實(shí)驗(yàn)四花粉貯藏及花粉

生活力的測定

花期不遇給雜交工作造成困難，有的園林植物可通過調(diào)整花期來解決，有的則不得不進(jìn)行花粉貯藏，或者從外地寄運(yùn)花粉。為了避免雜交工作失誤，在使用外地寄來的花粉或經(jīng)過一段時間貯藏的花粉之前，必須對花粉的生活力進(jìn)行檢測，以便對雜交結(jié)果進(jìn)行分析與研究。因此我們必須掌握花粉貯藏及花粉生活力測定的原理和技術(shù)。（為什么貯藏花粉？）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆栈ǚ圪A藏及花粉生命力鑒定的方法和原理。二、實(shí)驗(yàn)材料月季、百合、一串紅、矮牽牛、油茶等植物的花粉。三、儀器及藥品

載玻片、蓋玻片、解剖針、鑷子、毛筆、干燥器、小指形管、標(biāo)簽、記號筆、顯微鏡、天平、燒杯、培養(yǎng)皿、滴管、玻璃棒、量筒、電爐、石棉網(wǎng)、冰箱；凡士林、無水氯化鈣、蔗糖、瓊脂、蒸餾水、硼酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、碘、碘化鉀、氯化二苯基四氮唑（TTC）。四、實(shí)驗(yàn)原理花粉在低溫（0～2℃）、干燥、黑暗等條件下代謝強(qiáng)度降低，花粉貯藏的原理就是要創(chuàng)造這樣低代謝的環(huán)境條件，從而延長花粉的壽命。

花粉的形態(tài)、花粉中酶的活性以及積累淀粉的多少（淀粉質(zhì)花粉）通常與其生活力密切相關(guān)，因此可以利用花粉的形態(tài)觀察、過氧化物酶、脫氫酶的活性高低（呼吸）、淀粉的含量以及在人工培養(yǎng)基上花粉管萌發(fā)的情況作為鑒定花粉生活力高低的標(biāo)準(zhǔn)。鑒定花粉生活力的方法很多，概括起來主要有如下幾種：1．直接測定法：將待測花粉直接授粉，然后統(tǒng)計(jì)結(jié)實(shí)情況。此法最準(zhǔn)確，但需時較長，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果易受氣候條件的影響。也可在授粉后隔一定時間切下柱頭，在顯微鏡下壓片檢查花粉的萌發(fā)情況，根據(jù)萌發(fā)率的高低來鑒定花粉的生活力。2．形態(tài)觀察法直接在顯微鏡下觀察花粉的形態(tài)，根據(jù)品種花粉的典型性（如具有正常的大小、形狀、色澤等）判斷花粉的生活力，即形態(tài)正常的花粉有生活力，而一些小的、皺縮的、畸形的花粉不具有生活力。此法簡便易行但準(zhǔn)確性差，一般只用于測定新鮮花粉的生活力。3．染色觀察法（對二萘氧基聯(lián)苯胺）（1）過氧化物酶測定法原理：具有生活力的花粉含有活躍的過氧化物酶。此酶能利用過氧化物使各種多酚及芳香族胺發(fā)生氧化而產(chǎn)生顏色，依據(jù)顏色可知花粉有無活力。

步驟和方法：先在載玻片上加少量待測花粉，然后在花粉上滴試劑Ⅰ和試劑Ⅱ各一滴，仔細(xì)攪勻，蓋上蓋玻片，經(jīng)3～4分鐘后，再放在顯微鏡下檢查，有生活力的花粉呈紅色或玫瑰色，無生活力的花粉為黃色或無色，為了確定具有生活力的花粉百分率，要連續(xù)觀察3～5個視野，求其平均值，將觀察結(jié)果填入表內(nèi)。3．染色觀察法（2）碘-碘化鉀染色法原理：正常的花粉積累淀粉較多，而不正常的花粉則少。據(jù)此，可用化學(xué)物質(zhì)染色，根據(jù)呈色反應(yīng)來間接測定花粉的正常與否和花粉生活力的差別。通常正常花粉用I-KI染色后呈藍(lán)色，而發(fā)育不良畸形花粉則不積累淀粉，當(dāng)I-KI染色時呈黃褐色。

步驟和方法：取花粉撒于載玻片上，加一滴蒸餾水，用鑷子使花粉散開，再加一滴I-KI溶液，蓋上蓋玻片置于顯微鏡下觀察，凡被染色呈藍(lán)色表示具有生活力，呈黃褐色者為發(fā)育不良生活力弱的花粉。3．染色觀察法（3）氯化三苯基四氮唑（TTC）法原理：凡具有生活力的花粉，在其呼吸作用過程中都有氧化還原反應(yīng)，而無生活力的花粉則無此反應(yīng)，因此當(dāng)TTC滲入有生活力的花粉時，花粉中的脫氫酶在催化去氫過程中與TTC結(jié)合，使無色的TTC變成三苯基甲（TTF）而呈紅色。

步驟和方法：取少量花粉放在載玻片上，在花粉上滴1～2滴TTC溶液，用鑷子使其混勻后，蓋上蓋玻片。將此載玻片上置于恒溫箱中（35～40℃）約15～20分鐘，在顯微鏡（100倍）下觀察。凡有生活力的花粉粒呈紅色，其次呈淡紅色，失去生活力的和不育的花粉粒表現(xiàn)無色。4．培養(yǎng)基發(fā)芽法

在培養(yǎng)基上進(jìn)行花粉的人工萌發(fā)，鑒定待測花粉萌發(fā)率的高低。此法若采用適宜的培養(yǎng)基能較精確地測定出花粉的生活力，但不同植物的花粉萌發(fā)條件存在較大的差異，所以很多時候測定的結(jié)果也只是相對可靠。五、實(shí)驗(yàn)步驟：１．花粉的貯藏（１）將采集的花粉進(jìn)行干燥（涼干或放入盛有無水氯化鈣的干燥器中干燥），一般以花粉不相互黏結(jié)為度。（２）將干燥的花粉裝在指形管中（不要太多，一般以五分之一體積或更少為宜），瓶口塞以紗布，瓶外貼以標(biāo)簽，注明花粉種類、采收日期。（３）將指形管放入無水氯化鈣控制一定濕度的干燥器中，干燥器置于0～2℃的冰箱內(nèi)。２．花粉生活力的測定：

（１）染色觀察法——TTC和KI染色法①分別配制TTC和KI染色液各100ml，裝入棕色瓶中備用。②制片：取少量花粉于載玻片上，滴入1～2滴0.5％TTC或KI染色液，用鑷子攪拌均勻，蓋上蓋玻片，于35～40℃條件下凈置15～20min。③觀察統(tǒng)計(jì)：在顯微鏡下觀察三個不同的視野，凡被TTC染成紅色或玫瑰紅的都是有生活力的花粉，黃色或不著色者為沒有生活力的花粉；被KI染成藍(lán)色者表示具有生活力，花粉呈黃褐色者不具有生活力。六、作業(yè)及思考題：1.繪一幅花粉粒發(fā)芽形態(tài)圖。2.按下表統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。TTC染色（KI染色）統(tǒng)計(jì)結(jié)果花粉來源各視野中花粉粒數(shù)量及生活力平均生活力(％)花粉總數(shù)其中花粉總數(shù)

其中

花粉總數(shù)

其中

紅色黃色生活力紅色黃色生活力紅色黃色生活力月季（２）培養(yǎng)基發(fā)芽法——固體培養(yǎng)基

①配制培養(yǎng)基：稱取1g瓊脂，5g蔗糖，量取94ml蒸餾水，裝入燒杯，加熱使瓊脂融化呈透明狀（注意補(bǔ)充水分，以保持培養(yǎng)基的濃度），即配成5%濃度的培養(yǎng)基。同法配制10%、15%、20%濃度的培養(yǎng)基。②制片：用滴管吸取少量培養(yǎng)基，趁熱滴在載玻片的凹槽內(nèi)，放置片刻，使其凝固。③播種花粉：將少量花粉均勻地撒播在培養(yǎng)基上，注意不可過多，否則難以觀察。培養(yǎng)：將制備好的片子放在墊有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，于20～22℃的溫箱中培養(yǎng)；觀察：待花粉萌發(fā)后于顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率。觀察時每片隨機(jī)取三個視野，統(tǒng)計(jì)花粉總數(shù)及發(fā)芽數(shù)，計(jì)算平均萌發(fā)率（花粉總數(shù)不少于100粒）。六、作業(yè)及思考題：１、按下表統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。２、繪一幅花粉粒發(fā)芽形態(tài)圖。染色法測定結(jié)果記載表

花粉來源各視野中花粉粒數(shù)量及生活力平均生活力(％)花粉總數(shù)其中花粉總數(shù)

其中

花粉總數(shù)

其中

紅色黃色生活力紅色黃色生活力紅色黃色生活力貯藏新鮮培養(yǎng)基法測定結(jié)果記載表

花粉來源培養(yǎng)基濃度各視野中花粉粒數(shù)量及發(fā)芽率平均生活力(％)123發(fā)芽數(shù)/總數(shù)發(fā)芽率發(fā)芽數(shù)/總數(shù)發(fā)芽率發(fā)芽數(shù)/總數(shù)發(fā)芽率貯藏0%5%10%15%20%新鮮

配制對二萘氧基聯(lián)苯胺:a．0.2克聯(lián)苯胺溶于100毫升50%的酒精溶液；b．0.15克a-萘酚溶于100毫升50%酒精溶液；c．0.25克的碳酸鈉溶解在100毫升的蒸餾水中。以上三種溶液分別放入棕色瓶中備用，使用時將這三種溶液等量配成試劑Ⅰ，放入棕色滴瓶中備用，在使用前準(zhǔn)備好0.3%的過氧化氫水溶液作為試劑Ⅱ。配制TTC染色液：稱取0.5gTTC溶于100ml磷酸鹽緩沖液中，