水處理生物學實驗實驗要求上課準時、不得無故缺席，實驗報告要及時上交。實驗期間不得大聲喧嘩、服從老師的安排、注意安全。實驗器材專人專用，對儀器要愛護，損壞實行賠償制度。維護好實驗室的環境衛生，實行值日生制度。實驗報告要求統一用A4紙手寫實驗報告封面格式

1、實驗課程名稱

2、實驗項目名稱

3、學生所在的專業、班級、姓名、學號

4、實驗日期

5、同組者姓名實驗報告格式

1、實驗目的

2、實驗原理

3、實驗儀器、溶液試劑

4、實驗步驟

5、實驗結果（如繪圖、列表等）

6、思考題實

驗

內

容顯微鏡的使用及酵母菌、曝氣池中微生物等形態觀察放線菌、霉菌的形態觀察油鏡的使用、細菌的單染色和革蘭氏染色微生物大小測定、顯微鏡直接計數法培養基的制備及滅菌水體中細菌總數測定與大腸菌群生理生化反應實驗一（一）顯微鏡的構造、性能和使用方法一、目的要求了解普通光學顯微鏡的構造、基本原理、維護和保養的方法學習并掌握普通光學顯微鏡的正確使用方法二、顯微鏡的基本結構（一）機械裝置鏡座鏡臂鏡筒：單筒和雙筒兩種物鏡轉換器載物臺載物臺轉移器調焦裝置粗調節器細調節器（二）光學系統接目鏡（目鏡）接物鏡（物鏡）低倍鏡（10×）高倍鏡（40×）油鏡（100×）聚光鏡虹彩光圈反光鏡增加顯微鏡的分辨率顯微鏡的放大倍數=物鏡放大倍數×目鏡放大倍數顯微鏡的分辨率：顯微鏡能辨別兩點之間的最小距離的能力。

D=λ/2NA=λ/2n·sin(α/2)D：分辨率NA：物鏡的數值孔徑值：可見光的波長（平均0.55m)n:物鏡和被檢標本間介質的折射率：鏡口角（即入射角）四、顯微鏡的使用方法觀察前的準備顯微鏡的安置光源調節根據個人情況，調節雙筒顯微鏡的目鏡右眼看清調節左目鏡的視度調節圈扳動鏡管，調節至瞳孔間距顯微觀察低倍鏡觀察高倍鏡觀察（同焦現象）油鏡觀察在待觀察的樣品區域滴加香柏油，從側面注視，用粗調節器將鏡筒小心地降下，使油鏡浸在鏡油中。顯微鏡用畢后的處理上升鏡筒，取下載玻片；用擦鏡紙拭去鏡頭上的鏡油，然后用擦鏡紙沾取少量二甲苯擦去鏡頭上殘留的油跡，最后用干凈的擦鏡紙擦去殘留的二甲苯；用擦鏡紙清潔物鏡及目鏡，用綢布清潔顯微鏡的金屬部件；將鏡體各部分復原。

五、思考題使用顯微鏡時哪些地方須特別？二、酵母菌、曝氣池中微生物等形態觀察

目的要求觀察酵母菌的形態及出芽生殖方式；學習區分酵母菌死活細胞的實驗方法；觀察曝氣池中的微生物形態基本原理美藍是一種無毒性染料.氧化型呈現藍色,還原型呈現無色.用美藍對酵母的活細胞進行染色,代謝活力強的細胞具有較強的還原能力,能使美藍由藍色的氧化型變為無色的還原型.因此,具有還原能力的酵母活細胞為無色,死細胞或代謝能力弱的衰老細胞為藍色.實驗器材菌種紅酵母啤酒酵母曝氣池活性污泥混合液溶液或試劑

0.1%呂氏堿性美藍染色液儀器或其他用具顯微鏡，蓋玻片，載玻片，濾紙，擦鏡紙。（一）酵母菌的形態觀察及死活細胞的鑒別制片在載玻片中央加一滴0.1%美藍→取菌少許→混勻→蓋上蓋玻片→靜置3min或0.5h觀察用高倍鏡觀察酵母的形態和出芽生殖根據顏色鑒別死活細胞活細胞：無色；死細胞：藍色（二）曝氣池中微生物的形態觀察在載玻片中央加一滴活性污泥曝氣池混合液→打散混勻→蓋上蓋玻片→低倍鏡觀察→高倍鏡觀察→繪出所觀察到的微生物形態實驗結果繪圖說明你所觀察到的酵母菌的形態特征。分別繪出你在低倍鏡、高倍鏡觀察到的菌膠團、原生動物、藻類等的基本形態。呂氏堿性美藍染色液作用時間不同，對酵母菌死細胞數量有何影響？試分析其原因。思考題實驗二、放線菌、霉菌的形態觀察目的要求學習并掌握觀察放線菌、霉菌形態的基本方法；初步了解放線菌的形態特征；了解四類常見霉菌的基本形態特征。實驗器材菌種細黃鏈霉菌，曲霉、青霉、根霉、毛霉培養基高氏Ⅰ號瓊脂培養基察氏瓊脂培養基溶液或試劑0.1%美藍染色液，乳酸石碳酸棉藍染色液,50%乙醇儀器或其他用具顯微鏡，蓋玻片，載玻片，接種環，解剖針等。扦片法倒平板→取孢子劃線接種→無菌操作將滅菌的蓋玻片以大約45℃扦在接種線上→28℃倒置培養3-5d→取培養后的蓋玻片直接鏡檢或用0.1%美藍對蓋玻片染色后觀察觀察基內菌絲、氣生菌絲、孢子絲的卷曲狀況，以及分生孢子的形狀，并繪圖說明。（一）放線菌的形態觀察（二）霉菌的形態觀察直接制片觀察法在載玻片中央加一滴乳酸石炭酸棉藍染色液；用解剖針挑取少量已產孢子的霉菌菌絲，先用50％乙醇洗去脫落的孢子，再放在載玻片的染液中(青霉、曲霉取菌絲時需連同培養基一起挑取)；用解剖針小心分散菌絲，蓋上蓋玻片；置低倍鏡或高倍鏡下觀察。繪圖說明四種霉菌的形態特征(有無橫隔)。根霉：假根、匍匐菌絲、孢囊梗、孢子囊及孢子囊孢子毛霉：菌絲、孢囊梗、孢子囊及孢子囊孢子青霉：菌絲、分生孢子梗、帚狀分支小梗及分生孢子曲霉：菌絲、足細胞、分生孢子梗、初生小梗、次生小梗、頂囊、分生孢子實驗結果繪圖說明你所觀察到的放線菌和霉菌的形態特征。思考題鏡檢時，你如何區分放線菌的基內菌絲和氣生菌絲？你主要根據哪些形態特征來區分四種不同的霉菌？實驗三油鏡的使用、細菌的單染色及革蘭氏染色（一)、油鏡的工作原理增加照明強度當光線由反光鏡通過玻片與鏡頭之間的空氣時，由于空氣與玻片的密度不同，有些光線會因折射或全反射，不能進入鏡頭，降低了視野的照明度；若中間的介質是一層油（其折射率與玻片的相近），則幾乎不發生折射，增加了視野的進光量，從而使物象更加清晰。增加顯微鏡的分辨率：

D=λ/2NA=λ/2n·sin(α/2)D：分辨率NA：物鏡的數值孔徑值：可見光的波長（平均0.55m)n:物鏡和被檢標本間介質的折射率：鏡口角（即入射角）顯微觀察低倍鏡觀察高倍鏡觀察油鏡觀察在待觀察的樣品區域滴加香柏油，從側面注視，用粗調節器將鏡筒小心地降下，使油鏡浸在鏡油中。顯微鏡用畢后的處理上升鏡筒，取下載玻片；用擦鏡紙拭去鏡頭上的鏡油，然后用擦鏡紙沾取少量乙醇乙醚洗液擦去鏡頭上殘留的油跡，最后用干凈的擦鏡紙擦去殘留的乙醇乙醚洗液；用擦鏡紙清潔物鏡及目鏡，用綢布清潔顯微鏡的金屬部件；將鏡體各部分復原。

（二）簡單染色法目的要求學習微生物涂片、染色的基本技術，掌握細菌的簡單染色法；初步認識細菌的形態特征；鞏固顯微鏡（油鏡）的使用方法和無菌操作技術。基本原理借助物理因素（如：細胞及細胞物質對染料的毛細現象、滲透、吸附作用等）和化學因素（如：正負離子之間的相互吸引等）的作用而進行的。實驗器材菌種大腸桿菌約24h營養瓊脂斜面培養物枯草芽孢桿菌12-18h營養瓊脂斜面培養物藤黃八疊球菌約24h營養瓊脂斜面培養物染色劑草酸銨結晶紫染液番紅染液儀器或其他用具顯微鏡、酒精燈、載玻片、接種環、無菌水等。操作步驟涂片干燥固定染色鏡檢水洗干燥實驗結果根據觀察結果，繪出細菌形態圖。思考題你認為在制備細菌染色標本時，尤其應該注意哪些環節？為什么要求制片完全干燥后才能用油鏡觀察？如果你的涂片未經加熱固定，將會出現什么問題？如果加熱溫度過高、時間太長，又會怎樣呢？（三）革蘭氏染色法目的要求學習并初步掌握革蘭氏染色法；了解革蘭氏染色法的原理及其在細菌分類鑒定中的重要性。實驗器材菌種枯草芽孢桿菌12-18h營養瓊脂斜面培養物大腸桿菌約24h營養瓊脂斜面培養物藤黃八疊球菌約24h營養瓊脂斜面培養物染色劑草酸銨結晶紫染液盧戈氏碘液95%乙醇番紅染色液儀器或其他用具顯微鏡、酒精燈、載玻片、接種環、無菌水等。操作步驟藤黃八疊菌純培養的鏡下形態（革蘭氏染色）大腸桿菌純培養的鏡下形態（革蘭氏染色）實驗結果列表說明你所觀察到的細菌形狀、顏色和革蘭氏染色反應。思考題你認為哪些環節會影響革蘭氏染色結果的正確性？其中最關鍵的環節是什么？現有一株細菌寬度明顯大于大腸桿菌的粗壯桿菌，請你鑒定其革蘭氏染色反應。你怎樣運用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為對照菌株進行涂片染色，以證明你的染色結果正確性。你認為革蘭氏染色中，哪一個步驟可以省去而不影響最終結果？在什么情況下可以采用？實驗五

微生物大小的測定、顯微鏡直接計數法目的要求學習并掌握用測微尺測定微生物大小的方法明確血細胞球計數板計數的原理。掌握使用血細胞計數板進行微生物計數的方法。實驗原理鏡臺測微尺為中央部分刻有精確等分線的載玻片，將1mm等分100格，每格長0.01mm。只用于校正目鏡測微尺。目鏡測微尺是可放入目鏡內的圓形小玻片，精確等分50小格或100小格。由于不同顯微鏡或不同目鏡和物鏡組合放大倍數不同，目鏡測微尺每小格所代表的實際長度也不一樣。因此，測量前需先用鏡臺測微尺進行校正。

球菌以直徑表示大??；桿菌用寬×長表示。實驗器材菌種：啤酒酵母儀器：顯微鏡、目鏡測微尺、鏡臺測微尺、血球計數板（一）酵母菌大小的測定安裝目鏡測微尺校正目鏡測微尺將鏡臺測微尺刻度面朝上放在顯微鏡載物臺上。分別在低、高倍鏡、油鏡下用鏡臺測微尺校正目鏡測微尺計算鏡臺測微尺：將1mm等分為100小格，每小格長0.01mm（即10μm）。目鏡測微尺每格長度（μm）=（兩重合線間鏡臺測微尺格數×10）/兩重合線間目鏡測微尺格數菌體大小測定取下鏡臺測微尺，換上酵母菌水浸片，在高倍鏡下測定酵母菌的長和寬。選擇有代表性的10個細胞進行測定，取平均值。實驗結果記錄1）將目鏡測微尺校正結果填入下表接目鏡放大倍數：——接物鏡接物鏡倍數目鏡測微尺格數鏡臺測微尺格數目鏡測微尺每格代表的長度/um低倍鏡高倍鏡油鏡2）將啤酒酵母測定結果填入下表測定次數目鏡測微尺每格代表的長度/um寬長菌體大小范圍/um目鏡測微尺格數寬度/um目鏡測微尺格數長度/um12345678910（二）酵母菌的顯微鏡直接計數血球計數板的構造血球計數板是一塊特制的載玻片，其上由4條槽構成3個平臺；中間較寬的平臺又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺上各有一個方格網。每個方格網共分9個大方格，中間的大方格即為計數室。計數室的刻度有兩種規格：一種是一個大方格分成16個中方格，而每個中方格又分成25個小方格；另一種是一個大方格分成25個中方格，而每個中方格又分成16個小方格。但無論哪種規格，每個大方格都由400個小方格組成。每個大方格邊長為1mm，則每個大方格的面積為1mm2，蓋上蓋玻片后，蓋玻片與載玻片之間的高度為0.1mm，所以計數室的容積為0.1mm3。制備適當濃度的菌懸液取潔凈的血球計數板蓋上蓋玻片靜置5分鐘用高倍鏡計數加樣品設5個中方格的總菌數為A，菌液稀釋倍數為B計數板為25個中方格：1ml菌液的總菌數=A/5×25×104×B計數板為16個中方格：1ml菌液的總菌數=A/5×16×104×B注意事項取樣時先要搖勻菌液；加樣時計數室不可有氣泡；一般樣品稀釋度要求每小格內約有5-10個菌體為宜；每個計數室選5個中格（4個角和中央）計數；位于格線上的菌體一般數上不數下，數右不數左；若芽體大小達到母細胞的一半，則作為兩個菌體計數。血球計數板使用完畢，用水沖洗干凈，切勿用硬物洗刷，以免損壞網格刻度；洗凈后自行晾干或吹風機吹干。實驗結果測定你所制備的樣品的含菌量。A表示五個中方格中的總菌數；B表示菌液稀釋倍數各中格中菌數

A

B二室平均值菌數/um12345第一室第二室思考題為什么更換不同放大倍數的目鏡或物鏡時，必須用鏡臺測微尺重新對目鏡測微尺進行校正？在不改變目鏡和目鏡測微尺，而改用不同放大倍數的物鏡來測定同一細菌的大小時，其測定結果是否相同？為什么？根據你的體會，說明用血細胞計數板計數的誤差主要來自哪些方面？應如何盡量減少誤差、力求準確？實驗五

培養基的制備與滅菌一、培養基的制備目的要求明確培養基的配制原理通過對基礎培養基的配制，掌握配制培養基的一般方法和步驟按培養基的用途分基礎培養基鑒別培養基選擇培養基按培養基的物理狀態分固體培養基半固體培養基液體培養基按成分不同分天然培養基合成培養基半合成培養基基本原理四種培養基的配方牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基（一種天然培養基，用于分離和培養細菌）

配方：牛肉膏3g蛋白胨10g氯化鈉5g瓊脂20g水1000mlpH7.2-7.4滅菌121℃20min

乳糖蛋白胨培養液（一種液體培養基，用于大腸菌群的生理生化鑒定）配方：牛肉膏3g

乳糖5g

氯化鈉5g

蛋白胨10g

水1000ml1.6％溴甲酚紫乙醇溶液1ml

先將藥品溶解于1升水中，后調pH7.2～7.4，加入1.6％溴甲酚紫乙醇溶液1ml，充分混勻，分裝入有小倒管的試管中，115℃20min滅菌產硫化氫培養基，一種半合成培養基，用于腸道細菌的生理生化鑒定。配方：檸檬酸鐵胺4g蛋白胨20g氯化鈉5g

硫代硫酸鈉

0.5g瓊脂20g水1000mlpH7.2滅菌115℃15min

伊紅美蘭培養基（一種鑒別培養基，用于大腸菌群的生理生化鑒定）配方：磷酸氫二鉀2g

乳糖10g

蛋白胨10g

瓊脂20g

水1000ml2％伊紅水溶液20ml0.5％美藍水溶液13mlpH7.2～7.4

滅菌115℃20min器材溶液或試劑

4mol/LNaOH，1mol/LHCl，牛肉膏蛋白胨培養基、乳糖蛋白胨培養液、產硫化氫培養基的配方藥品。儀器或其他用具

試管，三角瓶，搪瓷杯，量筒，天平，藥匙，電磁爐，高壓蒸氣滅菌鍋，pH試紙(pH5.5～9.0)，硅膠塞，棉花，報紙，記號筆等。操作步驟（一）1．計算：根據配方按照用量計算。2.稱量：3．溶解：如有瓊脂，要不斷攪拌避免糊底。4、調節pH：用1mol/LNaOH或1mol/LHCl調節，以pH試紙或pH計測定。5．過濾：趁熱用四層紗布過濾。

操作步驟（二）6.分裝試管：固體不超過試管高度的1/5；液體、半固體不超過試管高度的1/4或1/3。三角燒瓶：總體積的一半為限。管口或瓶口不得沾有培養基操作步驟（三）7.加塞1.正確；2.管內部分太短，外部太松；3.外部過小操作步驟（三）8.包扎：注明培養基的名稱。9.滅菌

：按各自培養基滅菌的溫度、時間滅菌。10.擱置斜面

(1/3～l/2，不能超過1/2)。11.無菌檢查了解幾種滅菌方法，掌握干熱滅菌法和加壓蒸汽滅菌法的原理及其使用方法。

目的要求二、消毒與滅菌

滅菌是指殺死一切微生物的營養體，芽孢和孢子。消毒則指消滅病原菌和有害微生物的營養體，因而只是部分滅菌。消毒與滅菌的方法很多，一般可分為加熱、過濾、照射和使用化學藥品等方法。

基本原理干熱滅菌火焰灼燒法干熱滅菌法（烘箱內熱空氣滅菌法）濕熱滅菌法加壓蒸汽滅菌法紫外線滅菌法微孔濾膜過濾除菌火焰灼燒法直接在火焰上灼燒滅菌主要用于實驗室接種針(環)、試管口、三角瓶口和金屬小工具等的滅菌。干熱滅菌法設備：電熱烘箱適用于耐高溫器皿，160-170℃，維持2小時注意事項：溫度不可超過180℃，以防玻璃器皿上的棉塞及包裝紙烤焦著火。滅菌時物品不宜堆放得太緊，以免妨礙空氣流通。滅菌物品不要接觸電烘箱內壁的鐵板，以防包裝紙烤焦起火。電烘箱內溫度＜70℃時，方可打開箱門，以免驟然降溫導致玻璃器皿炸裂。2.濕熱滅菌(一）高壓蒸汽滅菌法：是將物品放在高壓蒸汽滅菌鍋內0.1MPa，121℃保持15～30min進行滅菌，從而導致菌體蛋白質凝固變性而達到滅菌的目的。時間的長短可根據滅菌物品種類和數量的不同而有所變化，以達到徹底滅菌為準。此法適用于培養基、工作服、橡皮物品等的滅菌，也可用于玻璃器皿的滅菌。在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大。原因一：濕熱中細菌菌體吸收水分，蛋白質較易凝固，因蛋白質含水量增加，所需凝固溫度降低。

卵白蛋白含水量/%30分鐘內凝固所需溫度/℃50562574~801880~9061450160~170蛋白質含水量與凝固所需溫度的關系原因二：濕熱的穿透力比干熱大。原因三：濕熱的蒸氣有潛熱存在。間歇滅菌法：

應用于不易于高壓蒸汽滅菌的培養基如明膠培養基、牛乳培養基、含糖培養基等。此法是用阿諾氏流動蒸汽滅菌器進行滅菌，每天加熱100℃30min、連續三天，可徹底滅菌。煮沸消毒法：注射器和解剖器械等可用煮沸消毒法。一般煮沸消毒時間為10～15min。超高溫殺菌：

此法指在溫度和時間標準分別為135～150℃和2～8s的條件下對牛乳或其他液態食品進行處理的一種工藝。2.濕熱滅菌(二）高壓蒸汽滅菌法（以手提式高壓蒸汽滅菌鍋為例）

操作步驟（三）全自動數顯立式高壓蒸汽滅菌鍋1.裝鍋先向外層鍋內加入適量的水，放入內鍋，裝入待滅菌物品。2.加蓋將蓋上的排氣軟管插入內層滅菌鍋的排氣槽內。再以兩兩對稱的方式同時旋緊相對的兩個螺栓，勿使漏氣。3.滅菌加熱，并同時打開排氣閥，待冷空氣完全排盡后，關上排氣閥，升溫至l21℃時維持15~20min。4.降溫取物

滅菌結束后，切斷電源，當壓力表的壓力降至0時，打開排氣閥，開蓋取物。操作步驟（三）加壓蒸汽滅菌法0.1MPa，121℃，20min滅菌注意事項：切勿忘記加水，加水量不可過少，以防滅菌鍋燒干而引起炸裂事故。鍋內冷空氣必須完全排盡后，才能關上排氣閥，維持所需壓力。壓力一定要降到“0”時，才能打開排氣閥，開蓋取物。滅菌全程必須有人看守。紫外線滅菌法適用于無菌室、接種箱、手術室內的空氣及物體表面的滅菌。紫外線燈距照射物以不超過1.2m為宜。若紫外線照射與3%~5%的石炭酸溶液或2%~3%的來蘇爾等化學消毒劑結合使用，可加強滅菌效果。注意事項：紫外線對眼結膜及視神經有損傷作用，對皮膚有刺激作用，故不能直視紫外線燈光，更不能在紫外線燈光下工作。過濾除菌法適用于不耐熱的液體物質（如維生素、血清、酶等熱敏性物質）。濾膜孔徑：≤0.22μm缺點：無法去除培養液中的病毒和噬菌體。思考題培養基配好后，為什么必須立即滅菌？如何檢查滅菌后的培養基是無菌的？在配制培養基的操作過程中應注意哪些問題？為什么？為什么干熱滅菌比濕熱滅菌所需的溫度高，時間長？請設計干熱滅菌和濕熱滅菌效果比較方案。在高壓蒸氣滅菌開始之前，為什么要將鍋內冷空氣排盡？滅菌完畢后，為什么待壓力降低“0”時才能打開排氣閥，開蓋取物？實驗六水體中細菌總數測定與大腸菌群生理生化反應（一）水體中細菌總數測定目的要求1.了解水樣的采取方法2.應用平板菌落計數法測定水樣細菌總數基本原理

通過將樣品制成均勻的一系列不同稀釋度的稀釋液（使樣品中的微生物細胞充分分散，成單個細胞在），再取一定量的稀釋液接種，使其均勻分布于培養皿中特定的選擇性培養基內，最后根據在平板上長出的菌落數計算出每克或每毫升樣品中的微生物數量。實驗器材菌種：大腸桿菌菌懸液培養基：牛肉膏蛋白胨培養基儀器或其他用具：1mL無菌吸管，無菌平皿，盛有4.5mL無菌水的試管、吸耳球、培養箱等。操作步驟（一）水樣的采集（了解）1.自來水：水龍頭火焰灼燒3min→放水5min→用滅菌三角瓶接水→分析2.池水、河水或湖水：將滅菌的帶玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水面下10-15cm處→翻轉過來，除去玻璃塞→取水→蓋好瓶塞，取出→冰箱中保存或立即檢查操作步驟（二)細菌總數測定（兩種方法）傾注法（本次實驗采用）涂布法1.編號：取無菌平皿9個，分別表明10－3、10-4、10-5（稀釋度）各三套。另取無菌水5支，依次標明10－1、10-2、10－3、10-4、10-510-310-410-5原樣10-110-210-310-410-50.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.2ml0.2ml0.2ml2.稀釋:放菌液時吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只接觸一個稀釋度。3.取樣4.倒平板：倒入融化后冷卻至45℃的培養基15ml，置水平位置迅速旋動平皿，使培養基與菌液混合均勻。5.培養：37℃倒置培養18～24h實驗結果記錄稀釋度10-310-410-5平板123123123菌落數平均菌落數計算方法細菌總數（個/ml）書P363稀釋度選擇及菌落總數報告方法例次不同稀釋度的平均菌落數兩個稀釋度菌落數之比值菌落總數(個/ml)報告方式(個/ml)10-110-21