第五章穩定同位素示蹤技術

第一節穩定同位素示蹤原理第二節穩定性核素15N的測定方法第三節15N示蹤技術在農業生物學中的應用第一節穩定同位素示蹤原理

一、穩定同位素、豐度和原子百分超

穩定同位素

原子核結構是穩定的，不會自發地放出射線而使核結構發生改變的同位素。

豐度

某種同位素的原子數在該元素總的原子數中所占的百分數。通常以原子百分數表示。例如：

15N

15N+14N

自然物質中某元素的同位素豐度稱為自然豐度或天然豐度。×10015N原子%=

元素

同位素

自然相對豐度（%）

樣品來源H1H2H（D）99.9850.0147

新鮮的表面淡水C12C13C98.8921.108

捷克特波利茲石灰石N14N15N99.6350.365

大氣中的氮氣

O16O17O18O99.7590.03740.2039

大氣中的氧氣幾種化學元素的穩定同位素

原子百分超

某一同位素豐度與自然豐度之差稱為同位素的原子百分超。

將15N濃縮到自然豐度的10倍，其原子百分超是多少？

3.65%-0.365%=3.285%

在實際測定中，應該采用對照組生物樣品的自然豐度。

二、穩定同位素示蹤的基本原理和特點

（一）基本原理

1.自然界中一種元素的同位素組成（自然豐度）是相對恒定的。

2.元素的同位素具有相同的化學性質。

3.同一元素的同位素間存在質量差異。

（二）穩定同位素示蹤法的特點

優點:

1.無放射性；

2.操作安全，對人無輻射損傷；

3.不污染環境，試驗范圍不受限制；

4.試驗周期不受限制；

5.可以代替某些元素的放射性同位素難以進行的示蹤試驗。

局限性:

1.標記化合物偏高;2.樣品制備復雜;3.所需的儀器如質譜儀比較昂貴。

第二節穩定同位素15N的測定方法

同位素射線種類半衰期自然豐度(原子%)

12N

13N

14N

15N

16N

17N

18Nβ+

β+βββ0.011s9.96min7.1s4.15s0.63s99.6350.365氮元素的同位素

一、15N豐度的選擇

不同豐度的15N標記化合物價格差異比較大，因此，在試驗允許情況下，盡可能應用低豐度的。15N豐度的選擇主要考慮兩個因素：

1.試驗中15N被普通N稀釋的程度；

2.15N分析儀器的精確度。/product/

二、15N示蹤試驗的布置

一般采用微區試驗。

三、15N測樣的制備

測定15N的質譜儀對測樣的要求是以簡單的分子態進行。

具體制備過程如下：

1.將樣品中的標記氮轉化成銨

用凱氏法將含氮樣品在增溫劑和催化劑的參與下，用濃硫酸消煮，使其中所含的各種形態的氮轉化為氨，與硫酸結合形成硫酸銨，然后加堿蒸餾，使氨吸收在硼酸溶液中，用標準酸測定樣品的全氮量。

一般用硫酸鉀、硫酸銅和硒粉組成的混合催化劑，三者的質量比為100：10：1。

2.將銨轉化成氨氣

在高真空氣化裝置中，用堿性次溴酸鈉將銨氧化而產生氮氣，其反應式：

2NH4++3NaBrON2↑+5H2O+3NaBr

四、質譜法測定15N豐度

（一）質譜儀器的工作原理

利用電磁學原理，使帶電粒子按照質荷比進行分離，從而測定其質量的分析儀器。MAT253型同位素比值質譜儀為德國Finnigan公司制造，可以精確測量13C、15N、18O、34S和H/D的相對同位素豐度。最多有10個積分通道用于多種離子流的同時測量。

FlashEA1112型元素分析儀與MAT253型同位素比值質譜儀聯機（EA-C(ConFloIII)-IRMS）可以在線測定固體(或液體)樣品的C、N同位素組成。

穩定同位素質譜儀

DELTAplusAdvantage美國

菲尼根質譜公司

主要指標

質量范圍：1-70Dalton（道爾頓）at3KV

分辨率（m/Dm）：=95（C、N、O、S）

精密度：優于0.2‰（C、N、O、S）

V電離室出口縫·R1R2M1M2出口加速電壓

1/2M1v12=eV（1）

M1v12

R1

根據上述兩式可得：=eHv1(2）M1e=R12H122V

如帶電粒子的電荷數以電子所帶的電量為單位，則上式可改寫成：

或：R=(3)M1e=R12H12V4.82×10-5144HMVe

(3)式表示了磁式質譜儀的工作原理，從中可得到如下結論：

1.在加速電壓V不變的情況下，可以通過連續改變磁場強度H而得到同一R而不同M的掃描質譜圖，此即為磁掃描。

2.在磁場強度H不變的情況下（永磁鐵），可以通過改變加速電壓而得到同一R而不同M的掃描質譜圖，此即為電壓掃描。（二）15N質譜分析的計算公式

1.質譜峰的選擇

氮分子經電離后產生質量不同的離子：

離子種類質荷比

[15N15N]+30[15N14N]+29

[14N14N]+28

[15N]+和[15N15N]++15[15N14N]++14.5[14N]+和[14N14N]++14

通常選用質荷比為28，29，30的峰。當樣品中的15N豐度小于5%時，質荷比為30的峰高比28，29的小得多（？），只能測量質荷比為28和29峰的離子強度進行計算。

2.計算公式

設：

R=

質荷比為28的離子強度質荷比為29的離子強度同位素質譜儀euro-03

又設：全部氮原子中14N占的比例為p，而15N的為q；則p+q=1。由此可得：（p+q）2=p2+2pq+q2

其中：p2為質荷比為28的離子數目；

2pq為質荷比為29的離子數目。也即：R==(4)p22pqp2q

15N

14N+15N

==(5)

（5）式就是通用的以同位素離子強度比計算15N原子數的公式。×10015N原子%=qp+q×10012R+1×100第三節穩定同位素示蹤技術應用

一、作物的氮營養及代謝運轉研究

加藤忠司等應用(15NH4)2SO4

及K15NO3研究大豆對N素的吸收、分配及運轉規律，結果表明：作為基肥施用的銨態氮的吸收率相當低，只有27%；然而在開花前追肥的吸收率可達68%。

硝態氮的吸收率以始花期追肥者為最高，達91%，其后減少。追肥的N肥在收獲期有85%分配籽實中，積累在豆株各部位的N素隨著籽實的膨大而進行再分配，從夾伸長期到籽實肥大期，葉柄的N素最先開始運轉。

Kunio等應用13C標記13CO2

及15NO2的雙標記技術研究水稻植株從頂葉到根對C和N的吸收及轉移規律。結果表明：C和N從葉到根的運轉中，13C從喂飼葉運轉到其它器官需1天；15N通過喂飼葉片在幾小時內迅速運轉。15N進入成熟根后再運轉至新根及鞘中，大量15N從葉運輸到根后，最后累積于新根中。

二、土壤肥料研究

此類試驗常用以說明土壤、肥料與植物營養的關系，須得到以下數據：

1.試樣的總含氮量和15N原子百分超；

2.施入15N標記肥料的總氮量；

3.標記肥料的15N原子百分超；

4.試樣的干重、肥料用量、供試土壤量。

例如：在應用15N的盆栽試驗中，每盆裝土1千克，供試作用為大麥，標記肥料為15NH415NO3，15N豐度為5.365%，施肥量為100mg氮/盆（相當于200kg氮/公頃），出苗后生長6周沿表土割下植株地上部，將根系從土壤中取出，用噴霧器細水沖冼根，洗下的水回到原盆栽盆中，再加入一定量的水使其呈泥漿，定其容積，并在充分攪拌后取100ml泥漿。

試樣測定項目

15N豐度（%）3.5973.5470.45415N原子百分超（%）3.2273.1770.084N%（全氮百分含量）4.571.310.19

質量（g）1.160.741000N的數量（mg/盆）53.09.71900地上部分根系土壤表1：試驗所得數據（一）植物中來自肥料及土壤氮的百分數

植物中來自肥料氮：NDFF%

（nitrogenderivedfromfertilizer）

植物中來自土壤氮：NDFS%

（nitrogenderivedfromsoil）

NDFF%=×100NDFS%=1–NDFF%植物樣品中15N原子百分超肥料中15N原子百分超地上部：NDFF%=

×100=64.5%NDFS%=1-64.5%=35.5%根系：NDFF%=

×100=63.5%NDFS%=1-63.5%=36.5%土壤：NDFF%=

×100=1.68%NDFS%=1-64.5%=98.32%3.22753.17750.0845

(二)“A”值

“A”的概念是假定土壤中的某一營養物質（如氮）有兩個來源，一個是土壤中固有的營養物質（土壤氮）即“A”，另一為已知數量的施入土壤的營養物質（肥料氮），而用作物對兩個來源的氮吸收幾率相等。也即：

“A”

值NDFS%

施肥量（公斤氮/公頃）NDFF%=

“A”值=×施肥量（公斤氮/公頃）由表1可得：

地上部：

×200（公斤氮/公頃）

=110（公斤氮/公頃）

“A”值可用于評價土壤肥力狀況，定量地評定同土壤有效養分水平密切相關的因素。NDFS%NDFF%35.5%63.5%(三)肥料氮素利用率

肥料氮素利用率

=

NDFF%×植物全氮量（kg/公頃）施氮量（kg/公頃）肥料氮素利用率%(地上部)

=

=34.19%肥料氮素利用率%(根系)

=

=6.20%64.5%

×53mg/盆100mg/盆63.5%

×9.7mg/盆100mg/盆三、環境科學研究

一個研究實例

珠江三角洲鉛及相關重金屬的污染源和污染程度的評估資料來源：常向陽等，元素-同位素示蹤在環境科學研究中的應用，廣州大學學報(自然科學版)Vol.1No.13,2002年5月。研究背景鉛對人體具有多方面的毒性，可導致智力低下、造血機能障礙、高血壓、腎病等[1]。大氣鉛污染是對人體健康危害十分嚴重的無機污染；它主要來自汽油燃燒產生的汽車尾氣和工業用鉛。科學家已對鉛的污染源和污染程度進行了大量鉛同位素示蹤研究，鉛同位素示蹤已成為追蹤污染源和評價污染程度的有效方法。[1]孟金萍等，鉛的生物學毒性效應,《中國比較醫學雜志