第六章常用分子生物學技術蔡衛斌生物化學教研室caiwb@第一節分子雜交技術具有互補序列兩條單鏈核酸分子在一定條件下按堿基互補配對原則退火形成雙鏈的過程。雜交的雙方是待測核酸和已知核酸序列，已知核酸序列稱探針。在某些理化因素作用下，DNA雙鏈解開成兩條單鏈的過程。雙鏈間氫鍵的斷裂！2、DNA變性的本質1、DNA變性的概念核酸分子雜交(nucleicacidhybridization)在DNA復性過程中，如果把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對關系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈(heteroduplex)

。變性復性

DNA-DNA雜交雙鏈分子核酸分子雜交探針技術探針(probe)

一小段用同位素、生物素或熒光染料標標記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸，與固定在NC膜上的核苷酸結合，判斷是否有同源的核酸分子存在。一、Southern印跡此技術由Southern1975年首先設計。被檢測對象為DNA。帶有DNA片段的凝膠DNA分子限制片段限制性酶切割瓊脂糖電泳至膜（尼龍膜或硝酸纖維素濾膜）上轉膜雜交、顯影凝膠濾膜用緩沖液轉移DNA吸附有DNA片段的膜Southern印跡雜交的技術流程從凝膠上轉移DNA二、Northern印跡應用DNA探針檢測特異mRNA的一種雜交技術，主要用于分析mRNA的轉錄或mRNA分子大小。其方法類似于Southern印跡雜交。三、Western印跡將待檢測蛋白質（或酶）經SDS電泳并染色后，轉移到濾膜上固定，再用“抗體-抗原”免疫反應或“DNA-protein”結合反應鑒別濾膜上的蛋白質。三種

印跡比較1.DNA印跡技術(Southernblotting)檢測DNA2.RNA印跡技術(Northernblotting)檢測RNA3.蛋白質的印跡分析(Westernblotting)檢測蛋白質三種印跡技術的比較四、原位雜交(insituhybridization)1、定義：

將標記探針與細胞或組織中核酸按堿基配對原則進行特異性雜交，并應用組織化學或免疫組織化學方法在顯微鏡下進行細胞內定位或基因表達的檢測技術稱原位雜交（hybridizationinsitu)。

2、操作步驟：

載片的清潔與處理；組織與細胞的固定；探針；濕盒熒光原位雜交五、生物芯片chip生物芯片（biochip）是近年來在生命科學領域中迅速發展起來的一項高新技術。是將核酸、多肽或蛋白質分子、組織切片和細胞等制成探針，以預先設計的方式有序地、高密度地排列在玻片或硅片等載體上，構成二維分子陣列，然后與待測生物樣品靶分子雜交，通過檢測雜交信號實現快速、高效和高通量樣品檢測。因該技術常用玻片或硅片等材料作為固相支持物，且在制備過程中模擬計算機芯片的制備技術，所以稱之為生物芯片。其原理也是分子雜交技術。微型化高通量—提高信息量平行化—提高信息的可比性微量化—降低待檢樣品用量自動化—提高工作效率低成本—可迅速普及推廣生物芯片技術的特點生物芯片使用步驟芯片制作把探針固定于載體表面樣品處理目標分子富集分子間的雜交結果檢測與數據分析生物芯片分類（1）基因芯片（2）蛋白質芯片（3）細胞芯片（4）組織芯片基因芯片概念：基因芯片，也叫DNA芯片，是將大量特定序列的DNA片段（分子探針）有序地固定在經過處理后的尼龍膜、玻璃片、硅片等支持物上，從而能快速、準確地對大量DNA分子序列進行測定和分析的一種類似電腦的芯片。原理：利用堿基的互補配對原則（DNA分子雜交）材料：分子探針，尼龍膜，玻璃片，硅片1、基因芯片制作基因芯片的大致步驟可在基因組水平進行基因表達和發現研究、突變、序列測定等，已方泛應用于基因組研究和人類疾病的診斷等多領域。基因芯片應用應用基因微矩陣芯片研究宮頸癌相關基因表達DNA微點陣已廣泛和流行的用于疾病診斷、基因組比較、以及新型癌癥的分類。2、蛋白質芯片蛋白質芯片（proteinchip）,又稱蛋白質微陣列，是指以蛋白質或多肽作為配基，將其有序地固定在固相載體的表面形成微陣列；用標記了熒光的蛋白質或其它分子與之作用，洗去未結合的成分，經熒光掃描等檢測方式測定芯片上各點的熒光強度，來分析蛋白質之間或蛋白質與其它分子之間的相互作用關系。蛋白質芯片技術在醫學中的應用特異性抗原抗體的檢測生化反應的檢測疾病診斷對疾病分子機制的研究藥物篩選及新藥的研制開發3、細胞芯片又稱細胞微陣列，是以活細胞為研究對象的一種生物芯片，在芯片上完成對細胞的捕獲、固定、平衡、運輸、刺激及培養的精確控制，并通過微型化的化學分析方法，實現對細胞樣品的高通量、多參數、連續原位信號檢測和細胞組分的理化分析等。

4、組織芯片組織芯片,又稱組織微陣列，是將不同生物體的組織按預先設計或研究需要排列在固相載體上所形成的組織微陣列。組織芯片最大的優勢在于可以對大量組織標本同時進行檢測，只需一次實驗過程即可完成，縮短時間，減少誤差，提高了可比性。

第二節目的基因制備技術一、聚合酶鏈式反應（PCR）

概念

聚合酶鏈反應（polymerasechainreaction，PCR）是一種體外擴增特異DNA片斷的技術,能在短時間內獲得數百萬個特異DNA序列的拷貝。（一）PCR技術簡史DNA的復制核酸體外擴增的設想聚合酶鏈反應的發明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解鏈酶DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長PCR技術簡史DNA的復制核酸體外擴增的設想聚合酶鏈反應的發明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長GGAUCG5‘AUCGCG5‘引物酶引物酶RNA引物RNA引物PCR技術簡史DNA的復制核酸體外擴增的設想聚合酶鏈反應的發明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長GGAUCG5‘AUCGCG5‘TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’DNA聚合酶DNA聚合酶PCR技術簡史DNA的復制核酸體外擴增的設想聚合酶鏈反應的發明1971年，Khorana提出：經過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復該過程便可克隆tRNA基因。但由于測序和引物合成的困難，以及70年代基因工程技術的發明使克隆基因成為可能，所以，Khorana的設想被人們遺忘了……PCR技術簡史DNA的復制核酸體外擴增的設想聚合酶鏈反應的發明1985年，美國PE-Cetus公司的Mullis等人發明了聚合酶鏈反應（PCR）基本原理是在試管中模擬細胞內的DNA復制最初采用E-coliDNA聚合酶進行PCR耐熱DNA聚合酶的應用，隨后PE-Cetus公司推出了第一臺PCR自動化熱循環儀1993年，Mullis等因此項技術獲諾貝爾化學獎KaryMullis“我不大喜歡動手,我寧肯不動手,我不喜歡做費力的事。作為一個發明家,重要的一點是為解決某些問題而盡力設計一個簡捷的動手方案。”1、PCR擴增DNA片段的原理

PCR是在模板DNA、引物和四中脫氧核苷酸等存在的情況下，DNA聚合酶依賴的酶促合成反應，整個擴增過程分三步：（二）PCR技術的基本原理和操作①

變性：加熱，模板DNA形成兩條單鏈②退火：降溫，模板單鏈DNA與引物配對結合③延伸：在DNA聚合酶及鎂離子等存在的條件下，引物3'-端向前延伸，合成與模板配對的新鏈

上述三步為一個循環，經過一個循環DNA量增加一倍。新合成的鏈又可以成為新一輪循環的模板，經過25-30個循環后目的DNA就可以擴增106~109倍。通過循環可以提高PCR的特異性。1）模板DNA2）特異性引物3）耐熱DNA聚合酶4）dNTPs5）Mg2+6）緩沖液2、PCR的基本成份模板DNA95℃3、PCR的基本操作PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點72℃第1輪結束95℃第2輪開始PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點72℃第2輪結束是不是循環次數越多越好？PCR擴增的平臺效應引物設計（1)序列應位于高度保守區，與非擴增區無同源序列。（2）引物長度以15-40bp為宜。（3）堿基盡可能隨機分布。（4）引物內部避免形成二級結構。（5）兩引物間避免有互補序列。（6）引物3’端為關鍵堿基；5’端無嚴格限制PCR技術的優點特異性強靈敏度高操作簡單、省時對待檢原始材料質量要求低高效率的基因擴增技術引物引物3’5’5’5’基因組PCR技術的特點：擴增特異的DNA片段1、目的基因的克隆2、基因的體外突變3、DNA和RNA的微量分析4、DNA序列測定5、基因突變分析（三）PCR的主要應用實時PCR技術原理逆轉錄PCR（RT-PCR）以細胞內總RNA或mRNA為材料進行體外擴增的技術。主要用于克隆cDNA、合成cDNA探針，檢測RNA病毒、分析基因表達等逆轉錄生成cDNA方式：以隨機進行的PCR擴增所需的下游引物作為逆轉錄反應的引物以oligo(dT)作為引物，mRNA3`末端polyA尾與之互補以人工合成的隨機序列六核苷酸混合物作為引物，進行擴增。reversetranscription逆轉錄酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈PCR擴增二、cDNA文庫cDNAlibrary一個生物體的基因組DNA用限制性內切酶部分酶切后，將酶切片段插入到載體DNA分子中，所有這些插入了基因組DNA片段的載體分子的集合體，將包含這個生物體的整個基因組，也就是構成了這個生物體的基因文庫(genelibrary)。

cDNA文庫是以特定的組織或細胞mRNA為模板，逆轉錄形成的互補DNA（cDNA）與適當的載體（常用噬菌體或質粒載體）連接后轉化受體菌形成重組DNA克隆群，這樣包含著細胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合稱為該組織或細胞的cDNA文庫。

cDNA文庫具有組織或細胞特異性。

cDNA文庫顯然比基因組DNA文庫小得多，能夠比較容易從中篩選克隆得到細胞特異表達的基因。（一）從cDNA文庫建立基因組DNA文庫1）制備靶基因的核酸探針2）若靶基因表達蛋白已知，可反推部分基因序列，制備寡核苷酸探針3）差異顯示雜交（二）cDNA文庫目的基因的篩選

利用核酸分子雜交分離目的基因：差異顯示雜交不需要核苷酸序列信息，而耍擁有兩種不同的細胞群體：目的基因正常表達細胞群和在基因不表達細胞群。制備兩種不同mRNA提取物，一是含有目的基因mRNA的總mRNA群體，一是不含有目的基因mRNA種的總mRNA群體。因此，可以通過這兩種總mRNA(或是它們的cDNA拷貝)為探針的平行雜交，對由表達目的基因的細胞總mRNA構建的克隆庫進行篩選。當使用存在目的基因的mRNA探針時，所有包含著重組體的菌落都呈陽性反應，在x光底片上呈現黑色斑點，而使用不存在目的基因的mRNA探針時，除了含有目的基因的菌落外，其余的所有菌落都呈陽性反應，在x光底片上呈現黑色斑點。比較這兩種底片井對照原平板，便可以挑選出含目的基因的菌落。1）在基因組水平上研究某基因對器官、組織和細胞在個體發育中的影響2）cDNA文庫的篩選比較簡單易行，尤其適用于某些特殊組織基因的制備3）由于每一個cDNA克隆都包含一種mRNA序列，這樣在篩選中出現假陽性的概率就會很低4）為了測定mRNA序列，利用它的cDNA拷貝序列就可以有效分析外顯子的基因結構（三）cDNA文庫的優越性由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列。三、化學合成化學合成法主要應用作為核酸分子雜交探針作為引物，用于測序和PCR用于制備小的基因、不易獲得基因或用于改造天然基因作為DNA末端改造中的接頭用于制備cDNA，篩選克隆基因，或基因定位或基因的定點突變第三節基因敲除技術基因敲除（gene

knock

out）又稱基因剔除，或基因打靶

（gene

targeting）是指通過DNA定點同源重組，定向改變基因組中的某一特定基因，使機體特定基因失活或缺失，從而研究此基因的功能的一種分子生物學技術。由于胚胎干細胞的這種特殊性，ES細胞基因打靶技術已被廣泛地應用于建立轉基因動物之中。從80年代到90年代初，小鼠ES細胞基因打靶技術已發展到成熟階段。1984年，Bradly等成功地用顯微注射法將ES細胞移入囊胚腔，并移植回假孕母鼠，獲得生殖系嵌合體，再適當交配，獲得源于ES細胞系純系小鼠。基因敲除的發展歷程此實驗首次證實體外培養的ES細胞能在體內分化發育成生殖系嵌合體并可獲得小鼠純合體子代。1987年，人們利用ES細胞技術建立了次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(hprt)基因敲除(Geneknockout)的動物模型。轉抗凝血酶素VⅢ基因、轉β-干擾素基因羊。如何敲除其胰島素基因，成為糖病模型？猴的基因編碼與人類只有1%的差別，通過轉基因猴，可以研究各種疾病對人的影響，并開發出相應的治療方法。如引進老年性癡呆病的基因，加快針對這種疾病疫苗的開發研究。還可引進糖尿病、乳腺癌、帕金森氏癥等基因，為人類最終戰勝社些疾病提供幫助。一、基因敲除的一般原理利用胚胎干細胞進行基因敲除。1）構建常規基因敲除載體，載體中的外源基因與靶基因高度同源，且被修飾和改造；2）敲除載體質粒導入胚胎干細胞；3）篩選發生同源重組的陽性胚胎干細胞；4）通過顯微注射將陽性胚胎干細胞導入胚囊；5）轉入假孕雌鼠子宮；6）獲得嵌合體小鼠。發生在同源序列間的重組稱為同源重組(homologousrecombination)，又稱基本重組（generalrecombination）。通過鏈的斷裂和再連接，在兩個DNA分子同源序列間進行單鏈或雙鏈片段的交換。同源重組是最基本的DNA重組方式Holliday模型的4個關鍵步驟：兩個同源染色體DNA排列整齊；一個DNA的一條鏈斷裂、并與另一個DNA對應的鏈連接，形成Holliday中間體；通過分支移動產生異源雙鏈DNA；Holliday中間體切開并修復，形成兩個雙鏈重組體DNA，分別為：

內切酶

(recBCD)DNA侵擾(recA)分支遷移

(recA)

內切酶(recBCD)

DNA

連接酶5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′3′3′5′3′5′3′3′5′5′3′5′3′5′3′Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′5′5′3′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′內切酶(ruvC)內切酶(ruvC)

DNA連接酶

DNA連接酶片段重組體拼接重組體

knock-out

：thegeneofinterestisdisrupted

同源重組抗性選擇RBDT-ADT-Ahpt△EnLBWaxy重組整合Waxyhpt△EnWaxy×重組intron1表達載體受體基因組打靶結果基因打靶（genetargeting）二、基因敲除載體構建獲得目的基因的同源片段，即5`-臂和3`-臂。打靶載體的選擇性標記基因質粒篩選抗性基因：AmpR，KanR陽性篩選基因表達：轉染后的細胞存活，最多見Neo陰性篩選基因表達：轉染后的細胞死亡，DTA，HSV-TK1、插入性載體(gene-insertion

vector)：插入型載體中與靶基因同源的區段中含有特異的酶切位點，線性化后，同源重組導致基因組序列的重復，從而干擾了目標基因的功能。基因敲除載體類型獲得目的基因的同源片段，即5`-臂和3`-臂。2、置換型載體(gene-replacement

vector)：斷裂位點位于同源序列區域的外側或兩側，選擇基因位于同源目的序列內部或外側。基因重組時以載體的同源序列取代染色體靶位序列，載體DNA

同源目的序列與染色體靶位點進行兩次同源重組。目前，大多數基因敲除都采用置換型載體。取代型（a）或插入型（b）載體三、基因敲除載體導入ES細胞1、ES細胞的獲得現在基因敲除一般采用是胚胎干細胞，最常用的是鼠，而兔，豬，雞等的胚胎干細胞也有使用。常用的鼠的種系是129及其雜合體，因為這類小鼠具有自發突變形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的傾向，是基因敲除的理想實驗動物。而其他遺傳背景的胚胎干細胞系也逐漸被發展應用。ES能在體外培養，保留發育的全能性！常用于基因敲除的靶細胞是小鼠ES細胞。導入方式有顯微注射法、電穿孔法、精子載體法和逆轉錄病毒法等，目前應用較多的是電穿孔法。

2、重組DNA導入ES（1）顯微注射法(Microinjectiontechnique)顯微鏡下，用一根極細的玻璃針（直徑1-2微米）直接將DNA注射到胚胎的細胞核內，再把注射過DNA的胚胎移植到動物體內，使之發育成正常的幼仔。用這種方法生產的動物約有10%是整合外源基因的轉基因動物。缺點：一次只能轉一個細胞（2）電穿孔法在高壓電場的短暫作用下，細胞膜上可出現可逆的孔洞，外源DNA可通過此孔洞進入胞內。雖然轉染效率低于顯微注射法，但可以大量細胞轉染，便于篩選，方法穩定，目前應用最多。（3）DNA-磷酸鈣共沉淀法將DNA與CaCl溶液混合，再緩慢滴加入含有磷酸的HEPES溶液中，形成DNA-磷酸鈣共沉淀顆粒。小心地將顆粒加入到培養的靶細胞表面，保溫數小時后，使DNA被靶細胞攝取。（4）DEAE-右旋糖苷法該法先用來促進病毒DNA導入，后來發展為一種哺乳動物細胞的基因轉移方法。方法：用外源DNA和DEAE-右旋糖酶的混合物處理細胞。常用于克隆化基因的瞬間表達，不用于細胞的穩定轉化。（5）逆轉錄病毒載體逆轉錄病毒是一種RNA病毒，基因大小為3-10kb。不同于其它病毒，它具有二倍體基因，即含有兩個相同的RNA分子，有典型的真核mRNA結構（包括帽子和尾巴）。缺點：片段不能太長四、篩選與鑒定由于基因轉移的同源重組自然發生率極低，動物的重組概率為10-2～10-5。因此如何從眾多細胞中篩出真正發生了同源重組的胚胎干細胞非常重要。目前常用的方法是正負篩選法（PNS法，Positive-NegativeScreening），標記基因的特異位點表達法以及PCR法。應用最多的是PNS法。正負雙向篩選系統：（

positive

and

negative

selection，PNS），PNS采用置換型載

體，該載體含有正負選擇基因各一個，正向選擇基因多為neo基因，插入載體的同源序列中；負向選擇基因常用DTA基因，置于同源序列的外側。同源重

組時，載體的同源區發生重組，同源區以外部分將被切除，所以在同源重組時，DTA基因將被切除而丟失。而在隨機整合時，所有序列均保留。

1、正負篩選法（PNS）1）在隨機插入的情況下，如果有DTA表達，DTA可以直接殺死細胞。2）在同源重組時，細胞對

G418有抗性，隨機整合時只對G418有抗性。3）未進行任何方式整合的細胞則被G418殺死。neoDTAPNS載體目標基因neo××同源重組結果一、同源重組neoDTAneoDTAPNS載體

基因組隨機整合結果二、隨機整合正負篩選法（PNS法）篩選已發生同源重組的細胞2、正向篩選法正向篩選標記基因Neo具有雙重作用，一方面導致了靶基因的插入突變；同時作為重組細胞的正向篩選標志，該基因產物可使細胞在含有新霉素的培養

基中生長。正向篩選法可分為無啟動子篩選法、無增強子篩選法和無polyA篩選法。

（1）啟動子缺失篩選法原理是在重組基因載體的目的片段中插入一個啟動子缺失的正向選擇基因

neo

neomycin，同時，目的基因片段也不包含該基因的啟動序列。如果基因載體和細胞基因組發生同源重組，則正向選擇基因可以在靶位點基因啟動子的作用下

得以表達，使陽性細胞具有

G418

抗性，從而在選擇培養基中得到同源重組陽性克隆。（2）Poly-

A缺失篩選法Poly-A缺失篩選的載體設計與啟動子缺失的設計基本相同，當打靶基因不能被誘導表達時，則考慮選用poly-

A缺失敲除策略。Poly

-

A

缺失的正向選擇基因

neo位于載體目的片段中,

由于neo

基因轉錄終止信號的缺失,其表達受到抑制。在重組陽