基因工程概論

參考教材

1.基因與基因工程的定義2.基因工程的理論基礎3.基因工程的技術基礎及誕生4.基因工程技術的發展5.基因工程的研究內容6.基因工程的應用和面臨問題主要內容第一章導論1.基因與基因工程的定義★

基因：核酸分子中含有特定遺傳信息的一段核苷酸序列，是遺傳物質的最小功能單位。

按照是否能轉錄、翻譯分類：

轉錄、翻譯蛋白質

轉錄、不翻譯反義RNA等

不轉錄、不翻譯調控序列如：操縱基因

孟德爾：生物每一個性狀都是通過遺傳因子來傳遞的，遺傳因子是一些獨立的遺傳單位。1940s：“一個基因一種酶”的假說，認為基因對性狀的控制是通過基因控制酶的合成來實現的。（多個基因一個酶，一個基因多個酶）RNA基因的發現：

ribozymes,

microRNA等；RNA基因組的發現

Amodernworkingdefinitionofageneis"a

locatableregion

of

genomic

sequence,correspondingtoaunitofinheritance,whichisassociatedwithregulatoryregions,transcribedregions,andorotherfunctionalsequenceregions

基因工程：在體外對不同生物的遺傳物質（基因）進行剪切、重組、連接，然后插入到載體分子中（細菌質粒、病毒或噬菌體DNA)，轉入微生物、植物或動物細胞內進行無性繁殖，并使之行使正常功能和穩定遺傳，從而構建出新的物種或菌株的遺傳學技術。

按照工程學的方法設計和操作DNA，形成新的組合，并能引入新的宿主中行使功能，克服了基因信息在生物物種之間的固有限制。Geneticengineeringaltersthegeneticmakeupofanorganismusingtechniquesthatremove

heritable

materialorthatintroduceDNApreparedoutsidetheorganismeitherdirectlyintothehostorintoacellthatisthen

fused

orhybridized

withthehost.

1.基因與基因工程的定義2.基因工程的理論基礎3.基因工程的技術基礎及誕生4.基因工程技術的發展5.基因工程的研究內容6.基因工程的應用和面臨問題主要內容2.基因操作技術建立的理論基礎理論基礎（19世紀后期到20世紀50s初）2.1確定了蛋白質是生命活動的主要基礎物質2.2確定了生物遺傳的物質基礎是DNA

1952年Hershey和Chase利用同位素標記的噬菌體轉染實驗進一步證實，傳遞遺傳信息的是DNA而不是蛋白質。赫爾希也由于這一研究而榮獲1969年的諾貝爾醫學生理學獎。1944年，Avery等人發表了"脫氧核糖型的核酸是III型肺炎球菌轉化要素的基本單位“,即DNA是細菌的轉化因子，第一次證明了DNA是遺傳物質。肺炎雙球菌轉化實驗噬菌體轉染實驗★肺炎雙球菌轉化實驗1928年,Griffith設計的實驗：

光滑型菌株注入小鼠體內：死亡粗糙型菌株注入小鼠體內：無害光滑型菌株加熱殺死后，再注入小鼠體內：無害殺死的光滑型菌株與粗糙型菌株一起注入小鼠體內：死亡說明被殺死的光滑型菌株含有某種因子，它進入了粗糙型菌株中將它轉化成了致死的光滑型菌株，但沒有證明這種因子是什么物質。

1934年，Avery實驗從加熱殺死的光滑型菌株中提取DNA，然后將除去了蛋白質的DNA與粗糙型菌株混合后，再注入小鼠體內：死亡。說明帶有有毒性的和能使莢膜形成的信息分子DNA整合進了無毒菌株的染色體里，使它轉化成了有毒的菌株。實驗證明了Griffith所說的轉化因子就是DNA。理論基礎（20世紀50s初～60s）2.3DNA雙螺旋結構模型的建立

1953年，Watson和Crick在《自然》雜志上發表DNA雙螺旋結構的論文，并發現了DNA的復制機理。1958年諾貝爾獎

2.4遺傳信息傳遞中心法則的建立

從1961年開始，以Nirenberg等為代表的一批科學家，確定遺傳信息是以密碼方式傳遞的，每三個核苷酸組成一個密碼子，代表一種氨基酸。到1966年全部破譯了64個密碼，編排了一個震驚世界的密碼字典，闡述了中心法則，提出的遺傳信息流是DNA→RNA→蛋白質。2.5對蛋白質結構與功能的進一步認識

1956-58年Anfinsen和White根據對酶蛋白的變性和復性實驗，提出蛋白質的三維空間結構是由其氨基酸序列來確定的原則2.基因操作技術建立的理論基礎1.基因與基因工程的定義2.基因工程的理論基礎3.基因工程的技術基礎及誕生4.基因工程技術的發展5.基因工程的研究內容6.基因工程的應用和面臨問題主要內容3.1限制性內切酶（restrictionenzymes）1968年第一個限制酶EcoK馬特·梅索森1970年H.O.Smith等分離出第一種限制性核酸內切酶WernerArber理論預見限制酶DanielNathans用限制酶切得SV40DNA片斷HamiltonO.Smith得到第一個限制酶1978年Nobel生理與醫學獎3.基因工程的技術基礎和誕生★3.2DNA連接酶（ligase）1967年MartinGellert從大腸桿菌中發現DNA連接酶3.3載體（vector）1972年前后使用小分子量的細菌質粒和噬菌體作載體，在細菌細胞里的大量擴增。3.4感受態體系1970年M.Mandel和A.Higa發現經過氯化鈣處理的大腸桿菌容易吸收噬菌體DNA。1972年S.Cohen發現這種處理過的細菌同樣能吸收質粒DNA。3.5瓊脂糖凝膠電泳1960s發明了瓊脂糖凝膠電泳，可將不同長度的DNA分離開。1980年Nobel化學獎1972年斯坦福大學的PaulBerg小組完成了首次體外重組實驗：將SV-40病毒DNA與噬菌體P22DNA

片斷連接起來。1.Berg的開創性實驗基因工程的誕生★構筑了第一個重組的DNA分子，這意味著生物體的遺傳性狀可以人為地改造2.Boyer-Cohen實驗1973年斯坦福大學的S.Cohen小組將含有卡那霉素抗性基因的大腸桿菌R6-5質粒與含有四環素抗性基因的另一種大腸桿菌質粒pSC101連接成重組質粒，具有雙重抗藥性。后來又把非洲爪蟾核糖體基因片斷同pSC101質粒重組，轉化大腸桿菌，并在菌體內成功轉錄出相應的mRNA。這是第一次成功的應用質粒進行外源基因克隆與表達實驗，打破了基因的物種界限。StanleyCohen1986Nobel生理醫學獎（和此無關）HerbBoyerBoyer-Cohen實驗R6-51976年，Boyer與斯旺遜共同組建了Genentech公司，促進了基因工程的發展：1977年該公司成功實現了在大腸桿菌中表達人類蛋白質——生長激素抑制素的成就，首次實現在其他物種中表達人類蛋白質，具有里程碑意義。

1978年，公司又成功生產出人胰島素1979年生長素1980年干擾素1.基因與基因工程的定義2.基因工程的理論基礎3.基因工程的技術基礎及誕生4.基因工程技術的發展5.基因工程的研究內容6.基因工程的應用和面臨問題主要內容4.基因操作技術的發展☆1975年，DNA測序技術

F.Sanger、A.Maxam和W.Gilbert發明了DNA快速測序技術1975～1981各種印跡技術（DNA、RNA、蛋白質）1980年：顯微注射培育出第一個轉基因動物：轉基因小鼠1983年：農桿菌介導培育出第一例轉基因植物：轉基因煙草1980年Nobel化學獎1983年，PCR技術美國人KaryB.Mullis發明PCR儀，建立了DNA體外擴增技術。1987年發表了“SpecificsynthesisofDNAinvitroviaapolymerase-catalyzedchainreaction”，于1993年獲諾貝爾化學獎。1987年，基因敲除技術

Thompsson首次建立了完整的胚胎干細胞基因敲除的小鼠模型。直到現在，運用基因同源重組進行基因敲除依然是構建基因敲除動物模型中最普遍的使用方法。

1992年，基因芯片技術

Affymatrix公司Fodor領導的小組運用半導體照相平板技術，對原位合成制備的DNA芯片作了首次報道，這是世界上第一塊基因芯片。1995年，Stanford大學的P.Brown實驗室發明了第一塊以玻璃為載體的基因微矩陣芯片。標志著基因芯片技術進入了廣泛研究和應用的時期。LIC（LigationIndependentCloning)技術基因組編輯技術4.基因操作技術的發展1.基因與基因工程的定義2.基因工程的理論基礎3.基因工程的技術基礎及誕生4.基因工程技術的發展5.基因工程的研究內容6.基因工程的應用和面臨問題主要內容5.基因操作的研究內容

5.1基礎研究

(1)克隆、表達載體開發：原核、真核微生物的克隆載體；Ti質粒及其衍生載體（植物基因工程）；動物病毒克隆載體（動物基因工程）；構建新載體（適于高等動植物轉基因表達載體和定位整合載體），應大力發展。簡化操作，提高克隆和表達效率（2）受體系統：

克隆載體的宿主：外源目的基因表達場所

原核,如大腸桿菌，早期的藍藻

真核單細胞生物如酵母菌。人和高等動、植物復雜基因組文庫的受體系統

小球藻和衣藻，高等植物受體（愈傷組織、細胞和原生質體、部分組織和器官），雙子葉植物擬南芥、煙草，單子葉植物水稻、玉米等。

動物體細胞再分化能力差，主要是生殖細胞或胚細胞受體，已獲轉基因鼠、魚等。

人體細胞受體。轉基因細胞系作病理研究，以異常生長細胞作受體，通過轉基因使其回復正常生長狀態（基因治療）。

擴展基因操作的對象（3）目的基因

開發人們特殊需要的基因，即目的基因（優良性狀的基因、致病基因）。發達國家激烈競爭的焦點，有限的戰略性資源，可申請新基因專利。

自然界調取，構建基因組文庫或cDNA文庫；PCR直接從某生物基因組擴增；DNA改組通過人工進化獲取新基因；人工設計與合成已獲目的基因大致種類：與醫藥相關的基因；抗病、蟲害和惡劣環境的基因；編碼特殊營養價值的蛋白或多肽基因等。

2008年發現一種粉紅粘帚霉能將纖維素變成生物燃料，成分與柴油等燃料相似粉紅粘帚霉排出的氣體大部分都是碳氫化合物，其中至少有8種化合物是柴油中最豐富的成分

基因組：某種生物的全部基因：

1990年開始實施“人類基因組計劃”，2000年6月已繪制“工作框架圖”。意義：人生長、發育、繁殖，遺傳性疾病的病因（基因治療），優生優育。（P6)“水稻基因組計劃”：中國水稻（秈稻）基因組“工作框架圖”和數據庫已完成。中、英兩國合作“家豬基因組計劃”。

（4）工具酶

指體外進行DNA合成、切割、修飾和連接等系列過程中所需要的酶（DNA聚合酶、限制性核酸內切酶、修飾酶和連接酶等）。

限制性核酸內切酶：有規律地切割DNA，獲得特定末端的DNA片段。研究熱點：耐熱內切酶和長識別序列稀切酶。

DNA連接酶、重組酶

DNA聚合酶：人工合成序列、引物等DNA小片段以及含基因的較大的DNA片段，制備DNA探針。已發現的多種耐熱性DNA聚合酶有Taq、Tth、Bst、Pwo、pfu等。

DNA修飾酶：修飾DNA分子的有甲基化酶，修飾末端的有堿性磷酸酯酶、轉移酶、核酸外切酶等。5.2新技術開發：

基因導入技術：一系列用于不同類型受體細胞的DNA轉化方法和病毒轉導方法；基因槍、電激儀等克服了某些克隆載體應用的物種局限性，提高外源DNA轉化的效率。

基因的檢測技術：放射性同位素標記探針，非放射性標記DNA探針和熒光探針技術。

基因分離技術：凝膠電泳可分開幾萬堿基的DNA分子或DNA片段；脈沖電泳能分開上百萬堿基的DNA分子或片段或完整的染色體。

DNA分子連接技術：多片段一步克隆法無痕修飾技術：沒有任何多余的序列殘留在DNA上基因組編輯技術：同源重組和非同源重組，新型人工核酸酶

☆1.基因與基因工程的定義2.基因工程的理論基礎3.基因工程的技術基礎及誕生4.基因工程技術的發展5.基因工程的研究內容6.基因工程的應用和面臨問題主要內容

藥物(活性肽、疫苗等）、診斷與治療(見下表）生物基化學品、酶工業、發酵工業（生物乙醇、有機酸等)

環保（降解廢、毒物等）農業、食品（抗逆、抗病蟲害、性狀改良的轉基因農作物等）觀賞娛樂6.基因操作技術的應用和問題

☆在美國