串聯親和純化技術的研究進展————酶工程期中報告串聯親和純化技術的研究進展————酶工程期中報告卷首語背景介紹第一章

TAP的原理與方法

第二章

TAP技術的應用

第三章

TAP技術改進第四章存在的問題結束語組員表目錄卷首語背景介紹目錄隨著確定細胞內蛋白質的相互作用成為當今生命科學的研究熱點，雙雜交技術已經廣泛應用于研究蛋白一蛋白間的相互作用，但由于其篩選步驟復雜，假陽性結果較多，難于量化，故不能滿足大規模蛋白質研究的需要，因此串聯親和純化(TandemAffinityPurification。TAP)技術以其高效、高純度、以及能夠高度模擬真實生理條件等優勢，迅速成為篩選、發現和鑒別新的相互作用蛋白質的主流技術之一。

卷首語背景介紹隨著確定細胞內蛋白質的相互作用成為當今生命科學的研究熱點，雙目前，TAP技術與質譜技術的聯用，以及質譜技術的自動化，使得大規模地分析相互作用的蛋白質在技術上成為可能。TAP采用兩步親和純化，提高了純化產物的特異性，具有周期短、假陽性結果少等優點。通過這種方法鑒定出的蛋白質相互作用能真實地反映細胞中蛋白質分子之間的聯系，實驗結果更加接近真實情況，而且TAP技術還特別適用于蛋白質組水平上的大規模研究。

目前，TAP技術與質譜技術的聯用，以及質譜技術的自動化，使得串聯親和純化技術與常規的親和純化技術相比具有更多優點，因為這些優點，串聯親和純化技術如今已被廣泛地用于蛋白質一蛋白質之間相互作用的研究，尤其是蛋白質復合體的研究。TAP技術作為一種高效的在生理條件下研究蛋白質相互作用的技術，它能更加真實地反映細胞內部的客觀世界。因此TAP技術在認識蛋白質相互作用這一蛋白質組學的重要內容的過程中必將發揮越來越重要的作用。串聯親和純化技術與常規的親和純化技術相比具有更多優點，因為這第一節蛋白質標記第二節構建表達標記蛋白的細胞或組織第三節細胞抽提物的準備第四節串聯親和純化(TAP)第五節蛋白質復合體的鑒定第一章TAP的原理與方法第一節蛋白質標記第一章TAP的原理與方

運用TAP技術純化蛋白質復合體的流程主要包括構建表達標記蛋白的細胞或組織、準備細胞抽提物、串聯親和純化和分析鑒定。

運用TAP技術純化蛋白質復合體的流程主要包括構建表達標TAP技術通過在目的蛋白的一端嵌入一段由金黃色葡萄球菌蛋白A(ProA)的IgG結合區和鈣調蛋白結合區(CBP)構成，中間被一個TEv蛋白酶的酶切位點隔開的蛋白質標記。當蛋白質標記在目標蛋白的兩端時，這兩段結合區的順序有所不同，但始終要保證最終表達的融合蛋白中蛋白A的IgG結合區在外端(見圖1)。這樣使得被標記的目的蛋白其表達量與其在細胞中自然表達水平相當，避免了由于過量表達導致非自然條件下的蛋白質相互作用。通過兩步連續的親和純化獲得更接近自然狀態的特定蛋白質復合體。1.1蛋白質標記

TAP技術通過在目的蛋白的一端嵌入一段由金串聯親和純化技術的研究進展課件

普通的分子克隆技術可以將這一段編碼蛋白質標記的基因片段導入目標蛋白編碼基因的特定部位．將帶有標記基因的載體導入感受態細胞，并通過基因重組將內源性的目標蛋白基因置換為標記基因，其結果不僅可以在生理條件下得到標記蛋白及與之作用的蛋白質，而且標記蛋白的表達量與其在自然條件下的表達量相當，避免了由于過量表達導致非自然條件下的蛋白質相互作用。1.2構建表達標記蛋白的細胞或組織

普通的分子克隆技術可以將這一段編碼蛋白質標

各種準備細胞抽提物的策略都可以應用于串聯親和純化，但是有兩點需要注意：（1）各種不同的純化策略都必須盡量保證能夠降低非特異性相互作用的干擾，同時盡可能不要破壞自然存在的相互作用。（2）不同細胞器內的蛋白質有可能會因為細胞破碎后混在一起，形成非自然的蛋白質降解，這種情況可以通過降低溫度，縮短破碎時間，加入各種各樣的蛋白酶抑制劑來避免。1.3細胞抽提物的準備各種準備細胞抽提物的策略都可以應用于串聯

將細胞抽提物加入lgG親和柱，標記蛋白一端的ProtA結合區就會與親和柱上的IgG形成很強的結合，即使用比較嚴謹的洗脫條件，也不會使標記蛋白及與其作用的蛋白質所形成的蛋白質復合體被洗脫下來。這樣就降低了非特異性的蛋白質相互作用，同時也保留了絕大部分自然存在的相互作用。然后用TEv蛋白酶切割標簽ProA，釋放仍掛有CBP的蛋白復合物；在鈣離子存在的情況下，將上面的純化產物與鈣調蛋白包被的親和珠一起孵育，通過CBP親和標簽復合物再次被純化，最后在溫和的條件下利用EG—TA洗脫除去雜蛋白和TEv蛋白酶剩余物。通過這樣的兩步連續純化就可得到高純度的天然構象的蛋白(見圖2)C93。1.4串聯親和純化(TAP)

將細胞抽提物加入lgG親和柱，標記蛋白串聯親和純化技術的研究進展課件

對通過串聯親和純化得到的蛋白質復合體的鑒定有很多種方法，這里只舉部分案例。（1）可以將最后一步洗脫得到的復合物在SDS一聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS—PAGE)或二維電泳上分離，然后用質譜或者蛋白質測序來鑒定復合體的各個組分。（2）可以對蛋白質復合體進行體外活性測定，以及通過電鏡觀察復合體結構等。1.5蛋白質復合體的鑒定對通過串聯親和純化得到的蛋白質復合體的鑒

通過TAP技術最終可以發現細胞中新的蛋白質復合體或者鑒定已發現復合體中新的組分．TAP技術能夠向我們提供大量蛋白質復合體的信息，隨著積累的蛋白質復合體的數據增加，還可以建立蛋白質復合體相互作用的網絡，建立這種網絡的前提是認為含有共同組分的蛋白質復合體之間一定存在功能上的聯系，而且研究者們越來越認為很多細胞功能是由蛋白質復合體或者通過蛋白質復合體相互作用共同實現的，因此這種方法建立起來的蛋白質組水平上的相互作用網絡圖，能夠代表細胞各種生命行為的物質基礎。通過TAP技術最終可以發現細胞中新的蛋白第一節TAP在蛋白質組學研究中的應用

2.1.1在酵母蛋白質學中的應用

2.1.2在大腸桿菌蛋白質學中的應用

2.1.3在研究高等真核生物中蛋白相互作用的應用

2.1.4在哺乳動物蛋白質學中的應用

2.1.5在植物蛋白質中應用第二節TAP與其他技術聯用第二章TAP技術的應用

第一節TAP在蛋白質組學研究中的應用第二章1999年，Rigaut等將兩個ProteinA的IgG結合單元(ProtA與鈣調蛋白結合肽(calmodulinbindingpeptide,CBP)相連，中間以煙草花葉病毒(TMV)的特異性酶切位點相隔，這便是最初的TAP標簽。Rigaut利用該標簽成功地在釀酒酵母中純化出了大量蛋白質復合體，也就此創立了串聯親和純化技術。

1999年，Rigaut等將兩個ProteinA的IgG結短短十年之后，TAP與質譜技術(massspectrometry,MS)聯用(TAP-MS)已成為一種高效且實用的方法在生物大分子相互作用領域中被廣泛應用。近些年，隨著TAP標簽的全面改進和質譜技術的不斷發展，TAPMS的靈敏度與專一性得到很大提高，使得該技術得以在更多領域發揮重要作用，也使得我們對蛋白質復合體進行系統性研究成為可能。隨著該技術的不斷成熟，TAP技術迅速向各個領域擴展。如今，TAP已經在病毒、細菌、原生動物、植物以及哺乳動物等多個領域發揮著積極作用。短短十年之后，TAP與質譜技術(massspectrome

目前，TAP技術與質譜技術的聯用，以及質譜技術的自動化，使得大規模地分析相互作用的蛋白質在技術上成為可能。這樣大規模、全細胞地分析蛋白質之間的相互作用可以向人們展示出細胞內蛋白質復合體之間的相互作用網絡圖。這種相互作用的網絡圖是我們準確理解蛋白質功能，揭開各種細胞運營生命奧秘的又一重要信息平臺。目前TAP技術雖然僅在下面幾個方面得到了應用，但隨著該技術的不斷發展完善，其應用的前景會越來越廣闊。2.1TAP在蛋白質組學研究中的應用

目前，TAP技術與質譜技術的聯用，以及質TAP技術首先是在芽殖和裂殖酵母中得到成功的應用，因為這種技術不同于傳統的蛋白標記技術，在酵母中可以通過同源重組達到快速、大量的標記效果。TAP技術較其他蛋白質作用的研究方法優勢在于：可以鑒定出在空間上非直接物理相互作用的蛋白分子。

2.1.1在酵母蛋白質學中的應用TAP技術首先是在芽殖和裂殖酵母中得到成功的應用，因為這種技Gavin等在酵母細胞中用TAP標簽標記了1739個(約1／4酵母蛋白)編碼基因，最后通過串聯純化得到589個標記的靶蛋白，并通過MALDI．TOFMS和生物學信息對其中的232個蛋白質復合體進行了鑒定分析。同時發現344種蛋白的新功能。Ybon等運用該技術分析發現了APC復合體中有13個組分，而傳統的遺傳和生化技術只鑒定出了11種組分。Bouveret等通過這種技術發現了一種新的類Sm蛋白質復合體，這種復合體參與mRNA的降解過程。F0rler利用這一技術與RNA干涉技術結合研究酵母等較高級真核生物的蛋白質組功能。Gavin等在酵母細胞中用TAP標簽標記了1739個(約1／2003年，Gully等率先運用TAP對大腸桿菌酰基載體蛋白(ACP)進行研究。長期以來，大腸桿菌都是生命科學研究中最重要的模式生物之一，但有關大腸桿菌的系統蛋白質組研究卻直到2005年才由Butland等進行了首次報道。他們的研究不僅證實了許多之前預測的蛋白質復合體，還發現了許多已知蛋白質間新的相互作用，也讓我們深入地了解了很多原核生物保守蛋白質間的微觀拓撲結構。

2.1.2在大腸桿菌蛋白質學中的應用

2003年，Gully等率先運用TAP對大腸桿菌酰基載體蛋作為一種原核生物，大腸桿菌的結構比真核生物簡單，導入標簽蛋白質的難度也要低于哺乳動物和酵母，且基因易于操控。因此，TAP技術在原核生物中應用時選用親和性較低的傳統酵母TAP標簽即可。因此，在目前有關大腸桿菌TAP的報道中，基本都是沿用傳統的酵母TAP標簽(Rigaut實驗中所使用的標簽)進行研究，少有標簽的改進。

作為一種原核生物，大腸桿菌的結構比真核生物簡單，導入標簽蛋白雖然TAP技術能夠對酵母細胞蛋白質的相互作用進行大規模地研究，但在高等真核細胞中的應用卻受到限制，這是因為在高等真核細胞中難以進行原位蛋白標記，以及存在內源表達的蛋白質干擾，和蛋白質翻譯后調控機制的不同等因素。最近Forler等將TAP技術與RNAi技術聯用，發現可以很大程度上降低上述問題的影響。目前這種聯用的技術被稱為iTAP，而且已經在果蠅的s2細胞中得到了成功的應用。2.1.3在研究高等真核生物中蛋白相互作用的應用

雖然TAP技術能夠對酵母細胞蛋白質的相互作用進行大規模地研究TAP技術被認為能廣泛應用于系統繪制各物種的蛋白質相互作用圖譜。該技術目前在繪制人類細胞系統全蛋白質相互作用圖譜中也發揮了很大作用。除此之外，TAP技術還被應用于研究復雜的生化反應路徑及機制，如人類轉錄機器的研究和鼠胚胎干細胞多能性的研究等。2.1.4在哺乳動物蛋白質學中的應用

TAP技術被認為能廣泛應用于系統繪制各物種的蛋白質相互作用圖Bouwmeester等在研究信號轉導途徑的過程中，為了探尋a-腫瘤壞死因子與核轉錄因子的分子通路，標記了與該通路相關或疑似相關的32個蛋白質，采用TAP-MS技術，成功鑒定出與該途徑相關的221個蛋白質復合體，包括80個從未發現的相互作用蛋白質以及10個重要的功能分子。

Goldfinger等在傳統TAP標簽的基礎上進行優化，構造了新的N端標簽，建立了第一個哺乳動物細胞內與Ras相互作用的蛋白質數據庫。Bouwmeester等在研究信號轉導途徑的過程中，為了探TAP在植物中的應用目前還較有限，由于植物蛋白質表達量較低，而適合植物使用的標簽還較少，所以純化效率不高。目前大多數提純方案采用傳統TAP標簽或TAPi(improvedTAP)標簽。二者都已成功應用于擬南芥和水稻蛋白質復合體的提純。另外，一種替代型TAP標(alternativeTAPtag,TAPa)也被報道，用于純化擬南芥的蛋白質復合體。2.1.5在植物蛋白質中應用

TAP在植物中的應用目前還較有限，由于植物蛋白質表達量較低，2008年以來，有人開始運用新型GS-TAP標簽，即基于ProtG和鏈霉抗生物素蛋白結合肽(streptavidinbindingpeptide,SBP)的TAP標簽對植物進行研究，取得了較好效果，顯示出TAP技術在植物蛋白復合物領域也具有一定的應用潛力。

2008年以來，有人開始運用新型GS-TAP標簽，即基于

與其他技術聯用，可發揮TAP的更大潛能人們在逐步改善TAP技術自身缺陷的同時，還嘗試將其與其它工具聯合使用，這使TAP在研究蛋白質相互作用領域發揮著越來越重要的作用。2.2TAP與其他技術聯用與其他技術聯用，可發揮TAP的更大潛能人Lavoie等采用的實驗方法能夠基于TAP、HA、MYC標簽進行PCR介導的同源重組。標簽標記蛋白質可以被用來進行串聯親和純化或染色質免疫沉淀和基因芯片分析。Kobayashi等設計了一種新型標簽，將八聚組氨酸(8×His)、鏈霉素結合肽(SBP)和C端Myc標簽串聯到綠色熒光蛋白(GFP)的一個環里，使得這個新型標簽具有蛋白質定位和蛋白質純化雙重作用。這種TAP與免疫熒光技術相結合的設計為我們更深入了解蛋白質的內部信息提供了方便。Lavoie等采用的實驗方法能夠基于TAP、HA、MYC標簽第一節標簽系統的改進

3.1.1N末端TAP標簽

3.1.2分離式標簽

3.1.3差減式標簽第二節純化方法的改進

第三章TAP技術改進

第一節標簽系統的改進第三章TAP技術改進最初人們廣泛采用上述的C末端TAP標簽，后來，隨著研究的深入，研究者，發現C末端多肽的引入會嚴重損害一些目的蛋白的功能,產生生長缺陷甚至死亡，并將融合蛋白載體平行導入單倍體和二倍體細胞加以驗證，仍不能解決以上問題。3.1.1N末端TAP標簽

3.1標簽系統的改進最初人們廣泛采用上述的C末端TAP標簽，后來，隨著研究的深入為了處理上述問題，Puig等發展了N末端TAP標簽，如圖3所示.N末端TAP標簽具有與C末端TAP標簽相同的模體，但模體順序卻是相反的。為了使ProtA模體在第一步純化中便于切除，N端TAP標簽基因后緊接靶基因，同時，在N末端TAP標簽的CBP模體后加入一腸激酶(EK)切位點，便于從融合蛋白中去除標簽殘基。為了處理上述問題，Puig等發展了N末端TAP標簽，如當不同復合物的兩個亞基存在協同作用并可形成一個新的復合物時，由于其相互作用的部分較小，大部分亞基仍保持游離狀態或兩個亞基主要是與其他復合物蛋白緊密結合。用分離式標簽可將這一含量稀少的特定復合物分離出來。它的策略是將TAP標簽的模體分開，分別融合于兩個亞基即一個亞基同ProtA與TEV模體融合，而另一個與CBP融合。如圖4所示，第一次親和純化時，僅包括CBP模體的非特定復合物因不能結合IgG珠而被除去，經1’EV蛋白酶處理后，再進行第二次純化時，只有當兩個靶亞基相互作用形成復合物后，才能結合于親和柱上并被分離。

3.1.2分離式標簽

當不同復合物的兩個亞基存在協同作用并可形成一個新的復合物時，串聯親和純化技術的研究進展課件當兩個復合物共有一個相同的亞基時，而其中僅有一個復合物是我們所需要的，直接分離會發生共分離現象。為了分離這一復合物。可用差減式標簽策略。如圖5即將兩種復合物的共同亞基都與普通TAP標簽融合，而非必需復合物的另一蛋白與一個單ProtA模體標簽(無TEV切點)融合。這樣，當第一次親和純化后，非必需復合物因仍結合于IgG珠而不被洗脫，必需復合物即可在第二次親和純化中獲得。

3.1.3差減式標簽

當兩個復合物共有一個相同的亞基時，而其中僅有一個復合物是我們串聯親和純化技術的研究進展課件另外，在具體純化步驟上，還可采用省略透析，加入非離子去垢劑，提高鹽濃度等手段，以提高表達蛋白溶解度。準備細胞抽提物時，為了排除降解的可能性，可采用Western印跡技術以檢測融合蛋白的ProtA部分，從而確定抽提的效果及TAP標簽的穩定性。總之，與質譜連用的TAP技術是我們研究蛋質組學的有力工具，必將在解析生物蛋白復合體功能方面發揮重要作用。3.2純化方法的改進

另外，在具體純化步驟上，還可采用省略透析，加入非離子去垢劑，隨著TAP技術自身的發展以及與其他技術聯用之后所發揮出的巨大生命力。TAP技術在研究蛋白質相互作用的各個方面都比傳統方法有所突破。第四章存在的問題隨著TAP技術自身的發展以及與其他技術聯用之后所發揮出的巨但TAP技術與其他標簽融合方法一樣具局限性。TAP標簽的引入可能會影響靶蛋白和親和柱的結合，影響蛋白的表達；少數靶蛋白會在TEv蛋白酶處理過程中被破壞；細胞裂解過程有時會影響TAP標簽表達；有時由于細胞內源鈣調蛋白與CBP模體的結合，影響第二次的純化。另外純化中EGTA或其他溶劑的使用會干擾復合物的完整性和活性過程。為此人們對它做了一系列的改進。但TAP技術與其他標簽融合方法一樣具局限性。TAP標簽的引關鍵詞：串聯親和純化關鍵詞：蛋白質相互作用

了解蛋白的功能是生物學研究的一項主要任務，TAP對于分離、鑒定蛋白的相互作用分子式一種十分有用的技術。結束語關鍵詞：串聯親和純化關鍵詞：蛋白質相互作用了解蛋白的功能是關鍵詞：蛋白質組學

關鍵詞：蛋白質相互作用將來，從PCR、克隆挑選、組織細胞培養，到蛋白質純化、質譜分析，TAP技術的每個步驟都可逐步實現自動化，這勢必將大大提高解析蛋白復合體和蛋白相互作用網格的熟讀和能力，與其他研究蛋白相互作用的方法相結合，應用于大規模的功能蛋白質組學研究，從而更全面客觀地了解形形色色的細胞事件。關鍵詞：蛋白質組學關鍵詞：蛋白質相互作用將來，從PCR、克盡管TAP技術存在一些局限性，但TAP技術具有鑒定在生理條件下所有相互作用蛋白質的能力；假陽性和假陰性水平低；具備通用性以及自動化等優勢；與質譜等其他技術聯用。能大規模地研究細胞內蛋白質分子之間的相互作用網絡。因此，TAP技術在研究蛋白質相互作用過程中必將發揮越來越重要的作用。關鍵詞：網絡圖盡管TAP技術存在一些局限性，但TAP技術具有鑒定在生理全卷完謝謝觀賞！全卷完謝謝觀賞！組員表演講者：杜壽輝、李文茂綜述作者：蘇凌燕、何素瑞、趙佐斯、豆金仙、李鑫PPT制作：程晨資料收集者：王賽男問題回答者：李寶鑫、李文茂、杜壽輝組員表演講者：杜壽輝、李文茂串聯親和純化技術的研究進展————酶工程期中報告串聯親和純化技術的研究進展————酶工程期中報告卷首語背景介紹第一章

TAP的原理與方法

第二章

TAP技術的應用

第三章

TAP技術改進第四章存在的問題結束語組員表目錄卷首語背景介紹目錄隨著確定細胞內蛋白質的相互作用成為當今生命科學的研究熱點，雙雜交技術已經廣泛應用于研究蛋白一蛋白間的相互作用，但由于其篩選步驟復雜，假陽性結果較多，難于量化，故不能滿足大規模蛋白質研究的需要，因此串聯親和純化(TandemAffinityPurification。TAP)技術以其高效、高純度、以及能夠高度模擬真實生理條件等優勢，迅速成為篩選、發現和鑒別新的相互作用蛋白質的主流技術之一。

卷首語背景介紹隨著確定細胞內蛋白質的相互作用成為當今生命科學的研究熱點，雙目前，TAP技術與質譜技術的聯用，以及質譜技術的自動化，使得大規模地分析相互作用的蛋白質在技術上成為可能。TAP采用兩步親和純化，提高了純化產物的特異性，具有周期短、假陽性結果少等優點。通過這種方法鑒定出的蛋白質相互作用能真實地反映細胞中蛋白質分子之間的聯系，實驗結果更加接近真實情況，而且TAP技術還特別適用于蛋白質組水平上的大規模研究。

目前，TAP技術與質譜技術的聯用，以及質譜技術的自動化，使得串聯親和純化技術與常規的親和純化技術相比具有更多優點，因為這些優點，串聯親和純化技術如今已被廣泛地用于蛋白質一蛋白質之間相互作用的研究，尤其是蛋白質復合體的研究。TAP技術作為一種高效的在生理條件下研究蛋白質相互作用的技術，它能更加真實地反映細胞內部的客觀世界。因此TAP技術在認識蛋白質相互作用這一蛋白質組學的重要內容的過程中必將發揮越來越重要的作用。串聯親和純化技術與常規的親和純化技術相比具有更多優點，因為這第一節蛋白質標記第二節構建表達標記蛋白的細胞或組織第三節細胞抽提物的準備第四節串聯親和純化(TAP)第五節蛋白質復合體的鑒定第一章TAP的原理與方法第一節蛋白質標記第一章TAP的原理與方

運用TAP技術純化蛋白質復合體的流程主要包括構建表達標記蛋白的細胞或組織、準備細胞抽提物、串聯親和純化和分析鑒定。

運用TAP技術純化蛋白質復合體的流程主要包括構建表達標TAP技術通過在目的蛋白的一端嵌入一段由金黃色葡萄球菌蛋白A(ProA)的IgG結合區和鈣調蛋白結合區(CBP)構成，中間被一個TEv蛋白酶的酶切位點隔開的蛋白質標記。當蛋白質標記在目標蛋白的兩端時，這兩段結合區的順序有所不同，但始終要保證最終表達的融合蛋白中蛋白A的IgG結合區在外端(見圖1)。這樣使得被標記的目的蛋白其表達量與其在細胞中自然表達水平相當，避免了由于過量表達導致非自然條件下的蛋白質相互作用。通過兩步連續的親和純化獲得更接近自然狀態的特定蛋白質復合體。1.1蛋白質標記

TAP技術通過在目的蛋白的一端嵌入一段由金串聯親和純化技術的研究進展課件

普通的分子克隆技術可以將這一段編碼蛋白質標記的基因片段導入目標蛋白編碼基因的特定部位．將帶有標記基因的載體導入感受態細胞，并通過基因重組將內源性的目標蛋白基因置換為標記基因，其結果不僅可以在生理條件下得到標記蛋白及與之作用的蛋白質，而且標記蛋白的表達量與其在自然條件下的表達量相當，避免了由于過量表達導致非自然條件下的蛋白質相互作用。1.2構建表達標記蛋白的細胞或組織

普通的分子克隆技術可以將這一段編碼蛋白質標

各種準備細胞抽提物的策略都可以應用于串聯親和純化，但是有兩點需要注意：（1）各種不同的純化策略都必須盡量保證能夠降低非特異性相互作用的干擾，同時盡可能不要破壞自然存在的相互作用。（2）不同細胞器內的蛋白質有可能會因為細胞破碎后混在一起，形成非自然的蛋白質降解，這種情況可以通過降低溫度，縮短破碎時間，加入各種各樣的蛋白酶抑制劑來避免。1.3細胞抽提物的準備各種準備細胞抽提物的策略都可以應用于串聯

將細胞抽提物加入lgG親和柱，標記蛋白一端的ProtA結合區就會與親和柱上的IgG形成很強的結合，即使用比較嚴謹的洗脫條件，也不會使標記蛋白及與其作用的蛋白質所形成的蛋白質復合體被洗脫下來。這樣就降低了非特異性的蛋白質相互作用，同時也保留了絕大部分自然存在的相互作用。然后用TEv蛋白酶切割標簽ProA，釋放仍掛有CBP的蛋白復合物；在鈣離子存在的情況下，將上面的純化產物與鈣調蛋白包被的親和珠一起孵育，通過CBP親和標簽復合物再次被純化，最后在溫和的條件下利用EG—TA洗脫除去雜蛋白和TEv蛋白酶剩余物。通過這樣的兩步連續純化就可得到高純度的天然構象的蛋白(見圖2)C93。1.4串聯親和純化(TAP)

將細胞抽提物加入lgG親和柱，標記蛋白串聯親和純化技術的研究進展課件

對通過串聯親和純化得到的蛋白質復合體的鑒定有很多種方法，這里只舉部分案例。（1）可以將最后一步洗脫得到的復合物在SDS一聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS—PAGE)或二維電泳上分離，然后用質譜或者蛋白質測序來鑒定復合體的各個組分。（2）可以對蛋白質復合體進行體外活性測定，以及通過電鏡觀察復合體結構等。1.5蛋白質復合體的鑒定對通過串聯親和純化得到的蛋白質復合體的鑒

通過TAP技術最終可以發現細胞中新的蛋白質復合體或者鑒定已發現復合體中新的組分．TAP技術能夠向我們提供大量蛋白質復合體的信息，隨著積累的蛋白質復合體的數據增加，還可以建立蛋白質復合體相互作用的網絡，建立這種網絡的前提是認為含有共同組分的蛋白質復合體之間一定存在功能上的聯系，而且研究者們越來越認為很多細胞功能是由蛋白質復合體或者通過蛋白質復合體相互作用共同實現的，因此這種方法建立起來的蛋白質組水平上的相互作用網絡圖，能夠代表細胞各種生命行為的物質基礎。通過TAP技術最終可以發現細胞中新的蛋白第一節TAP在蛋白質組學研究中的應用

2.1.1在酵母蛋白質學中的應用

2.1.2在大腸桿菌蛋白質學中的應用

2.1.3在研究高等真核生物中蛋白相互作用的應用

2.1.4在哺乳動物蛋白質學中的應用

2.1.5在植物蛋白質中應用第二節TAP與其他技術聯用第二章TAP技術的應用

第一節TAP在蛋白質組學研究中的應用第二章1999年，Rigaut等將兩個ProteinA的IgG結合單元(ProtA與鈣調蛋白結合肽(calmodulinbindingpeptide,CBP)相連，中間以煙草花葉病毒(TMV)的特異性酶切位點相隔，這便是最初的TAP標簽。Rigaut利用該標簽成功地在釀酒酵母中純化出了大量蛋白質復合體，也就此創立了串聯親和純化技術。

1999年，Rigaut等將兩個ProteinA的IgG結短短十年之后，TAP與質譜技術(massspectrometry,MS)聯用(TAP-MS)已成為一種高效且實用的方法在生物大分子相互作用領域中被廣泛應用。近些年，隨著TAP標簽的全面改進和質譜技術的不斷發展，TAPMS的靈敏度與專一性得到很大提高，使得該技術得以在更多領域發揮重要作用，也使得我們對蛋白質復合體進行系統性研究成為可能。隨著該技術的不斷成熟，TAP技術迅速向各個領域擴展。如今，TAP已經在病毒、細菌、原生動物、植物以及哺乳動物等多個領域發揮著積極作用。短短十年之后，TAP與質譜技術(massspectrome

目前，TAP技術與質譜技術的聯用，以及質譜技術的自動化，使得大規模地分析相互作用的蛋白質在技術上成為可能。這樣大規模、全細胞地分析蛋白質之間的相互作用可以向人們展示出細胞內蛋白質復合體之間的相互作用網絡圖。這種相互作用的網絡圖是我們準確理解蛋白質功能，揭開各種細胞運營生命奧秘的又一重要信息平臺。目前TAP技術雖然僅在下面幾個方面得到了應用，但隨著該技術的不斷發展完善，其應用的前景會越來越廣闊。2.1TAP在蛋白質組學研究中的應用

目前，TAP技術與質譜技術的聯用，以及質TAP技術首先是在芽殖和裂殖酵母中得到成功的應用，因為這種技術不同于傳統的蛋白標記技術，在酵母中可以通過同源重組達到快速、大量的標記效果。TAP技術較其他蛋白質作用的研究方法優勢在于：可以鑒定出在空間上非直接物理相互作用的蛋白分子。

2.1.1在酵母蛋白質學中的應用TAP技術首先是在芽殖和裂殖酵母中得到成功的應用，因為這種技Gavin等在酵母細胞中用TAP標簽標記了1739個(約1／4酵母蛋白)編碼基因，最后通過串聯純化得到589個標記的靶蛋白，并通過MALDI．TOFMS和生物學信息對其中的232個蛋白質復合體進行了鑒定分析。同時發現344種蛋白的新功能。Ybon等運用該技術分析發現了APC復合體中有13個組分，而傳統的遺傳和生化技術只鑒定出了11種組分。Bouveret等通過這種技術發現了一種新的類Sm蛋白質復合體，這種復合體參與mRNA的降解過程。F0rler利用這一技術與RNA干涉技術結合研究酵母等較高級真核生物的蛋白質組功能。Gavin等在酵母細胞中用TAP標簽標記了1739個(約1／2003年，Gully等率先運用TAP對大腸桿菌酰基載體蛋白(ACP)進行研究。長期以來，大腸桿菌都是生命科學研究中最重要的模式生物之一，但有關大腸桿菌的系統蛋白質組研究卻直到2005年才由Butland等進行了首次報道。他們的研究不僅證實了許多之前預測的蛋白質復合體，還發現了許多已知蛋白質間新的相互作用，也讓我們深入地了解了很多原核生物保守蛋白質間的微觀拓撲結構。

2.1.2在大腸桿菌蛋白質學中的應用

2003年，Gully等率先運用TAP對大腸桿菌酰基載體蛋作為一種原核生物，大腸桿菌的結構比真核生物簡單，導入標簽蛋白質的難度也要低于哺乳動物和酵母，且基因易于操控。因此，TAP技術在原核生物中應用時選用親和性較低的傳統酵母TAP標簽即可。因此，在目前有關大腸桿菌TAP的報道中，基本都是沿用傳統的酵母TAP標簽(Rigaut實驗中所使用的標簽)進行研究，少有標簽的改進。

作為一種原核生物，大腸桿菌的結構比真核生物簡單，導入標簽蛋白雖然TAP技術能夠對酵母細胞蛋白質的相互作用進行大規模地研究，但在高等真核細胞中的應用卻受到限制，這是因為在高等真核細胞中難以進行原位蛋白標記，以及存在內源表達的蛋白質干擾，和蛋白質翻譯后調控機制的不同等因素。最近Forler等將TAP技術與RNAi技術聯用，發現可以很大程度上降低上述問題的影響。目前這種聯用的技術被稱為iTAP，而且已經在果蠅的s2細胞中得到了成功的應用。2.1.3在研究高等真核生物中蛋白相互作用的應用

雖然TAP技術能夠對酵母細胞蛋白質的相互作用進行大規模地研究TAP技術被認為能廣泛應用于系統繪制各物種的蛋白質相互作用圖譜。該技術目前在繪制人類細胞系統全蛋白質相互作用圖譜中也發揮了很大作用。除此之外，TAP技術還被應用于研究復雜的生化反應路徑及機制，如人類轉錄機器的研究和鼠胚胎干細胞多能性的研究等。2.1.4在哺乳動物蛋白質學中的應用

TAP技術被認為能廣泛應用于系統繪制各物種的蛋白質相互作用圖Bouwmeester等在研究信號轉導途徑的過程中，為了探尋a-腫瘤壞死因子與核轉錄因子的分子通路，標記了與該通路相關或疑似相關的32個蛋白質，采用TAP-MS技術，成功鑒定出與該途徑相關的221個蛋白質復合體，包括80個從未發現的相互作用蛋白質以及10個重要的功能分子。

Goldfinger等在傳統TAP標簽的基礎上進行優化，構造了新的N端標簽，建立了第一個哺乳動物細胞內與Ras相互作用的蛋白質數據庫。Bouwmeester等在研究信號轉導途徑的過程中，為了探TAP在植物中的應用目前還較有限，由于植物蛋白質表達量較低，而適合植物使用的標簽還較少，所以純化效率不高。目前大多數提純方案采用傳統TAP標簽或TAPi(improvedTAP)標簽。二者都已成功應用于擬南芥和水稻蛋白質復合體的提純。另外，一種替代型TAP標(alternativeTAPtag,TAPa)也被報道，用于純化擬南芥的蛋白質復合體。2.1.5在植物蛋白質中應用

TAP在植物中的應用目前還較有限，由于植物蛋白質表達量較低，2008年以來，有人開始運用新型GS-TAP標簽，即基于ProtG和鏈霉抗生物素蛋白結合肽(streptavidinbindingpeptide,SBP)的TAP標簽對植物進行研究，取得了較好效果，顯示出TAP技術在植物蛋白復合物領域也具有一定的應用潛力。

2008年以來，有人開始運用新型GS-TAP標簽，即基于

與其他技術聯用，可發揮TAP的更大潛能人們在逐步改善TAP技術自身缺陷的同時，還嘗試將其與其它工具聯合使用，這使TAP在研究蛋白質相互作用領域發揮著越來越重要的作用。2.2TAP與其他技術聯用與其他技術聯用，可發揮TAP的更大潛能人Lavoie等采用的實驗方法能夠基于TAP、HA、MYC標簽進行PCR介導的同源重組。標簽標記蛋白質可以被用來進行串聯親和純化或染色質免疫沉淀和基因芯片分析。Kobayashi等設計了一種新型標簽，將八聚組氨酸(8×His)、鏈霉素結合肽(SBP)和C端Myc標簽串聯到綠色熒光蛋白(GFP)的一個環里，使得這個新型標簽具有蛋白質定位和蛋白質純化雙重作用。這種TAP與免疫熒光技術相結合的設計為我們更深入了解蛋白質的內部信息提供了方便。Lavoie等采用的實驗方法能夠基于TAP、HA、MYC標簽第一節標簽系統的改進

3.1.1N末端TAP標簽

3.1.2分離式標簽

3.1.3差減式標簽第二節純化方法的改進

第三章TAP技術改進

第一節標簽系統的改進第三章TAP技術改進最初人們廣泛采用上述的C末端TAP標簽，后來，隨著研究的深入，研究者，發現C末端多肽的引入會嚴重損害一些目的蛋白的功能,產生生長缺陷甚至死亡，并將融合蛋白載體平行導入單倍體和二倍體細胞加以驗證，仍不能解決以上問題。3.1.1N末端TAP標簽

3.1標簽系統的改進最初人們廣泛采用上述的C末端TAP標簽，后來，隨著研究的深入為了處理上述問題，Puig等發展了N末端TAP標簽，如圖3所示.N末端TAP標簽具有與C末端TAP標簽相同的模體，但模體順序卻是相反的。為了使ProtA模體在第一步純化中便于切除，N端TAP標簽基因后緊接靶基因，同時，在N末端TAP標簽的CBP模體后加入一腸激酶(EK)切位點，便于從融合蛋白中去除標簽殘基。為了處理上述問題，Puig等發展了N末端TAP標簽，如當不同復合物的兩個亞基存在協同作用并可形成一個新的復合物時，由于其相互作用的部分較小，大部分亞基仍保持游離狀態或兩個亞基主要是與其他復合物蛋白緊密結合。用分離式標簽可將這一含量稀少的特定復合物分離出來。它的策略是將