。在細胞培養過程中，加適當氯霉素可使松弛型質粒的拷貝數由原來的20多個擴增至1000-3000個。

質粒的不相容性（incompatibility）

利用同一復制系統的不同質粒不能在同一宿主細胞中共同存在，當兩種質粒同時進入同一細胞時，它們在復制及隨后分配到子細胞過程中相互競爭，只有一種質粒占優勢。這樣，過幾代后，占小數的質粒將丟失，在細胞后代中只有二種質粒中的一種。這種現象稱為質粒的不相容性（incompatibility）。但利用不同復制系統的不同質?？稍谕凰拗骷毎泄餐嬖凇６①|粒DNA的制備基本原理(堿法）

從細胞中分離質粒DNA的方法都包括3個基本步驟：培養細菌使質粒擴增；收集和裂解細胞；分離和純化質粒DNA.①采用溶菌酶可以破壞菌體細胞壁，SDS和TritonX-100可使細胞膜裂解。②處理后細菌染色體DNA會纏繞附著在細胞碎片上，同時由于細菌染色體DNA比質粒大得多，易受機械力和核酸酶等的作用而被切斷成不同大小的線性片段。③當用強熱或酸、堿處理時，細菌的線形染色體DNA變性，而cccDNA的二條鏈不會相互分開。④當外界條件恢復正常時，線狀染色體DNA片段難以復性，而與變性的蛋白質和細胞碎片纏繞在一起，而質粒DNA雙鏈又恢復原狀，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解狀態存在于液相中。⑤通過離心可獲得質粒DNA。三、試劑LB液體培養基:

蛋白胨（tryptone）10g,酵母提取物（yeastextract）5g,NaCl10g,用NaOH調至。高壓下蒸汽滅菌20分鐘。LB固體培養基：每升液體培養基加12g瓊脂粉，高壓下蒸汽滅菌20分鐘。氨芐青霉素（Amp）母液：配成50mg/ml水溶液，-20

℃下保存備用。溶液I：50mmol/L葡萄糖、25mmol/LTrisCl(pH8.0),10mmol/LEDTA(pH8.0).高壓蒸汽滅菌15分鐘,儲存于4oC冰箱。溶液II：0.2mol/LNaOH(臨用前用10mol/LNaOH母液稀釋)，1%SDS.溶液III:5mol/LKAC60ml,冰醋酸11.5ml,水28.5ml.RNaseA母液：將RNaseA酶粉溶于10mmol/LTrisCl(pH7.5)、15mmol/LNaCl,終濃度為10mg/ml。100℃加熱15分鐘，冷卻后分裝。飽和酚：市售酚需重蒸。重蒸后加0.1%8-羥基喹啉，并用等體積的0.5mol/LTrisCl(pH8.0)和0.1mol/LTrisCl(pH8.0)緩沖液反復抽提，使pH達到7.6以上。氯仿：按氯仿/異戊醇=24：1混合。酚/氯仿：將上述飽和酚和氯仿按1：1混合。TE緩沖液：10mol/LTrisCl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0).高壓蒸氣滅菌15分鐘,儲存于4℃冰箱。四、操作步驟1．細菌的培養和收集：將含有質粒pBS的DH5菌株接種在LB固體培養基（含50g/mlAmp）中，37℃培養12-24小時。用無菌牙簽挑取單菌落接種到5mlLB液體培養基（含50g/mlAmp）中，37℃培養約12小時至對數生長后期。2．

質粒DNA的少量快速提取---堿裂解法

1).

取1.5ml培養液倒入1.5mlependorf管中，4℃下12000g離心30秒。

2).

棄上清，將管倒置于衛生紙上數秒鐘，使液體流盡。

3).

菌體沉淀重懸浮于100l溶液I中（激烈震蕩，充分混勻），室溫下放置5-10分鐘。

4).

加入新配制的溶液II200l，蓋緊管口，并倒置離心管，溫和顛倒ependorf管數次，以混勻內容物（千萬不要震蕩）中，冰浴中放置5分鐘。

5).

加入150l預冷的溶液III，蓋緊管口，并倒置離心管，溫和顛倒

ependorf管數次，以混勻內容物，冰浴中放置5-10分鐘。4℃下

12000g離心5-10分鐘,取上清。6).將上清液移入干凈ependorf管中，加入等體積的酚/氯仿(1:1)，震蕩混勻，4℃下12000g離心5分鐘。7).將上清液移入干凈ependorf管中，加入等體積的氯仿，震蕩混勻，4℃下12000g離心5分鐘。8).

將水相移入干凈ependorf管中，加入2倍體積的無水乙醇，震蕩混勻后置于-20℃冰箱中20分鐘。然后在4℃下12000g離心10分鐘。9).

棄上清液，將管口敞開并倒置于衛生紙上，使液體流盡。加入1ml70%乙醇洗滌沉淀。4℃下12000g離心5-10分鐘。10).

吸去上清液，將管倒置于衛生紙上，使液體流盡，室溫干燥或真空干燥10分鐘.11).將沉淀溶于20lTE緩沖液（pH8.0,含20g/mlRNaseA）中，儲于-20℃

C冰箱.

附:

日常型質粒DNA小量純化試劑盒

（硅膜吸附）原理：帶負電荷的DNA和帶正電的二氧化硅粒子有很高的親和力。陽離子Na發揮橋梁作用，吸附核酸磷酸鹽骨架上帶負電荷的氧，在高鹽的酸性條件下，Na+

打破水中的氫和二氧化硅上帶負電荷的氧離子間的氫鍵，DNA與二氧化硅緊密結合，先洗滌除去其他雜質，再用低離子強度的TE緩沖液或蒸餾水洗脫結合的DNA分子。該試劑盒沿用傳統的SDS堿裂解法，結合DNA制備膜選擇性地吸附DNA的方法達到快速純化質粒DNA的目的。適合于從4mlLB細菌培養物中提取5～20ug純凈的質粒DNA，用于測序、體外轉錄與翻譯、限制性內切酶消化、細菌轉化等分子生物學實驗。操作步驟

第一次使用時，將試劑盒攜帶的RNaseAl全部加入到S1溶液中，混合均勻，4℃保存。1．取3ml在LB培養基中培養過夜的菌液(若使用豐富培養基，菌液體積應減半或更少)，12000rpm離心20s，棄盡上清；2．用0.25ml已加入RNaseAl的S1溶液懸浮細菌沉淀，懸浮需均勻，不應留有小的菌塊；3．加0.25mlS2溶液，溫和并充分地上下翻轉混合均勻使菌體充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步驟不宜超過5min；4．加入0.5ml4℃預冷的S3溶液，溫和并充分地上下翻轉混合均勻，直至形成緊實的凝集塊，室溫靜置2min。最高速度(12000rpm)離心5min；操作步驟(續)5．吸取步驟4中的離心上清并轉移到DNA制備管(置于2ml離心管中)，3600rpm離心lmin。如制備管中有液體殘留，適當提高離心速度，再離心1min，棄濾液；6．將制備管置回離心管，加0.5mlWl溶液，3600rpm離心30s，棄濾液；7．將制備管置回離心管，加0.7mlW2溶液，3600rpm離心30s；以同樣的方法再用0.7mlW2溶液洗滌一次。棄濾液；8．將制備管移入離心管中，12000rpm離心1min；9．將制備管移入新的1.5ml離心管中，在DNA制備膜正中央加60μl水或洗脫液，室溫靜置lmin。12000rpm離心lmin洗脫DNA。質粒DNA電源圖磁珠法提取DNA原理1994年T．L．Hawkins等發現羧基高分子表面在一定濃度PEG／NaCl條件下具有吸附核酸的能力，而在水或TE溶液中核酸又可以解吸附。因此，在磁珠表面連接可特異地與DNA發生作用的功能基團，使其具有可逆吸附DNA的特性。通常采用帶有氨基、巰基、環氧基等基團的活化試劑對磁珠表面包覆的高分子進行化學修飾。高鹽離子濃度下多聚核苷酸與羧基修飾的磁珠表面可發生非特異性吸附，而蛋白、單糖、多糖和脂類等細胞成分不被吸附的原理，這樣就建立了一種以磁性微珠為載體的DNA純化方法。相對微米或亞微米級載體，納米磁性粒子具有尺寸小、偶聯容量大、懸浮穩定性高及超順磁性等優點，便于各種反應高效快速進行。

該核酸提取法對DNA結構沒有損傷，生物相容性高，DNA可直接洗脫應用，純度及純化效率等方面都較高。II、基因組DNA的提取一、概述

染色體DNA通常用于構建基因組文庫和Southern雜交等，同時在目前廣受人們關注的生物基因組學研究中是最重要的研究目標。1、基因組文庫的構建：當用于構建基因組文庫時，所得的染色體DNA的片段長度應盡可能的長（至少應大于需克隆片段的4倍）。當用Cosmid構建文庫時，片段長度應大于200kb;用噬菌體構建文庫時應大于80kb。但在制備過程中，有機溶劑的抽提、震蕩、反復抽提和乙醇沉淀等步驟都會造成DNA斷裂。我們應盡可能采用溫和的方法和手段。2、Southern雜交：用于Southern雜交的染色體DNA片段長度要求可適當降低。3、PCR\AFLP\RFLP等：DNA片段長度要求可適當降低。一、概述

不同生物（植物、動物、微生物）的基因組DNA的提取方法有所不同；同種生物的不同種類或同一種類的不同組織因其細胞結構及所含的成分不同，分離方法也有差異。在提取某種特殊組織的DNA時，必須參照文獻和經驗建立的相應提取方法，以獲得可用的DNA大分子。不同的植物材料提取的方法有差異，主要在提取緩沖液的成分上，如李、蘋果的植物的染色體DNA提取所用的提取緩沖液為：18.6g葡萄糖、6.9g二乙基二硫代碳酸鈉（Sarkosyl）、6.0gPVP、240ul巰基乙醇、加水至300ml二、植物基因組DNA提取

(水稻和其它禾本科植物)1、試劑

A.提取緩沖液：100mmol/LTris·Cl（pH8.0）、

20mmol/LEDTA、500mmol/LNaCl、1.5%SDS。

B.氯仿/戊醇/乙醇溶液:80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇

C.異丙醇

D.TE:10mol/LTrisCl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0).

高壓蒸氣滅菌15分鐘,儲存于4℃冰箱。

E.RNaseA：10mg/mlF.3mol/LNaAC2、實驗步驟在50ml離心管中加入20ml提取緩沖液，60℃水浴預熱。水稻幼苗或葉子5-10g，剪碎，在研缽中加液氮磨成粉狀后立即倒入預熱的含提取緩沖液的離心管中，劇烈搖動混勻，60℃水浴保溫30-60分鐘（時間長，DNA產量高），不時搖動。加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液，顛倒混勻（需帶手套，防止損傷皮膚），室溫下靜置5-10分鐘，使水相和有機相分層（必要時可重新混勻）。室溫下5000rpm離心5分鐘。仔細移取上清液至另一50ml離心管，加入一倍體積異丙醇，混勻，室溫下放置片刻即出現絮狀DNA沉淀。用玻棒撈出DNA沉淀，70%乙醇漂洗，再在干凈吸水紙上吸干。轉入含1mlTE

的1.5mleppendorf管中，DNA很快溶解于TE。如DNA不形成絮狀沉淀，則可用5000rpm離心5分鐘，再將沉淀移入TE管中。這樣收集的沉淀，往往難溶解于TE，可在60℃水浴放置15分鐘以上，以幫助溶解。2、實驗步驟(續）H.

將DNA溶液3000rpm離心5分鐘，上清液倒入干凈的5ml離心管。I.加入5ulRNaseA（10ug/ul），37℃10分鐘，除去RNA（RNA對DNA的操作分析一般無影響，可省略該步驟）。J.加入1/10體積的3mol/LNaAC及2x體積的冰乙醇，混勻，-20℃放置20分鐘左右，使DNA形成絮狀沉淀。K.用玻棒撈出DNA沉淀，70%乙醇漂洗，再在干凈吸水紙上吸干。L.將DNA重新溶解于1mlTE中，-20℃貯存。M.取2ulDNA樣品在0.7%Agarose膠上電泳，檢測DNA的分子大小。同時可取15ul稀釋20倍，測定OD260/OD280，檢測DNA含量及質量。3、DNA純度與濃度測定A、DNA純度：DNA的OD260/OD280一般為1.8左右。

OD260/OD2801.8：說明較純；

OD260/OD2801.8：說明可能有RNA污染；

OD260/OD2801.8：說明可能有蛋白質污染。B、DNA濃度：當OD260為1時，dsDNA含量為50ug/ml,ssDNA或RNA含量為40g/ml；單鏈寡核苷酸為20ug/ml.[dsDNA]（μg/ml）=50×OD260×稀釋倍數附:動/植物基因組DNA小量純化試劑盒1、基本原理：該試劑盒采用公司自身研制的相分離技術和DNA制備膜選擇性吸附DNA

的原理從1-10mg新鮮動物組織或2-20mg新鮮植物組織中提取至多20ug純凈的染色體DNA.

2、實驗步驟

樣品收集：100mg新鮮植物葉片，剪刀成小塊，放入研缽中，加入液氮，使植物組織冷凍完全后，快速、用力研磨至粉末狀。研磨時應間斷加入液氮防止組織融化。研磨充分后將研缽放入65℃水浴至樣品粉末剛開始融化。加入700ulG-A溶液和1.2ulRNaseA1貯存液，用力研磨30秒。轉移650ul研磨好的勻漿至2ml離心管中，如體積不到650ul,加bufferG-A溶液至650ul,65℃下保溫15min。加400ulG-B溶液和1mlDV溶液(4℃預冷），用力混勻，12000g離心2min.去上相液體，保留間相和下相溶液。加入1mlDV溶液(4℃預冷），用力混勻，12000g離心2min.去上相液體，將下相溶液轉移至微量濾器(置于2ml離心管中）。12000g離心30秒。2、實驗步驟棄上相，在過濾液中加入400ulDV溶液,混合均勻。將制備管置于2ml離心管中，加入步驟G的樣品。12000g離心30秒。棄濾液，將制備管置于原2ml離心管中,加入500ulWl溶液，12000g離心30秒。棄濾液，將制備管置于原2ml離心管中,加入700ulW2溶液，12000g離心30秒。棄濾液，將制備管置于原2ml離心管中,加入500ulW2溶液，12000g離心1min。將制備管移入新的1.5ml離心管中，在DNA制備膜正中央加100-200μl水或洗脫液，室溫靜置lmin。最高速度離心lmin洗脫DNA。三、細菌基因組DNA提取1、試劑10%SDS蛋白酶K(20mg/ml)氯仿：異戊醇（24：1）;苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）70%乙醇TE,5mol/LNaCl.RNaseA：10mg/mlCTAB/NaCl溶液：4.1gNaCl溶解于80mlH2O中，緩慢加入10gCTAB,加水至100ml.(NaCl:Mr.58;0.8Mol/L)十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)

CTAB是一種陽離子去污劑，具有從低離子強度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性。在這種條件下，蛋白質和中性多聚糖仍留在溶液里。

在高離子強度的溶液里，CTAB與蛋白質和大多數多聚糖(除酸性多聚糖)形成復合物，只是不能沉淀核酸。因此CTAB可以用于從大量產生黏多糖的有機體如植物以及某些革蘭氏陰性菌(包括大腸桿菌的某些株)中制備純化DNA。

CTAB在制備基因組DNA的基本沉淀程序：這種去污劑加入調節至高離子強度(>0.7mol/LNaCl)的細菌或細胞裂解液中。經過連續的酚和氯仿抽提去除CTAB／黏多糖／蛋白質復合物，用異丙醇／無水乙醇沉淀上清即可獲得基因組DNA。CTAB結構式2、實驗步驟：5ml細菌培養過夜，12000rpm離心3分鐘，去上清液。加567ulTE溶液懸浮沉淀，并加30ul10%SDS,3ul蛋白酶K(20mg/ml),混勻，37℃水浴保溫1小時。加100ul的5mol/LNaCl,混勻。加入80ulCTAB/NaCl溶液，混勻，65℃水浴保溫10min.用等體積的苯酚/氯仿/異戊醇抽提，12000rpm離心3分鐘。仔細移取上清液至另一離心管中，加入一倍體積異丙醇，混勻，室溫下放置10min,即出現絮狀DNA沉淀。用勾狀玻璃棒撈出DNA絮團，在70%乙醇中漂洗后在干凈吸水紙上吸干，室溫下干燥后轉入100ul的TE溶液中，DNA很快溶解于TE。保存于-20℃。取2ulDNA樣品在0.7%Agarose膠上電泳，檢測DNA的分子大小。同時取15ul稀釋20倍，測定OD260/OD280，檢測DNA含量及質量。附注如需降解RNA,則在步驟G后加入5ulRNaseA（10ug/ul），37℃保溫30分鐘，除去RNA（RNA對DNA的操作、分析一般無影響，可省略該步驟）。用等體積的苯酚/氯仿/異戊醇抽提，5000rpm離心10分鐘。上清液至另一離心管中，加入1/10體積的3mol/LNaAC及2x體積的冰乙醇，混勻，-20℃放置20分鐘左右，使DNA形成絮狀沉淀。用玻棒撈出DNA沉淀，70%乙醇漂洗，再在干凈吸水紙上吸干。將DNA重新溶解于1mlTE中，-20℃貯存。附:細菌基因組DNA小量制備試劑盒實驗步驟：樣品收集：1ml細菌培養液5000rpm離心3分鐘，用0.8ml細菌原生質體制備緩沖液懸浮沉淀，加20ul溶菌酶貯存液，冰上放置10min.加0.3ml的0.25MEDTA,pH8.0,混合均勻，冰上放置5min。加0.3ml洗脫液，37℃保溫5min.5000rpm離心5min.去上清，加0.1mlS-G溶液，徹底懸浮沉淀，冰浴5min.加0.45ml50℃預熱的G-A溶液，用1ml槍頭快速吸注10次；若太粘稠，則在45℃下保溫5min,再用1ml槍頭快速吸注10次。冰浴5min.加0.15mlG-C溶液，混勻，12000rpm離心1min.將樣品加于微量濾器（置于2ml離心管中），12000rpm離心1min.實驗步驟（續）吸取步驟E中的混合液，轉移到DNA制備管(置于2ml離心管中)，3600rpm離心1min。如制備管中有液體殘留，適當提高離心速度，再離心1min，棄濾液；將制備管置回離心管，加0.5mlWl溶液，3600rpm離心30s，棄濾液；將制備管置回離心管，加0.7mlW2溶液，3600rpm離心30s；以同樣的方法再用0.7mlW2溶液洗滌一次。棄濾液；將制備管置于離心管中，12000rpm離心1min.將制備管移入新的1.5ml離心管中，在DNA制備膜正中央加60μl水或洗脫液，室溫靜置1min。最高速度離心1min洗脫DNA。細菌基因組DNA電源圖真核細胞基因組DNA電源圖III、總RNA的制備一、概述

中心法則:DNAmRNA蛋白質

真核生物mRNA的特點:真核生物的基因中有許多內含子,需要通過RNA的拼接加工,才能成為成熟的mRNA.因此真核生物中提取的mRNA,經反轉錄合成cDNA,進而克隆基因已成為分子生物學最重要的方法之一.

通常一個典型哺乳動物細胞約含10-5ugRNA,但其中大部分為rRNA（28S,18S及5S）和各種低分子量的RNA(tRNA,小核RNA等),只有1-5%為mRNA。這些mRNA的大小和序列不一,

但其3’端有一個poly(A)的結構，它編碼了所有由該細胞合成的多肽。實驗器皿處理

mRNA的分子結構容易受到RNA酶的攻擊反應而降解，加上RNA酶極為穩定而且廣泛存在，因此，在提取過程中應嚴格防止RNA酶的污染并設法抑制其活性，這是實驗成敗的關鍵。人的皮膚、手指、試劑、容器等均可被污染，因此全部實驗過程中均需戴手套操作并經常更換（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2小時以上。凡是不能用高溫烘烤的材料如塑料容器等可用0.1%的焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶液處理，再用蒸餾水沖凈。為了避免mRNA或cDNA吸附在玻璃或塑料器皿管壁上，所有器皿一律需經硅烷化處理。RNA酶抑制劑A.焦碳酸二乙酯（DEPC）:

強烈但不徹底的RNA酶抑制劑。但DEPC能與胺與巰基反應，因而含Tris溶液和DTT的試劑不能用DEPC處理。Tris溶液可用DEPC處理的水配制后、然后高壓滅菌。DEPC與氨水溶液混合會產生致癌物！B.異硫氰酸胍（Guanidiniumisothiocyanate）:

為目前一種最有效的RNA酶抑制劑。它不但具有敗壞細胞結構、核酸從核蛋白質中解離，同時也使RNA酶失活。因此在制備RNA時，緩沖液中常含有異硫氰酸胍。C.其它：釩氧核苷酸復合物（Vanadyl-ribonuclosidecomplex）

RNA酶蛋白抑制制（RNasin）

SDS,尿素等二、試驗方法

細胞內總RNA制備方法很多，如異硫氰酸胍熱苯酚法、酚/SDS法等。許多公司有現成的總RNA提取試劑盒，可快速有效地提取到高質量的總RNA。

酚/SDS法制備總RNA1基本原理：

第一步用酚和SDS破碎細胞和去除蛋白質，第二步用LiCl選擇沉淀RNA以去除DNA和其它不純物。2、試劑勻漿緩沖液：0.18mol/LTris,0.09mol/LLiCl,4.5mmol/LEDTA,1%SDS,pH8.2）TLE：0.2mol/LTris,0.1mol/LLiCl,5mmol/LEDTA,pH8.2經平衡的酚LiCl3mol/LNaAC無水乙醇3、實驗步驟植物組織在液氮中磨成粉末，轉入含150ml勻漿緩沖液和50ml經TLE平衡的酚的500ml燒杯中.勻漿2min，加50ml氯仿，溫和混勻后，50℃放置20min。4℃下10000rpm離心20分鐘.水相部分加50ml經TLE平衡的酚,混勻后加50ml氯仿,混勻4℃下10000rpm離心15分鐘,水相部分用加經TLE平衡的酚抽提直至無界面（一般3次）。水相部分氯仿抽提一次3、實驗步驟(續)水相部分加LiCl至2mol/L,4℃下沉淀過夜。4℃下10000rpm離心20分鐘，用2mol/LLiCl沖洗沉淀用5ml水溶解，加LiCl至2mol/L，4℃下沉淀2小時以上。4℃下10000rpm離心20分鐘，用2mol/LLiCl沖洗沉淀用2ml水溶解，加200ul3mol/LNaAC和5.5ml無水乙醇，-20℃下沉淀過夜4℃下10000rpm離心15分鐘，用1ml水溶解。異硫氰酸胍/酚法制備總RNA1.基本原理異硫氰酸胍(GIT)與β－巰基乙醇共同作用抑制RNase的活性；GIT與十二烷基肌氨酸鈉(Sarcosyl）作用使蛋白質變性，從而釋放RNA；酸性條件下DNA極少發生解離，同蛋白質一起變性被離心下來，RNA則溶于上清中。該法所提RNA純度高完整性好較適合純化mRNA，逆轉錄及構建cDNA文庫。與氯化銫方法比較，雖然純度稍差一些，小分子RNA，如tRNA、snRNA不易去除，但產量高完整性好，鹽易去除。

2.試劑異硫氰酸胍溶液：4mol/L異硫氰酸胍（GIT），25mmol/L檸檬酸鈉（pH7.0）,0.5%十二烷基肌氨酸鈉（Sarcosyl）,0.1Mβ-巰基乙醇（用時再加0.36mL/50mL體系）.2mol/LNaAc（pH4.0）:用醋酸配，加少量水調pH。水飽和酚（pH3.5）氯仿/異戊醇（24：1）異丙醇(－20℃存放)DEPC-H2O（0.1%，V/V）

3、實驗步驟取2g左右植物組織放入研缽中，反復加入液氮充分研磨至粉末狀。加4-5mL異硫氰酸胍溶液。轉移到小離心管中，每管0.5mL。置于冰上，順序加入：50μl2mol/LNaAc,混勻，0.5mL水飽和酚，170μl氯仿/異戊醇，混勻。置冰上15min。4℃,12000g離心20-30min。轉移上清到另一管中，加入等體積的異丙醇，混勻，-20℃沉淀30min-1hr或-80℃沉淀10min。4℃,12000g離心20min回收RNA。3、實驗步驟(續)用70％乙醇洗一次，4℃，12000g離心5min。吸去乙醇，空氣中吹干RNA沉淀。用150μl異硫氰酸胍溶液，65℃吹打RNA沉淀溶解。加等體積異丙醇-20℃沉淀30min-1hr或-80℃沉淀10min。4℃,12000g離心20min回收RNA。用70％乙醇洗兩次后，溶于適量的DEPC-H2O中。部分分裝后進行純度及完整性的檢測。其余加2.5倍體積乙醇沉淀于-80℃冰箱中存放。紫外分光光度分析純度和含量，甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳分析完整性。Trizol法制備總RNA

1.試劑Trizol試劑（含酚、異硫氰酸胍和溶解劑等）75%乙醇：用DEPC處理水配制75%乙醇，（用高溫滅菌器皿配制），然后裝入高溫烘烤的玻璃瓶中，存放于低溫冰箱。

2、實驗步驟將組織在液氮中磨成粉末后，再以50-100mg組織加入1mLTrizol液，注意樣品總體積不能超過所用Trizol體積的10%。研磨液室溫放置5min，然后以每1mLTrizol液加入0.2mL的比例加入氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒。12000g離心10min，取上層水相于一新的離心管，按每mLTrizol液加0.5mL異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置10min，12000g離心10min。棄去上清液，按每mLTrizol液加入至少1mL的比例加入75%乙醇，渦旋混勻，4℃下7500g離心5min。小心棄去上清液，然后室溫或真空干燥5-10min，注意不要干燥過分，否則會降低RNA的溶解度。然后將RNA溶于水中，必要時可55℃-60℃助溶10min。RNA可進行mRNA分離，或貯存于70%乙醇中于-70℃保存。附:總RNA純化試劑盒1)．樣品收集：稱取200mg新鮮植物葉片，水沖凈后用紙巾拭干，剪成碎片，立即浸入液氮，待冷凍完全后邊加液氮邊碾磨(防止樣品融化)，直至組織被碾磨成粉末狀。2）.樣品勻漿：在粉末狀植物組織中加入少量液氮，再加500ulR-A溶液，迅速碾磨至R-A溶液融化。將組織勻漿轉入1.5ml離心管，如有較多組織勻漿殘留在研缽中，加少量R-A溶液，適當勻漿后收集合并到1.5ml離心管.冰浴5min。4℃

，在12000rpm下離心5min.吸取400ul上清轉入另一1.5ml離心管中，測量勻漿體積(體積不足400ul時要加R-A溶液補足).實驗步驟（續）3)．加150ulR-E溶液，蓋緊樣品管，立即用力上下搖晃混合均勻。4).加450u1的4℃預冷的R-C溶液，蓋緊樣品管，立即用力上下搖晃混合均勻，冰浴5min；4℃下，12000rpm離心5min。注意:RNA和少量游離基因組DNA位于下相，蛋白質與基因組DNA復合物形成相間沉淀，殘留的碎片沉淀于離心管底，脂質位于藍色上相。5)．棄藍色上相，取800ul下相轉移至另一離心管中(注意:勿吸取界面和管底沉淀)。加560ul的R-D溶液，蓋緊樣品管，用力上下搖晃混合均勻，冰浴5min。6).4℃下，12000rpm離心10min將RNA沉淀于管底；注意:游離的基因組DNA位于下相，殘留的蛋白質變性析出形成相間沉淀，RNA沉淀于離心管底。7)．倒置離心管,丟棄液相及界面沉淀。簡短離心，仔細吸走殘余液體。實驗步驟（續）

經此步驟純化的總RNA純度已滿足諸如NorthernB1ot、RNA保護測定、體外翻譯等多種RNA分析，而無需作進一步純化(接步驟10）。僅當從富含RNA酶的細胞或組織中提取總RNA，或純化用于RT-PCR分析的RNA樣品，或懷疑RNA樣品中仍含有少量基因組DNA污染時，才進行進一步純化（接步驟8）。

8).加100ulbufferR-A溶液和100ulRNAse-freewater，充分溶解沉淀，混合均。9).加160ul異丙醇，混合均勻，4℃

，12000rpm離心2min。10).棄上清，加500ul4℃預冷的無水乙醇，倒置離心管去液相，短暫離心。仔細吸去殘液，空氣中將乙醇揮發除去。11).加100ulbufferTE充分溶解RNA沉淀,40C，12000rpm離心10min，；；12).將上清轉移到RNase-free的離心管中，置-80℃/-20℃保存待用。IV、mRNA提取一、概述制備mRNA原理

分離的總RNA可利用mRNA3’端含有poly(A)的特點，用oligo(dT)纖維素柱分離，當RNA流經oligo(dT)纖維素柱時，在高鹽緩沖液作用下，mRNA被特異的吸附在oligo(dT)纖維素上，然后逐漸降低鹽濃度洗脫，在低鹽溶液或蒸餾水中，mRNA被洗下。然后經過兩次oligo（dT）纖維素柱，可得到較純的mRNA。純化的mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。

二、試劑2X上樣緩沖液：40mmol/LTris.Cl,pH7.6;1.0Mol/LNaCl;2mmol/LEDTA,pH8.0;0.2%(m/V)十二烷基肌氨酸鈉或SDS.洗脫緩沖液:

10mmol/LTris.Cl,pH7.6;1mmol/LEDTA,pH8.0;0.05%SDS.三、操作步驟用1ml0.1mol/LNaOH懸浮500mgoligo(dT)纖維素.將懸浮液裝入滅菌的一次性層析柱中或裝入填有經DEPC處理并經高壓滅菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，以3個柱體積的滅菌水沖洗柱床。用1X上樣緩沖液沖洗柱床，知道流出液的pH值小于8.0。將提取的總RNA液于65℃溫育5分鐘后迅速冷卻至室溫，加入等體積2X上樣緩沖液，上樣，立即用滅菌試管收集洗出液，當所有RNA溶液進入柱床后，加入1倍柱床體積的1X上樣緩沖液。測定每一管的OD260，當洗出液中OD為0時，加入2~3倍柱床體積的滅菌洗脫緩沖液，以1/3至1/2柱床體積分管收集洗脫液。測定OD260，合并含有RNA的洗脫組分。三、操作步驟(續)加入1/10體積的3mol/LNaAC(pH5.2)、2.5倍體積的冰冷乙醇，混勻，-20℃放置30分鐘。4℃下12000g離心15分鐘，小心棄去上清液，用70%乙醇洗滌沉淀，4℃下12000g離心5分鐘。小心棄去上清液，沉淀空氣干燥10分鐘，或真空干燥10分鐘。用少量水溶解RNA液，即可用于cDNA合成（或保存在70%乙醇中并貯存于-70℃中）。附:RapidmRNAPurificationKit(AmrescoInc.)用rapidmRNAbindingbuffer

懸浮活化的oligo(dT)cellulose取100ul(最多25ug,1/5樣品),在75℃下保溫2min.懸浮活化的oligo(dT)cellulose加100ul的樣品與20uloligo(dT)cellulose混合,冰上放置5min,每一分鐘混勻一次.離心10秒鐘(不要太長!)去上清,加200ulRapidmRNAwashbuffer,混勻.在沉淀前,離心10秒鐘(不要太長!)重復步驟E.去上清,加無RNase的水20ul.混勻后在75℃下保溫30秒鐘在沉淀前,離心10秒鐘(不要太長!),轉上清液到一個新的離心管中.在沉淀中加20ul無RNase的水20ul.混勻后在75℃下保溫30秒鐘.在沉淀前,離心10秒鐘(不要太長!)合并步驟H和步驟I得到的上清液.保存于-80℃冰箱.V、瓊脂糖凝膠電泳(I)、DNA凝膠電泳

一、概述

瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳是分離和純化DNA片段的標準方法。

聚丙烯酰胺凝膠電泳主要分離小片段DNA(5-500bp),其分辨力極高，甚至可分開相差1bp的DNA片段。

瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段大小范圍較廣，不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長度從200bp至近50kb的DNA片段。實驗室中常規實驗，一般用瓊脂糖水平凝膠電泳裝置進行DNA電泳。

瓊脂糖凝膠電泳儀聚丙烯酰胺凝膠電泳儀二、瓊脂糖凝膠電泳特性1．DNA分子大?。壕€性DNA分子在一定瓊脂糖濃度內的遷移率與DNA分子量的對數成反比。2．瓊脂糖濃度：小于0.5kb的DNA片段所需的凝膠濃度為1.2-1.5%;分離大于10kb的DNA片段所需的凝膠濃度為0.3-0.7%;DNA片段大小在兩者之間的所需的凝膠濃度為0.8-1.0%。

分離不同大小DNA片段的合適瓊脂糖凝膠濃度瓊脂糖（%）分離DNA片段的有效范圍（kb)0.51-300.70.8-121.00.5-101.20.4-71.50.2-3

在0.5XTBE緩沖液中，溴酚蘭相當于300bpDNA,二甲苯氰FF相當于4000bpDNA.二、瓊脂糖凝膠電泳特性3、DNA分子構象：對相同分子量的質粒DNA的三種構象，超螺旋DNA移動最快，而線狀雙鏈DNA移動最慢。4．電源電壓：在低電壓時，線性DNA片段的移動速率與所加電壓成正比，但電壓增高，不同分子量的DNA片段的移動速率將以不同幅度增加；片段越大，升高的幅度也越大。因此電壓增高，瓊脂糖有效分離范圍將縮小。一般所加電壓不得超過5V/cm.5．染料：溴化乙啶（EB），它可嵌入堆積的堿基對之間，在紫外燈下發熒光，檢測DNA的下限可達1-10ng。注意：EB是強誘變劑！6、離子強度：在沒有離子強度時，DNA幾乎不移動，在高離子強度下，則電導很高并明顯產熱，嚴重時會引起凝膠熔化或DNA變性。常見的電泳緩沖液為0.5xTBE及0.5xTAE,尤其前者更為常見。三、試劑：1、5TBE緩沖液：Tris.54g,硼酸27.5g,加入20ml

的0.5mol/LEDTA(pH8.0),定溶至1000ml.2、6上樣緩沖液：0.25%溴酚蘭,40%(w/v)蔗糖水溶液。3、溴化乙啶（EB）溶液母液：將EB配制成10mg/L，用鋁箔或黑紙包裹容器，儲于溫室即可。4、DNA分子量標準：

DNA/EcoRI/HindIII:

DNA/EcoRI:21.2,7.4,5.8,5.6,4.9和2.5kb。

DNA/HindIII:23.1,9.4,6.6,4.4,2.3,2.0,0.56和0.12kb.四、實驗步驟1、稀釋緩沖液的制備：用蒸餾水將5TBE緩沖液配制成0.5TBE稀釋緩沖液.2、膠液的制備：稱取0.4g瓊脂糖，置于200ml三角燒瓶中，進入50ml的0.5TBE稀釋緩沖液，放入微波爐或電爐加熱至瓊脂糖全部熔化，取出混勻。3、膠板的制備：將二端封閉的電泳槽置于水平支持物上，插上樣品梳子。在冷卻至50-60℃的瓊脂糖膠液中加入EB溶液至終濃度為0.5g/ml,即10mg/ml的母液加2.5ul，混勻。小心地倒入電泳槽中至一定高度。待膠液完全凝固后拔出梳子。然后向槽內加0.5TBE稀釋緩沖液至液面剛好沒過膠板表面。四、實驗步驟4、加樣：取2-5l樣品加1l的6上樣緩沖液，用移液槍混勻（在Parafilm膜上操作），小心加到樣品槽中。同時加DNA分子量標準對照。5、電泳：從負極到正極，60-80V,電流40mA以上。當溴酚蘭條帶移動至距凝膠前沿約2cm

時，停止電泳。6、觀察和拍照：在波長為254nm的紫外燈下，觀察DNA電泳帶并估計其分子量大小。同時可用加紅色濾光片和近攝鏡片的相機拍照（光圈

5.6下暴光10-120秒）。(II)、RNA凝膠電泳一、概述

RNA分子有很多二級結構，需經變性劑處理，可以破壞RNA中的二級結構。然后，用瓊脂糖凝膠電泳可分級分離不同大小的mRNA分子。常用的RNA瓊脂糖凝膠電泳方法有三種:乙二醛變性電泳、甲醛變性電泳和羥甲基汞瓊變性電泳。二、RNA甲醛變性電泳1、材料:5XMOPS電泳緩沖液：20.9gMOPS(0.1mol/L),pH7.0;8.3ml3mol/LNaAC(40mmol/L);10.0ml0.5mol/LEDTA(5mmol/L)pH8.0,用水定容至1L.以上藥品和水均需用DEPC處理。10x甲醛上樣緩沖液：1mmol/LEDTA,pH8.0;0.25%溴酚藍，0.25%二甲苯藍，50%甘油).37%甲醛（pH大于4.0，12.3mol/L）;甲酰胺;10mg/ml溴化乙錠.以上藥品和水均需用DEPC處理。2、實驗步驟膠的制備：1.5g瓊脂糖加115ml水，加熱融化。冷卻至60℃時加30ml的5XMOPS電泳緩沖液(終濃度為1X);加5ml甲醛（瓊脂糖終濃度為1%）。制膠。樣品制備：

RNA(最多30ug)5.5ul5XMOPS電泳緩沖液2.0ul

甲醛3.5ul

甲酰胺10ul

在65℃下處理15min,然后置冰上。加樣品前，先用5v/cm電壓電泳5分鐘。制備好的樣品短暫離心后加10X上樣緩沖液2ul，混勻。上樣。2、實驗步驟（續）在1XMOPS電泳緩沖液中電泳2-3小時。在電泳1-2小時后，可混合正負極緩沖液，再繼續電泳。染色：將電泳好的膠板轉移至含0.5ug/L溴化乙錠的0.1mmol/LNH4AC溶液中染色30-40min.（溴化乙錠也可以在電泳前加于樣品中）注意：RNA大于1kb,用1%瓊脂糖；RNA小于1kb,用1.4%瓊脂糖。28SRNA分子量為6333；18SRNA分子量為2366.三、RNA羥甲基汞變性電泳1、試劑：瓊脂糖

羥基甲汞1ｘ羥甲基汞瓊脂糖凝膠電泳緩沖液（50mmol/L硼酸，5mmol/LNa2B4O7·H2O，10mmol/LNaSO4，pH8.1）2ｘ羥甲基汞凝膠上樣緩沖液（1mol/L羥甲基汞25ul，4ｘ羥甲基汞凝膠電泳緩沖液500ul，甘油200ul，溴酚藍2ug，H2O275ul）10mg/ml溴化乙錠10mol/L乙酸銨２、實驗步驟將1%（RNA>1kb）或1.4%(RNA<1kb)的瓊脂糖溶于1x羥甲基汞瓊脂糖凝膠電泳緩沖液中，待溶液冷卻至55℃時加入羥甲基汞至終濃度為5mmol/L.將