第二章色譜基本理論

第一節色譜圖及基本參數

色譜圖:色譜柱流出物通過檢測器時所產生的響應信號對時間的曲線圖,其縱坐標為信號強度,橫坐標為保留時間.色譜圖示意圖色譜圖相關術語.

色譜峰(Peak):.峰底(PeakBase):.峰高h(PeakHeight):.峰(底)寬W(PeakWidth):.半(高)峰寬W1/2(PeakWidthatHalfHeight):.峰面積(PeakArea):.標準偏差(σ)(StandardError):.拖尾峰(TailingPeak):.前伸峰(LeadingPeak):.鬼峰,假峰(GhostPeak):色譜圖相關術語.基線(Baseline):.基線飄移(BaselineDrift):.基線噪聲(N)(BaselineNoise):.譜帶擴展(BandBroadening):色譜圖相關術語留值的基本參保數保留時間(tR)(Retentiontime):死時間(tM)(Deadtime):調整保留時間(tR’)tR’=tR-tM,校正保留時間（tR0）tR0=jtR,

凈保留時間(tN)tN=jtR’,校正保留體積（VR0）:VR0=jVR凈保留體積(VN):VN=jVR’比保留體積(Vg):Vg=(273/Tc)(VN/ML)

保留值的基本參數有關分離的參數一相對保留值α又叫選擇性系數或選擇性因子α=1時兩個組分分不開，改變α的途徑是：

改變固定相，改變流動相，改變樣品本身的性質（如衍生化法）

二區域寬度

（1）標準偏差σ

（2）半峰寬W1/2（3）峰底寬度W

從色譜圖中，可得許多信息：1色譜峰的個數，可判斷所含組分的最少個數；2

根據色譜峰的保留值，可以進行定性分析；3

根據色譜峰的面積或峰高，可以進行定量分析；4

色譜峰的保留值及其區域寬度，評價柱效依據；5

色譜峰兩峰間的距離

三分配系數K與分配比(容量因子)K’:

1分配系數K

平衡狀態時組分在固定相（CL）與流動相（CG）中的濃度之比。2分配比(容量因子)K’:

平衡狀態時組分在固定相(P)與流動相(q)中的質量之比。

討論：K’=0則tR=tM

組分無保留行為

K’=1則tR=2tMK’→∞tR很大組分峰出不來所以K’=1-5最好如何控制K’？主要選擇合適的固定液色譜測K’容易（只測tRtM）所以常用K’四分配系數K與分配比K’的關系于

K=K’ββ=VG/VL=K/K’

五分配系數K,分配比K’與選擇性因子的關系

t’R(x)---待測物X的調整保留時間t’R(z)---碳原子數為Z的正構烷烴的調整保留時間t’R(z+n)---碳原子數為z+n的正構烷烴的調整保留時間t’R(z)≤t’R(x)≤t’R(z+n)（通常n=1）規定正構烷烴的I值是其他原子數的100倍，如：正庚烷I=700保留指數I色譜柱效能的參數柱效：也叫柱效能。理論塔板數n有效理論塔板數neff理論塔板高度HH=L/n第二節氣路系統一氣體

H2N2Air

也可用CO2NeAr純度要求大于99.99%

氣體控制系統

檢測器常用凈化劑作用

TCD；FID變色硅膠：除H2O

TCD；FID分子篩：除H2O

FID；ECD活性碳：除有機物

FID；ECD脫氧劑：除O2

氣體的壓力與流量的測量

常用皂膜流量計，用時先將皂膜流量計管子內壁潤濕

氣體的純化載氣流量的校正

用皂膜流量計測得的流量F皂（mL/min)是在柱后大氣壓下測得的，欲將其換算成色譜條件下的流量FC需作三種校正：濕度校正;壓力校正;溫度校正1，濕度校正

2，壓力校正PW---室溫下的的水飽和蒸汽壓P0---柱出口處壓力Pi---柱入口處壓力3，溫度校正空心柱的載氣流速通常不用皂膜流量計測量。而是由tM計算得到

載氣的平均線速U=L/tM

例題“實驗與習題”例4（P125）

作業：P131

41；42（思考）；43；

第三節色譜基本理論——塔板理論

GC是一種分離技術,組分先分離才可定性定量.如何選擇最佳分離條件,這需要色譜理論的指導.

塔板理論的假設1在理論板高H內，組分在氣液相內快速平衡2載氣以脈沖式進入色譜柱3無縱向擴散（柱向擴散）4分配系數K是常數

根據對色譜柱模擬蒸餾塔的假設條件，具體展開討論組分在色譜柱中移動分配過程如下：

動畫二、色譜流出曲線方程--基本關系式概率推導

設樣品分子開始全部位于第0號塔板上，當色譜柱中通過N體積載氣后，計算在第n塊塔板上出現某組分分子的概率。這個概率應該是考慮在塔板上某組分的一個分子出現在流動相中的概率(Mp)等于在該塔板上流動相中組分分子的個數與整個塔板上組分分子個數之比。假設色譜柱由5塊塔板組成：(0號板,1號,2號,…4號板)令N=5(N表示進入柱中載氣的脈沖次數令組分進樣量為：W=1

組分在柱內的分配過程是以氣液色譜分配為例,組分在氣液兩相中進行分配○表示進入氣相的組分分子□表示進入液相的組分分子此時若組分容量因子K，=1,即p=q

組分中有p量溶于液相組分中有q量溶于液相可用二項式準確表示出來(P+

q)N組分在n=5,k,=1,w=1柱內任一板上分配表01234柱出口N=010000010.50.5000020.250.50.2500030.1250.3750.3750.1250040.0630.250.3750.1250.063050.0320.1570.3130.3130.1570.03260.0160.0950.2350.3130.2350.07970.0080.0560.1160.2750.2750.11880.0040.0320.0860.1960.2750.13890.0020.0180.0590.1410.2460.138100.0010.1010.0380.1000.1890.118得出色譜流出曲線方程：

三、塔板理論方程式的討論

塔板理論成功之處較好地解析了色譜曲線形狀2濃度極大點Cmax的位置是tR(即VR)3可用N評價柱效V=VR時流出曲線達濃度極大值Cmax

Cmax的影響因素

(1)

進樣量W愈大,則Cmax愈大.W與Cmax成正比。這是色譜峰高定量的依據。（2）H值愈小，柱效愈高，Cmax/W比值愈大。即H越小，柱效N越高(3)色譜柱內徑愈小，填充愈緊密，Cmax/W比值也愈大。即柱愈細填充愈緊密，柱效N越高。

（4）

色譜柱愈短，Cmax值愈大。（5）

先流出柱子的組分容量因子小，所以Cmax/W比值愈大，反之提高色譜柱的溫度（對GC），增加流動相中強洗脫溶劑的濃度（對HPLC），都可以使容量因子下降，比而使Cmax/W比值愈大，提高色譜檢測靈敏度。四、塔板理論的作用與不足

(一)塔扳理論在色譜法中的地位與作用：

1．從塔板理論方程式的形式看它描述的色譜信號軌跡應該是正態分布函數，與實際記錄的色譜流出曲線相符合，說明此方程是準確的，且對色譜分配系統有理論指導意義。2．由塔板理論據導出來計算往效率的理論塔板數(N)公式，是行之有效的。長期以來用N值的大小評價色譜柱柱效是成功的，是色譜工作者不可缺少的計算公式。3.塔板理論方程式描述色譜峰極高點的Cmax數值是符合公式要求的，實驗數據證明Cmax與N，W，VR之間的關系是正確的。各參數對Cmax之影響都是客觀的。4．按塔板理論模型所建立起來的一些方程式討論了某些色譜參數對組分色譜峰區域半峰寬公式均符臺流出曲線半高峰寬變化的實際。特別應指出的是，塔板理論也提出了理論塔板高度對色譜峰區域寬度擴張的影響，這一點過去往往被忽視。(二)塔扳理論存在的不足：

1.塔板理論是模擬在一些假設條件下而提出的，假設同實際情況有差距，所以他描述的色譜分配過程定量關系合有不準確的地方。2.對于塔板高度H這個抽象的物理量究竟由哪些參變量決定的？H又將怎樣影響色譜峰擴張等一些實質性的較深入的問題，塔板理論卻不能回答。3.為什么流動相線速度(U)不同，柱效率(n)不同；而有時當U值由很小一下變得很大時，則柱效能（n）指標并未變化許多，但峰寬各異，這些現象塔板理論也無能為力．4.塔報理論忽略了組分分子在柱中塔板間的縱向擴散作用，特別當傳質速率很快時，其縱向擴散作用為主導方面，這一關鍵問題并未闡述。5.塔板理論也未說明β變化對組分在柱內移動速率的影響。實際上VL、VG在某些方面決定著組分分子的擴散行為和擴散距離。綜上所述塔板理論雖為半經驗理論，但在色譜學發展中起到了率先作用和對實際工作的指導作用，所以至今延用不衰，為廣大色譜工作者承認。

塔板理論不足之處

不能解析載氣流速U對N影響

不能指出板高H受那些因素影響第四節色譜理論--速率理論基于無規行走模型，定義H為單位柱長的離散度H=σ2/L,式中σ為高斯峰形的標準偏差，L為柱長。并假設：①縱向擴散是造成譜帶展寬的重要原因，必須予以考慮；②傳質阻力是造成譜帶展寬的主要原因，它使平衡成為不可能③對填充柱有渦流擴散的影響

vanDeemter方程的數學式為H=A+B/U+CU或H=A+B/U+CsU+CmUA、B、C、為常數，分別代表渦流擴散系數、分子擴散項系數、傳質阻力項系數。速率理論討論1、渦流擴散項A=2λdγλ為反應柱填充狀態的常數

dp為填料垃徑2、分子擴散項B/u（縱向擴散項）

B=2K0Dg

縱向分子擴散是由濃度梯度造成的。組分從柱入口加入，其濃度分布的構型呈“塞子”狀。它隨著流動相向前推進，由于存在濃度梯度，“塞子”必然自發的向前和向后擴散，造成譜帶展寬。分子擴散項系數為

K0為阻滯常數即彎曲因子，它反映了固定相顆粒的幾何形狀對自由分子擴散的阻礙情況。Dg為組分在流動相中擴散系數(cm2.s-1)色譜柱中的渦流擴散示意圖

色譜柱中的渦流擴散示意圖

色譜柱中的渦流擴散示意圖

3、傳質阻力項CU=(Cg+CL)U

傳質過程分為：氣相傳質過程與液相傳質過程傳質阻力系數C等于氣相傳質阻力系數Cg和液相傳質阻力系數CL之和：

（1）氣液色譜C=Cg+CL

氣相傳質阻力系數Cg為：液相傳質阻力系數

CL：

范氏方程

H=A+B/U+CsU+CmU

令C=Cs+Cm

則H=A+B/U+CU

作H~U圖(見下頁):方程討論

討論1.曲線有一最低點Uopt(即Hmin)

將方程微分:2.對開管柱(毛細柱)A=0

得Golay方程H=B/U+CU

對填充柱A項與U無關,決定與柱的填充情況3.U很小時:CU項可忽略,方程簡化為:

H=A+B/U

作H~1/U直線,斜率為B4.U很大時:B/U項可忽略,方程簡化為:

H=A+CU

作H~U直線,斜率為C,截距A5.K/對板高H的影響(比較復雜):

N隨K/的變化而變化綜合考慮:U實際稍高于Uopt

因為:1.右側曲線斜率小,U稍變不會引起H的大變化2.為提高分析速度因為U↑則tR

↓

第五節分離條件的優化要求1.兩峰間有一定距離—tR不同要求2.峰寬要窄—W1/2要小提問:怎樣制備一根好的色譜柱?怎樣評價?怎樣選色譜條件?一般:1.選擇性(相對保留值α或保留指數I)－－評價固定液對物質的保留作用2.柱效能(n.neff)－－評價柱分離效能3.分離度R(總分離效能指數)分離度是將以上二者綜合考慮既反映柱效能,又反映選擇性

一.分離參數1.n與neff的關系可見neffn都隨K/變化而變化因為K/不同，柱效不同,所以評價柱效應采用K/為一定值時的nW1/2與tR的關系--半峰寬規律

W1/2=a+b

tR實驗研究表明:同系物組分的半峰寬線形關系好非同系物組分的半峰寬線形關系差所以我們稱之為準線形關系.

半峰寬規律的應用

有兩種情況

1第二個峰可能不只一個組分

2也許是第一針留下來未出峰的組分

選擇性系數(相對保留指數)可見二組分沸點差大,柱溫低時,αis

大,易分離.分離度分離條件的選擇主要是提高“難分離物質對”的分離度（1）峰寬分離度R國家標準分離度

當兩峰高相差不大,且峰型接近時可以認為W1=W2=W

(2)半峰寬分離度R1/2

R與R1/2關系,對于高斯R1/2=1.7R二，分離基本關系式此式用于計算達到一定R時所需的n必須

n表示柱效,難以說明真實分離效果α1.2表示選擇性,表示固定液對組分保留作用,不說明柱效R是總分離效能指標,只有>1時,二組分才有可能分離α1.2討論：

R=1

分離程度達98%

R>=1.5

完全分離,達>=99.7

也叫基線分離

R<1

二峰明顯重疊分離度與柱效關系(R與n)所以我們希望用柱效高的色譜柱2.R與K，的關系

α1.2由上式可知：(1)增加塔板數可以提高分離度(2)k值的最佳范圍是：1＜k＜10(3)相對保留值α增大，能顯著地提高分離度兩根同種色譜柱的相互關系式：例如:柱長L=30cm分離度R=1.06

柱效n=3490分析時間tR2=17.63min;要使分離度達到R=1.5或以上,就需要改變L,n如果換一根30cm長,但n=7000的柱則tR2=17.63min內可達R=1.5的分離度若采取加長色譜柱的方法,則需要60cm,

分析時間tR2=35min死體積(VM)(Deadvolume):VM=tMFcFc為色譜柱內載氣平均流量。保留體積(VR)(Retentionvolume):VM=tRFc，調整保留體積(VR’)VR’=tR’Fc=VR–VM,保留值的基本參數3.分離度R與保留時間tR的關系說明:縮短分析時間的最有效的措施是提高柱效

縮短柱長,增加載氣流速也可以提高分析速度但前提是保證足夠的R值三、分離條件的優化改變n和Hn=L/HLn但分析時間也增加最好是在不增加柱長的條件下,減少H,以達到增加n根據范氏方程選擇操作條件,使H(1).Uopt

選U實稍高于Uopt,一般30ml/min∵右側平坦U稍變化不會引起H大的變化

U大使tR小,分析速度加快B/UCU(2).固定液及配比降低Cs項(液相阻力),dl(膜厚)要小即配比要低

dl太小有兩個缺點:

a.進樣量小(肚子小)

b.載體表面被固定液覆蓋小,使載體出現極性,因吸附作用會產生拖尾峰(3).載體粒徑影響A項Cm項要求惰性,顆粒小而均勻一般80~100目篩分范圍窄好(4).采用小內徑的色譜柱柱徑4mmHUH柱徑2.2mmU20~30目40~50目100~150目2.改變k如圖k>5,R變化就很小了GC分析:最好k=2~5

一般不超過10否則大大延長分析時間如何改變ka.降低柱溫Tc,使k上升

b.降低流速U,使k上升RtR246kk對R,tR的影響3.改變

α1.2

R1.2是準熱力學常數,在流動相,固定相一定時,只與Tc相關當α1.2=1時,改變H,k

都無法使1和2兩個組分分離∴應當保持k=2~10的前提下,設法改變α1.2

方法是:a.改變柱溫Tcb.更換色譜柱

c.衍生化法(即利用化學反應改變待測物結構)4.程序升溫程序升溫可使待測物在適當溫度下流出,以保證每個組分有合適的K/值,同時改變分離度程序升溫是分離復雜多組分沸程寬的混合物的有效方法5.進樣

δi<0.204δδi進樣峰標準偏差

δ實際峰標準偏差進樣快防止縱向擴散進樣量小使峰對稱,一般進樣0.1~10μl

固定液含量低時(毛細柱)進樣量要少進樣技