如何獲得重組蛋白？如何獲得重組蛋白？重組蛋白制備重組表達載體構建目標蛋白重組表達最高效的蛋白分離純化方法——親合純化重組蛋白制備重組表達載體構建重組表達載體構建重組表達載體構建基因克隆基因克隆(GeneCloning): 亦稱分子克隆技術。將某特定基因或DNA片段插入到載體分子中,并篩選獲得純化(克隆)重組子的技術。基因克隆基因克隆(GeneCloning):基因克隆程序1）目的基因片段獲得2）目的載體的獲得3）目的基因與載體DNA的限制性酶切4）酶切目的基因與載體DNA片段的連接重組5）連接重組質粒轉化大腸桿菌6）含目的基因插入片段的重組子鑒定基因克隆程序1）目的基因片段獲得重組蛋白制備基因克隆所需通用材料需要克隆的目的DNA片段。克隆載體，用于接入目的DNA片段。限制性內切核酸酶，消化目的DNA片段與克隆載體，產生連接反應所需要的DNA粘性末端。DNA連接酶，將目的DNA片段與克隆載體連接在一起，構建重組載體。大腸桿菌感受態細胞，用于篩選含有插入目的DNA片段的陽性克隆。基因克隆所需通用材料需要克隆的目的DNA片段。基因克隆流程圖基因克隆流程圖一、目的基因片段獲取1）聚合酶鏈式反應——PCR2）反轉錄-聚合酶鏈式反應——RT-PCR一、目的基因片段獲取1）聚合酶鏈式反應——PCRPCR

PCR：

PolymeraseChainReaction

多聚酶鏈式反應 美國KaryB.Mullis1985年建立

(1993諾貝爾化學獎獲得者)PCR PCR：PCR反應的三個基本步驟模板雙鏈DNA的變性：～94℃引物與單鏈模板的退火：～55℃引物的延伸：～70℃

一個PCR循環(PCRcycle)包括變性—退火—延伸三個步驟；理論上可使靶序列數量增加一倍。

30個循環后，可獲得106個靶分子PCR反應的三個基本步驟模板雙鏈DNA的變性：～94℃PCR循環PCR循環PCR反應五要素DNA聚合酶：影響PCR反應的產量引物：影響PCR反應特異性的關鍵因素dNTP：影響PCR反應擴增效率的關鍵因素模板：決定PCR反應成敗的關鍵環節之一Mg2+：影響PCR反應擴增的特異性和產量PCR反應五要素DNA聚合酶：影響PCR反應的產量RT-PCR以RNA作為模板，反轉錄酶合成互補DNA（cDNA）以cDNA作為模板，PCR指數擴增目的基因片斷。與普通PCR相同。RT-PCR以RNA作為模板，反轉錄酶合成互補DNA（cDN反轉錄反應反應原理：反轉錄酶以RNA為模板指導互補DNA鏈合成。反應組分：polyT引物，dNTPs，mRNA模板反應特點：特異性以mRNA作為模板。注意事項：防止核酸酶A（RNaseA）污染，RNaseA會降解RNA模板，使反轉錄反應失去模板而失敗。與PCR區別：1）PCR反應為鏈式反應，產物以指數方式擴增；反轉錄為線性擴增，且只能合成一條與RNA互補的DNA鏈。2）PCR為熱循環反應，DNA聚合酶具有熱穩定性；反轉錄為常溫反應，反轉錄酶不具有熱穩定性，高溫使反轉錄酶失去酶活性。反轉錄反應反應原理：反轉錄酶以RNA為模板指導互補DNA鏈合二、限制性酶切反應反應原理 限制性內切核酸酶識別雙鏈DNA的特異性序列，并在此特異性序列處或附近切斷雙鏈DNA。反應特點 切割位點具有堿基序列特異性，只在特定堿基序列處切斷雙鏈DNA。注意事項 a不同限制性內切核酸酶反應緩沖液有很大差別， b一部分限制性內切核酸酶活性受DNA識別序列甲基化修飾影響二、限制性酶切反應反應原理三、克隆載體－質粒質粒的相關概念可以在宿主細胞內進行復制的環形DNA分子。不同質粒在宿主細胞內的分子數(拷貝數)不同。在體外不能復制、傳代；但DNA可長期保存生命活力。微生物基因組DNA不再具有生命活力。根據宿主細胞差異，質粒分為多種類型。根據用途差異，質粒分為:克隆載體和表達載體。人工構造的質粒具有的必需功能元件：復制起始區、抗性篩選標記、多克隆位點。三、克隆載體－質粒質粒的相關概念pUC18質粒圖譜

pUC18質粒圖譜pUC18多克隆位點pUC18多克隆位點四、DNA連接反應反應原理：DNA連接酶催化DNA分子3’羥基（3’-OH）與5’磷酸基團（5’-P）間形成磷酸二酯鍵反應組分：DNA連接酶及相應輔基，DNA分子。DNA連接種類：1）ATP作輔基的DNA連接酶，例如T4DNA連接酶，pfuDNA連接酶2）NAD＋作輔基的DNA連接酶，例如大腸桿菌DNA連接酶應用：1）DNA重組構建重組質粒

2）DNA連接反應檢測單核苷酸多態性

四、DNA連接反應反應原理：DNA連接酶催化DNA分子3’羥連接反應獲取重組環狀DNA分子連接反應獲取重組環狀DNA分子五、DNA轉化反應DNA轉化原理 在某些特殊生理條件下，宿主細胞可以高效吸收外源DNA，從而將外源DNA轉入特定宿主菌。DNA轉化方法1）化學轉化：用某些二價金屬離子，例如50mMCaCl2，處理宿主細胞，使宿主細胞處于高效吸納外源DNA的生理狀態，稱之為感受態。之后將外源DNA轉化進入宿主菌細胞。2）電轉化：高電壓瞬時處理（電擊）宿主菌，可使宿主菌處于極高效吸納外源DNA的生理狀態。電轉化效率是化學轉化效率的10－100倍。主要應用將可自我復制的外源DNA，如各種質粒，轉入宿主菌，并在宿主菌內繁殖這些質粒，實現相應質粒的大規模制備。五、DNA轉化反應DNA轉化原理六、重組質粒鑒定方法1）PCR鑒定利用目的基因特異性的引物，重組質粒作為模板，利用PCR進行鑒定。若能擴增出DNA產物，則重組質粒含有目的基因；反之不含目的基因，為空質粒。2）限制性酶切鑒定利用插入目的基因時所用的限制性內切核酸酶消化重組質粒，若能產生對應大小的DNA片段，重組質粒含有目的基因；反之不含目的基因，為空質粒。3）DNA序列測定鑒定

將重組質粒進行DNA序列測定，在堿基序列水平驗證插入片段的存在。六、重組質粒鑒定方法1）PCR鑒定蛋白誘導表達蛋白誘導表達蛋白誘導表達蛋一、重組蛋白表達系統原核表達系統：表達載體中的重組蛋白表達元件是原核生物特有的，表達宿主也是各種原核生物，例如大腸桿菌。真核表達系統：重組蛋白表達元件是真核生物特異性的，表達宿主為各種真核生物，例如啤酒酵母、昆蟲、哺乳動物細胞。無細胞翻譯系統：不需要宿主細胞，只需要把目的蛋白的mRNA加入無細胞翻譯系統，37度保溫一段時間即可合成出毫克級的目標蛋白質。優勢主要是目標蛋白純化簡便。一、重組蛋白表達系統原核表達系統：原核表達系統

根據原核表達載體中用于表達重組蛋白的必需元件的差異，主要是啟動子、識別并結合啟動子的RNA聚合酶、誘導物的差異，常用的原核表達系統有:T7-lacI表達系統由T7RNA聚合酶結合在T7啟動子上，轉錄合成目標蛋白的mRNA分子。誘導物為isopropyl-β-D-thiogalactoside（IPTG，異丙基-b-D-硫代半乳糖苷），無誘導物時，T7啟動子控制的外源基因的轉錄受lacI蛋白抑制。

代表：PET系列載體原核表達系統根據原核表達載體中用于表達重組蛋白的必需重組蛋白制備表達載體 含有一個啟動子序列,能有效地促使插入的目的基因進行轉錄,進而翻譯出該插入基因編碼的蛋白產物的載體。 表達載體的啟動子通常與其受體同源,如以大腸桿菌為受體的表達載體,其啟動子來源于大腸桿菌系統;在痘苗病毒中表達的啟動子則來源于痘苗病毒。表達載體 含有一個啟動子序列,能有效地促使插入的目的基因進行表達質粒構成元件復制起點抗生素選擇標記基因多克隆位點用于DNA序列測定的區域重組蛋白表達元件

1）啟動子（promotor）：RNA聚合酶結合位點，負責轉錄合成外源插入基因的mRNA分子。2）S-D序列：核糖體結合位點（ribosomebindingsequence，RBS），核糖體結合在mRNA分子的RBS上，起始蛋白翻譯，合成重組蛋白質。

3）阻遏蛋白編碼基因（repressor）

4）轉錄調控序列（阻遏蛋白結合序列）5）轉錄終止序列（terminator）

6）純化標簽編碼序列表達質粒構成元件復制起點阿拉伯糖表達系統：

大腸桿菌RNA聚合酶負責轉錄pBAD啟動子控制的外源基因轉錄。屬于嚴緊型表達系統，目標蛋白mRNA分子的轉錄過程可以通過誘導物的調控來達到嚴格的開放/關閉狀態，誘導物L-阿拉伯糖(L-arabinose)濃度連續變化實現外源重組蛋白表達水平的連續調控。無誘導物時，pBAD啟動子控制的外源基因的轉錄受araC蛋白抑制。阿拉伯糖表達系統：重組蛋白制備色氨酸－lacI表達系統（Trp-lac）：

大腸桿菌RNA聚合酶轉錄Ptrp啟動子控制的外源基因轉錄。誘導物為IPTG，無誘導物時，外源基因的轉錄受lacI蛋白抑制。色氨酸－lacI表達系統（Trp-lac）：重組蛋白制備真核表達系統酵母表達系統啤酒酵母，可表達在啤酒酵母細胞內的表達載體上編碼的重組蛋白；甲醇酵母，表達的重組蛋白的編碼基因與各種必需的表達元件已整合到甲醇酵母基因組中。昆蟲表達系統具有昆蟲特異性的啟動子，外源基因處于啟動子下游。哺乳細胞表達系統哺乳細胞病毒特異性啟動子，外源基因處于該啟動子下游，調控外源基因轉錄過程。生物加工廠轉基因動物，基因組中整合了目標蛋白的編碼基因與表達元件，轉寄因雞、豬、牛、羊等真核表達系統酵母表達系統無細胞翻譯系統大腸桿菌無細胞翻譯系統即大腸桿菌細胞裂解液。大腸桿菌細胞有一定要求，一般是核酸酶與蛋白酶缺失突變株，核酸酶缺失大大降低了mRNA的降解，而蛋白酶的缺失降低了合成的目標蛋白的降解，從而提高目標蛋白產量。一般用于表達原核生物蛋白。兔網織紅細胞無細胞翻譯系統一般用于合成真核生物蛋白，可以保證有效的進行蛋白翻譯后的各種修飾。無細胞翻譯系統大腸桿菌無細胞翻譯系統重組蛋白制備重組蛋白制備蛋白純化蛋白純化重組蛋白純化標簽6XHis：6個連續組氨酸GST：谷光甘肽轉移酶ChtinBindingDomain：幾丁質結合結構域MaltoseBindingProtein：麥芽糖結合蛋白Biotinatedpeptide：生物素化多肽鏈StepTagII：短肽序列，生物素功能類似物FLAG（DYKDDDDK）：短肽序列，Stag：短肽序列，結合Stag抗體T7tag：短肽序列，結合T7tag抗體重組蛋白純化標簽6XHis：6個連續組氨酸選擇親和標簽時需考慮的因素親和標簽是否會影響目標蛋白的結構和功能（小）蛋白質的穩定性親和標簽所融合的位置（N端，C端）是否需在變性條件下進行親和純化（標簽適合否）親和標簽對表達水平的影響（標簽、蛋白、系統）是否需標簽具有鑒定功能親和洗脫的條件（不使蛋白變性）親和介質和緩沖液的費用是否在親和純化后去除標簽選擇親和標簽時需考慮的因素親和標簽是否會影響目標蛋白的結構和His標簽和金屬螯合親和層析金屬螯合層析原理：基于蛋白質表面的一些特定的氨基酸殘基側鏈，尤其是組氨酸，在中性和弱堿性條件下可以和固定化的金屬離子相互作用，如Ni2+、Zn2+和Co2+，從而分離蛋白質。His標簽是目前應用最為廣泛的親和標簽。His標簽和金屬螯合親和層析金屬螯合層析原理：基于蛋白質表面重組蛋白制備His標簽優缺點優點：標簽分子量小，一般不影響目標蛋白的功能；可用于變性/非變性純化；免疫原性相對較低，可直接用于抗體制備；可應用于多種表達系統，純化條件溫和；可和其它親和標簽共同構建雙親和標簽。缺點：融合蛋白易形成包涵體，包涵體蛋白難于溶解；包涵體溶解后不能正確復性；層析時螯和的金屬離子容易泄漏；非特異性結合會造成制品純度不高。His標簽優缺點優點：谷胱甘肽巰基轉移酶蛋白標簽(GST)最早使用的親和標簽。目標蛋白加于GST的C端，再利用谷胱甘肽親和介質進行純化，或固定在親和介質上進行蛋白質-蛋白質互作研究。因GST分子量較大，且以二聚體的形式存在，一般都需要去除融合標簽。此系統必須依賴于GST的正確折疊。GST融合蛋白常用來免疫動物生產抗體，及作為載體蛋白進行一些蛋白的結晶。谷胱甘肽巰基轉移酶蛋白標簽(GST)最早使用的親和標簽。幾丁質結合肽IMPACT系統使用幾丁質結合肽（來源于環狀芽胞桿菌）作為融合標簽，表達的融合蛋白可以用幾丁質親和層析純化，利用內含肽（intein）的特異性原位剪切直接獲得目標蛋白。最大優點：不需使用蛋白酶來去除融合標簽。包括以下幾類：巰基誘導的N端剪切系統；巰基誘導的C端剪切系統；pH誘導的C端剪切系統；可用于蛋白質環化的雙內含肽系統。幾丁質結合肽IMPACT系統使用幾丁質結合肽（來源于環狀芽胞基于幾丁質與幾丁質結合結構域的親合純化基于幾丁質與幾丁質結合結構域的親合純化麥芽糖結合蛋白（MBP）此系統使用交聯直鏈淀粉的親和介質純化，用麥芽糖進行競爭性洗脫。優點：MBP不含有半胱氨酸殘基，不會干擾目標蛋白形成正確的二硫鍵；使用的介質價格低廉；可在溫和條件下洗脫融合蛋白；加上其分泌信號，可以進行分泌表達在細胞周質；這一系統最顯著的特點是與MBP進行融合表達可以改善目標蛋白的溶解性，促進正確折疊，提高活性蛋白的回收率麥芽糖結合蛋白（MBP）此系統使用交聯直鏈淀粉的親和介質純化MBP標簽親合純化MBP標簽親合純化重組蛋白制備SDS－PAGE圖譜重組蛋白制備SDS－PAGE圖譜與抗生物素蛋白特異結合的親和標簽生物素-抗生物素蛋白（Avidin-Biotin）是目前最強的親和作用之一。StrepTag系統是通過篩選噬菌體隨機肽庫得到的短肽（含9個氨基酸殘基），將其進行目標蛋白的C端融合可模擬生物素和鏈霉抗生物素蛋白特異性相互作用，使用亞胺生物素洗脫。這一系統不能進行N端融合，而且變性劑會影響親和相互作用。后發展的8氨基酸StreptagⅡ標簽，本身并不能生物素化，卻可模擬生物素的功能和鏈霉抗生物素蛋白變體Strep-Tactin特異性的相互作用，可加在蛋白的N端和C端，使用便宜的脫硫生物素進行洗脫，且StreptagⅡ和Strep-Tactin相互作用不受變性劑的影響，可在變性條件下純化。與抗生物素蛋白特異結合的親和標簽生物素-抗生物素蛋白（Avi基于親合素與生物素的親合純化基于親合素與生物素的親合純化FLAG標簽，T7標簽和S標簽FLAG肽序列（DYKDDDDK）親水性很強，片段小，且具有腸激酶的酶切位點，一般不會影響目標蛋白活性。昂貴。T7標簽：T7基因10蛋白的最前面11個氨基酸，通過免疫親和層析進行純化。S標簽：15個氨基酸的多肽標簽，可以特異性的和S-蛋白介質結合。由于S標簽和S-蛋白結合形成有活性的核糖核酸酶，可靈敏的定量檢測融合蛋白。FLAG標簽，T7標簽和S標簽FLAG肽序列（DYKDDDD親和標簽分子大小結合配體融合部位洗脫條件注釋谷胱甘肽巰基轉移酶(GST)220aa谷胱甘肽N端還原型谷胱甘肽pGEX,pET41,pET42,可進行表達蛋白檢測融合蛋白形成二聚體幾丁質結合結構域(CBD)56aa幾丁質N端或C端誘導剪切pTYB,pTWIN麥芽糖結合蛋白(MBP)396aa直鏈淀粉N端或C端麥芽糖pMAL可分泌表達,可改善溶解性PinPoint(可生物素化蛋白)13kDaavidinN端生物素PinPoint可進行表達蛋白檢測StreptagⅡ(非生物素化親和)8aaStreptavdinN端或C端脫硫生物素pPR-IBA,pASK-IBA可進行分泌表達可進行表達蛋白檢測,可進行目標蛋白固定化,可在變性條件下純化組氨酸標簽(PolyHis)6,8,10,18aa螯和Ni2+N端或C端咪唑/低pHpET,pHAT,pQE可在變性條件下純化FLAG標簽8aa單抗M1/M2M1:N端M2:N端/C端M1:EDTAM2:低pH或合成的FLAG肽p-FLAG,p3×FLAG已具有腸激酶酶切位點S標簽15aaRNaseA的S片段N端或C端低pHpET可進行表達水平的監測T7標簽11aa單抗N端低pHpET可增強表達水平可在弱變性條件下純化親和標簽分子大小結合配體融合部位洗脫條件注釋谷胱甘肽巰基轉移親和標簽的去除三種情況不必去除標簽：目標蛋白作為免疫原用來產生和純化抗體；目標蛋白的生物活性不受融合標簽的影響；目標蛋白用來直接固定化在介質上。去除法：化學法（廉價，缺乏選擇，反應劇烈）

酶法（溫和，特異性強，成本較高）親和標簽的去除三種情況不必去除標簽：剪切方法剪切位點序列注釋

化學法溴化氰Met^需70%甲酸，室溫羥胺Asn^GlypH＝9，需加熱，甲酸Asp^Pro70%甲酸，需加熱酶法腸激酶Asp-Asp-Asp-Asp-Lys^內切酶賴氨酸后為脯氨酸不能剪切其它堿性氨基酸殘基后有非特異性剪切具有活性的pH范圍為4.5到9.5，溫度范圍4℃到45℃凝血因子Ⅹa蛋白酶Ile-Glu/Asp-Gly-Arg^內切酶精氨酸后為脯氨酸和精氨酸不能剪切在Gly-Arg后為非特異性剪切凝血酶Leu-Val-Pro-Arg^Gly-Ser牛來源內切酶存在非特異性剪切生物素化后可用鏈霉抗生物素蛋白親和層析清除PreScission蛋白酶Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln^Gly-ProGST融合的鼻病毒蛋白酶，內切酶具有最優活性rTEV蛋白酶Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln^Gly重組的煙草蝕紋病毒蛋白酶，內切酶具有8個氨基酸識別位點高特異性寬溫度范圍里具有活性與His-tag融合后，酶切后使用金屬螯合親和層析清除二肽基氨基肽酶(Xaa)2n^Xaa-Pro,(Xaa)2n^Xaa-Xaa–Pro,(Xaa)2n^Lys/Arg/Gln外切酶終止氨基酸為Gln時，可在谷氨酰胺環轉移酶和焦谷氨酰胺肽酶作用下去掉Gln，可產生天然目標蛋白質特異性強剪切方法剪切位點序列注釋化學法溴化氰Met^需70%甲酸，親和層析：最高效的分離純化方法

基于蛋白質和親和配體的特異性相互作用。

用于親和層析的配體可以是針對抗原的抗體、針對蛋白質分子的受體、酶的底物或抑制劑、針對糖分子的凝集素、活性染料、金屬離子、天然或改造過的相互作用多肽等等。

利用DNA重組技術，進行目標蛋白的融合表達，再用親和層析進行分離純化，已成為蛋白質表達純化的常用手段。親和層析：最高效的分離純化方法其它蛋白純化技術分子篩分離：過濾、凝膠阻滯分離離子相互作用力：離子交換色譜疏水性相互作用：疏水相互作用層析等電聚焦：等電聚焦純化其它蛋白純化技術分子篩分離：過濾、凝膠阻滯分離層析技術在分離純化中的應用凝膠過濾層析（分子篩層析）：

基于液相的分離，凝膠包裹的內環境形成固定相，凝膠的外環境形成流動相，蛋白質分子越大越不容易滲透進入固定相。離子交換層析：

基于蛋白質與離子交換介質電荷間的相互作用。高于等電點，蛋白質帶負電荷，低于等電點蛋白質帶正電荷，不同的蛋白質在一定的pH條件下與介質上的離子之間相互作用不同，而產生不同的選擇性。層析技術在分離純化中的應用凝膠過濾層析（分子篩層析）：重組蛋白制備重組蛋白制備疏水層析：

基于蛋白質表面的疏水區和介質疏水配體間的相互作用。高鹽條件下，蛋白質的疏水區表面的水分子被鹽離子破壞而釋放，裸露的疏水區與疏水配體相互作用而被吸附；隨著鹽濃度降低，相互作用也降低，水化層又形成，蛋白質最終解吸附。疏水層析的選擇性依賴于疏水配體的結構。疏水層析：等點聚焦層析：

基于蛋白質等電點不同的分離。以陰離子交換劑為固定相為例，兩性電解質緩沖液和離子交換基團相互作用形成pH梯度，蛋白質在pH大于其等電點時吸附，在pH低于其等電點時解吸附。由于蛋白質區帶后部所處微環境的pH總是低于其前部所處微環境的pH，后部區帶的蛋白質先于前部開始移動，產生聚焦效應。可分離等電點僅差0.02的蛋白質。等點聚焦層析：層析方法親和層析凝膠過濾層析離子交換層析疏水層析分離機制特異性親和大小電荷疏水性選擇性非常高中等高高→中等載量高低高高純化速度中等中等→低高高生物相容性好非常好好中等→好目標蛋白得率高低中等中等捕獲濃縮階段++++++++中間純化階段++++++++++精制純化階段+++++++++層析方法親和層析凝膠過濾層析離子交換層析疏水層析分離機制特異酶在純化過程中的一些技術難點：（一）雜質的除去酶提取液中，除所需酶外，還含有大量的雜蛋白、多糖、脂類和核酸等。（1）pH和加熱沉淀法

（2）蛋白質表面變性法

利用蛋白質表面變性性質的差別，也可除去雜蛋白，加入氯仿和乙醇進行震蕩，可以除去雜蛋白。酶在純化過程中的一些技術難點：（3）選擇性變性法

利用蛋白質穩定性的不同，除去雜蛋白。甚至可用2.5%三氯乙酸處理。（4）核酸沉淀劑法用核酸酶，將核酸降解成核苷酸，使粘度下降便于離心分離。用核酸沉淀劑如三甲基十六烷基溴化銨、硫酸鏈霉素、聚乙烯亞胺、魚精蛋白和二氯化錳等。（5）將酶與底物結合酶和底物結合或競爭性抑制劑結合后，熱穩定性大大提高，這樣就可用加熱法除去雜蛋白。（3）選擇性變性法（二）脫鹽和濃縮1、脫鹽脫鹽方法是透析和凝膠過濾。2、濃縮酶的濃縮方法很多，有冷凍干燥、離子交換、超濾、凝膠吸水、聚乙二醇吸水等。（三）酶的結晶把酶提純到一定純度以后（通常純度應達50%以上），可使其結晶，酶的純度經常有一定程度的提高。為研究蛋白質空間結構提供X射線衍射樣品。（二）脫鹽和濃縮（四）酶分離和純化工作的注意事項1、防止酶蛋白變性2、防止輔因子的流失3、防止酶被蛋白水解酶降解（四）酶分離和純化工作的注意事項如何獲得重組蛋白？如何獲得重組蛋白？重組蛋白制備重組表達載體構建目標蛋白重組表達最高效的蛋白分離純化方法——親合純化重組蛋白制備重組表達載體構建重組表達載體構建重組表達載體構建基因克隆基因克隆(GeneCloning): 亦稱分子克隆技術。將某特定基因或DNA片段插入到載體分子中,并篩選獲得純化(克隆)重組子的技術。基因克隆基因克隆(GeneCloning):基因克隆程序1）目的基因片段獲得2）目的載體的獲得3）目的基因與載體DNA的限制性酶切4）酶切目的基因與載體DNA片段的連接重組5）連接重組質粒轉化大腸桿菌6）含目的基因插入片段的重組子鑒定基因克隆程序1）目的基因片段獲得重組蛋白制備基因克隆所需通用材料需要克隆的目的DNA片段。克隆載體，用于接入目的DNA片段。限制性內切核酸酶，消化目的DNA片段與克隆載體，產生連接反應所需要的DNA粘性末端。DNA連接酶，將目的DNA片段與克隆載體連接在一起，構建重組載體。大腸桿菌感受態細胞，用于篩選含有插入目的DNA片段的陽性克隆。基因克隆所需通用材料需要克隆的目的DNA片段。基因克隆流程圖基因克隆流程圖一、目的基因片段獲取1）聚合酶鏈式反應——PCR2）反轉錄-聚合酶鏈式反應——RT-PCR一、目的基因片段獲取1）聚合酶鏈式反應——PCRPCR

PCR：

PolymeraseChainReaction

多聚酶鏈式反應 美國KaryB.Mullis1985年建立

(1993諾貝爾化學獎獲得者)PCR PCR：PCR反應的三個基本步驟模板雙鏈DNA的變性：～94℃引物與單鏈模板的退火：～55℃引物的延伸：～70℃

一個PCR循環(PCRcycle)包括變性—退火—延伸三個步驟；理論上可使靶序列數量增加一倍。

30個循環后，可獲得106個靶分子PCR反應的三個基本步驟模板雙鏈DNA的變性：～94℃PCR循環PCR循環PCR反應五要素DNA聚合酶：影響PCR反應的產量引物：影響PCR反應特異性的關鍵因素dNTP：影響PCR反應擴增效率的關鍵因素模板：決定PCR反應成敗的關鍵環節之一Mg2+：影響PCR反應擴增的特異性和產量PCR反應五要素DNA聚合酶：影響PCR反應的產量RT-PCR以RNA作為模板，反轉錄酶合成互補DNA（cDNA）以cDNA作為模板，PCR指數擴增目的基因片斷。與普通PCR相同。RT-PCR以RNA作為模板，反轉錄酶合成互補DNA（cDN反轉錄反應反應原理：反轉錄酶以RNA為模板指導互補DNA鏈合成。反應組分：polyT引物，dNTPs，mRNA模板反應特點：特異性以mRNA作為模板。注意事項：防止核酸酶A（RNaseA）污染，RNaseA會降解RNA模板，使反轉錄反應失去模板而失敗。與PCR區別：1）PCR反應為鏈式反應，產物以指數方式擴增；反轉錄為線性擴增，且只能合成一條與RNA互補的DNA鏈。2）PCR為熱循環反應，DNA聚合酶具有熱穩定性；反轉錄為常溫反應，反轉錄酶不具有熱穩定性，高溫使反轉錄酶失去酶活性。反轉錄反應反應原理：反轉錄酶以RNA為模板指導互補DNA鏈合二、限制性酶切反應反應原理 限制性內切核酸酶識別雙鏈DNA的特異性序列，并在此特異性序列處或附近切斷雙鏈DNA。反應特點 切割位點具有堿基序列特異性，只在特定堿基序列處切斷雙鏈DNA。注意事項 a不同限制性內切核酸酶反應緩沖液有很大差別， b一部分限制性內切核酸酶活性受DNA識別序列甲基化修飾影響二、限制性酶切反應反應原理三、克隆載體－質粒質粒的相關概念可以在宿主細胞內進行復制的環形DNA分子。不同質粒在宿主細胞內的分子數(拷貝數)不同。在體外不能復制、傳代；但DNA可長期保存生命活力。微生物基因組DNA不再具有生命活力。根據宿主細胞差異，質粒分為多種類型。根據用途差異，質粒分為:克隆載體和表達載體。人工構造的質粒具有的必需功能元件：復制起始區、抗性篩選標記、多克隆位點。三、克隆載體－質粒質粒的相關概念pUC18質粒圖譜

pUC18質粒圖譜pUC18多克隆位點pUC18多克隆位點四、DNA連接反應反應原理：DNA連接酶催化DNA分子3’羥基（3’-OH）與5’磷酸基團（5’-P）間形成磷酸二酯鍵反應組分：DNA連接酶及相應輔基，DNA分子。DNA連接種類：1）ATP作輔基的DNA連接酶，例如T4DNA連接酶，pfuDNA連接酶2）NAD＋作輔基的DNA連接酶，例如大腸桿菌DNA連接酶應用：1）DNA重組構建重組質粒

2）DNA連接反應檢測單核苷酸多態性

四、DNA連接反應反應原理：DNA連接酶催化DNA分子3’羥連接反應獲取重組環狀DNA分子連接反應獲取重組環狀DNA分子五、DNA轉化反應DNA轉化原理 在某些特殊生理條件下，宿主細胞可以高效吸收外源DNA，從而將外源DNA轉入特定宿主菌。DNA轉化方法1）化學轉化：用某些二價金屬離子，例如50mMCaCl2，處理宿主細胞，使宿主細胞處于高效吸納外源DNA的生理狀態，稱之為感受態。之后將外源DNA轉化進入宿主菌細胞。2）電轉化：高電壓瞬時處理（電擊）宿主菌，可使宿主菌處于極高效吸納外源DNA的生理狀態。電轉化效率是化學轉化效率的10－100倍。主要應用將可自我復制的外源DNA，如各種質粒，轉入宿主菌，并在宿主菌內繁殖這些質粒，實現相應質粒的大規模制備。五、DNA轉化反應DNA轉化原理六、重組質粒鑒定方法1）PCR鑒定利用目的基因特異性的引物，重組質粒作為模板，利用PCR進行鑒定。若能擴增出DNA產物，則重組質粒含有目的基因；反之不含目的基因，為空質粒。2）限制性酶切鑒定利用插入目的基因時所用的限制性內切核酸酶消化重組質粒，若能產生對應大小的DNA片段，重組質粒含有目的基因；反之不含目的基因，為空質粒。3）DNA序列測定鑒定

將重組質粒進行DNA序列測定，在堿基序列水平驗證插入片段的存在。六、重組質粒鑒定方法1）PCR鑒定蛋白誘導表達蛋白誘導表達蛋白誘導表達蛋一、重組蛋白表達系統原核表達系統：表達載體中的重組蛋白表達元件是原核生物特有的，表達宿主也是各種原核生物，例如大腸桿菌。真核表達系統：重組蛋白表達元件是真核生物特異性的，表達宿主為各種真核生物，例如啤酒酵母、昆蟲、哺乳動物細胞。無細胞翻譯系統：不需要宿主細胞，只需要把目的蛋白的mRNA加入無細胞翻譯系統，37度保溫一段時間即可合成出毫克級的目標蛋白質。優勢主要是目標蛋白純化簡便。一、重組蛋白表達系統原核表達系統：原核表達系統

根據原核表達載體中用于表達重組蛋白的必需元件的差異，主要是啟動子、識別并結合啟動子的RNA聚合酶、誘導物的差異，常用的原核表達系統有:T7-lacI表達系統由T7RNA聚合酶結合在T7啟動子上，轉錄合成目標蛋白的mRNA分子。誘導物為isopropyl-β-D-thiogalactoside（IPTG，異丙基-b-D-硫代半乳糖苷），無誘導物時，T7啟動子控制的外源基因的轉錄受lacI蛋白抑制。

代表：PET系列載體原核表達系統根據原核表達載體中用于表達重組蛋白的必需重組蛋白制備表達載體 含有一個啟動子序列,能有效地促使插入的目的基因進行轉錄,進而翻譯出該插入基因編碼的蛋白產物的載體。 表達載體的啟動子通常與其受體同源,如以大腸桿菌為受體的表達載體,其啟動子來源于大腸桿菌系統;在痘苗病毒中表達的啟動子則來源于痘苗病毒。表達載體 含有一個啟動子序列,能有效地促使插入的目的基因進行表達質粒構成元件復制起點抗生素選擇標記基因多克隆位點用于DNA序列測定的區域重組蛋白表達元件

1）啟動子（promotor）：RNA聚合酶結合位點，負責轉錄合成外源插入基因的mRNA分子。2）S-D序列：核糖體結合位點（ribosomebindingsequence，RBS），核糖體結合在mRNA分子的RBS上，起始蛋白翻譯，合成重組蛋白質。

3）阻遏蛋白編碼基因（repressor）

4）轉錄調控序列（阻遏蛋白結合序列）5）轉錄終止序列（terminator）

6）純化標簽編碼序列表達質粒構成元件復制起點阿拉伯糖表達系統：

大腸桿菌RNA聚合酶負責轉錄pBAD啟動子控制的外源基因轉錄。屬于嚴緊型表達系統，目標蛋白mRNA分子的轉錄過程可以通過誘導物的調控來達到嚴格的開放/關閉狀態，誘導物L-阿拉伯糖(L-arabinose)濃度連續變化實現外源重組蛋白表達水平的連續調控。無誘導物時，pBAD啟動子控制的外源基因的轉錄受araC蛋白抑制。阿拉伯糖表達系統：重組蛋白制備色氨酸－lacI表達系統（Trp-lac）：

大腸桿菌RNA聚合酶轉錄Ptrp啟動子控制的外源基因轉錄。誘導物為IPTG，無誘導物時，外源基因的轉錄受lacI蛋白抑制。色氨酸－lacI表達系統（Trp-lac）：重組蛋白制備真核表達系統酵母表達系統啤酒酵母，可表達在啤酒酵母細胞內的表達載體上編碼的重組蛋白；甲醇酵母，表達的重組蛋白的編碼基因與各種必需的表達元件已整合到甲醇酵母基因組中。昆蟲表達系統具有昆蟲特異性的啟動子，外源基因處于啟動子下游。哺乳細胞表達系統哺乳細胞病毒特異性啟動子，外源基因處于該啟動子下游，調控外源基因轉錄過程。生物加工廠轉基因動物，基因組中整合了目標蛋白的編碼基因與表達元件，轉寄因雞、豬、牛、羊等真核表達系統酵母表達系統無細胞翻譯系統大腸桿菌無細胞翻譯系統即大腸桿菌細胞裂解液。大腸桿菌細胞有一定要求，一般是核酸酶與蛋白酶缺失突變株，核酸酶缺失大大降低了mRNA的降解，而蛋白酶的缺失降低了合成的目標蛋白的降解，從而提高目標蛋白產量。一般用于表達原核生物蛋白。兔網織紅細胞無細胞翻譯系統一般用于合成真核生物蛋白，可以保證有效的進行蛋白翻譯后的各種修飾。無細胞翻譯系統大腸桿菌無細胞翻譯系統重組蛋白制備重組蛋白制備蛋白純化蛋白純化重組蛋白純化標簽6XHis：6個連續組氨酸GST：谷光甘肽轉移酶ChtinBindingDomain：幾丁質結合結構域MaltoseBindingProtein：麥芽糖結合蛋白Biotinatedpeptide：生物素化多肽鏈StepTagII：短肽序列，生物素功能類似物FLAG（DYKDDDDK）：短肽序列，Stag：短肽序列，結合Stag抗體T7tag：短肽序列，結合T7tag抗體重組蛋白純化標簽6XHis：6個連續組氨酸選擇親和標簽時需考慮的因素親和標簽是否會影響目標蛋白的結構和功能（小）蛋白質的穩定性親和標簽所融合的位置（N端，C端）是否需在變性條件下進行親和純化（標簽適合否）親和標簽對表達水平的影響（標簽、蛋白、系統）是否需標簽具有鑒定功能親和洗脫的條件（不使蛋白變性）親和介質和緩沖液的費用是否在親和純化后去除標簽選擇親和標簽時需考慮的因素親和標簽是否會影響目標蛋白的結構和His標簽和金屬螯合親和層析金屬螯合層析原理：基于蛋白質表面的一些特定的氨基酸殘基側鏈，尤其是組氨酸，在中性和弱堿性條件下可以和固定化的金屬離子相互作用，如Ni2+、Zn2+和Co2+，從而分離蛋白質。His標簽是目前應用最為廣泛的親和標簽。His標簽和金屬螯合親和層析金屬螯合層析原理：基于蛋白質表面重組蛋白制備His標簽優缺點優點：標簽分子量小，一般不影響目標蛋白的功能；可用于變性/非變性純化；免疫原性相對較低，可直接用于抗體制備；可應用于多種表達系統，純化條件溫和；可和其它親和標簽共同構建雙親和標簽。缺點：融合蛋白易形成包涵體，包涵體蛋白難于溶解；包涵體溶解后不能正確復性；層析時螯和的金屬離子容易泄漏；非特異性結合會造成制品純度不高。His標簽優缺點優點：谷胱甘肽巰基轉移酶蛋白標簽(GST)最早使用的親和標簽。目標蛋白加于GST的C端，再利用谷胱甘肽親和介質進行純化，或固定在親和介質上進行蛋白質-蛋白質互作研究。因GST分子量較大，且以二聚體的形式存在，一般都需要去除融合標簽。此系統必須依賴于GST的正確折疊。GST融合蛋白常用來免疫動物生產抗體，及作為載體蛋白進行一些蛋白的結晶。谷胱甘肽巰基轉移酶蛋白標簽(GST)最早使用的親和標簽。幾丁質結合肽IMPACT系統使用幾丁質結合肽（來源于環狀芽胞桿菌）作為融合標簽，表達的融合蛋白可以用幾丁質親和層析純化，利用內含肽（intein）的特異性原位剪切直接獲得目標蛋白。最大優點：不需使用蛋白酶來去除融合標簽。包括以下幾類：巰基誘導的N端剪切系統；巰基誘導的C端剪切系統；pH誘導的C端剪切系統；可用于蛋白質環化的雙內含肽系統。幾丁質結合肽IMPACT系統使用幾丁質結合肽（來源于環狀芽胞基于幾丁質與幾丁質結合結構域的親合純化基于幾丁質與幾丁質結合結構域的親合純化麥芽糖結合蛋白（MBP）此系統使用交聯直鏈淀粉的親和介質純化，用麥芽糖進行競爭性洗脫。優點：MBP不含有半胱氨酸殘基，不會干擾目標蛋白形成正確的二硫鍵；使用的介質價格低廉；可在溫和條件下洗脫融合蛋白；加上其分泌信號，可以進行分泌表達在細胞周質；這一系統最顯著的特點是與MBP進行融合表達可以改善目標蛋白的溶解性，促進正確折疊，提高活性蛋白的回收率麥芽糖結合蛋白（MBP）此系統使用交聯直鏈淀粉的親和介質純化MBP標簽親合純化MBP標簽親合純化重組蛋白制備SDS－PAGE圖譜重組蛋白制備SDS－PAGE圖譜與抗生物素蛋白特異結合的親和標簽生物素-抗生物素蛋白（Avidin-Biotin）是目前最強的親和作用之一。StrepTag系統是通過篩選噬菌體隨機肽庫得到的短肽（含9個氨基酸殘基），將其進行目標蛋白的C端融合可模擬生物素和鏈霉抗生物素蛋白特異性相互作用，使用亞胺生物素洗脫。這一系統不能進行N端融合，而且變性劑會影響親和相互作用。后發展的8氨基酸StreptagⅡ標簽，本身并不能生物素化，卻可模擬生物素的功能和鏈霉抗生物素蛋白變體Strep-Tactin特異性的相互作用，可加在蛋白的N端和C端，使用便宜的脫硫生物素進行洗脫，且StreptagⅡ和Strep-Tactin相互作用不受變性劑的影響，可在變性條件下純化。與抗生物素蛋白特異結合的親和標簽生物素-抗生物素蛋白（Avi基于親合素與生物素的親合純化基于親合素與生物素的親合純化FLAG標簽，T7標簽和S標簽FLAG肽序列（DYKDDDDK）親水性很強，片段小，且具有腸激酶的酶切位點，一般不會影響目標蛋白活性。昂貴。T7標簽：T7基因10蛋白的最前面11個氨基酸，通過免疫親和層析進行純化。S標簽：15個氨基酸的多肽標簽，可以特異性的和S-蛋白介質結合。由于S標簽和S-蛋白結合形成有活性的核糖核酸酶，可靈敏的定量檢測融合蛋白。FLAG標簽，T7標簽和S標簽FLAG肽序列（DYKDDDD親和標簽分子大小結合配體融合部位洗脫條件注釋谷胱甘肽巰基轉移酶(GST)220aa谷胱甘肽N端還原型谷胱甘肽pGEX,pET41,pET42,可進行表達蛋白檢測融合蛋白形成二聚體幾丁質結合結構域(CBD)56aa幾丁質N端或C端誘導剪切pTYB,pTWIN麥芽糖結合蛋白(MBP)396aa直鏈淀粉N端或C端麥芽糖pMAL可分泌表達,可改善溶解性PinPoint(可生物素化蛋白)13kDaavidinN端生物素PinPoint可進行表達蛋白檢測StreptagⅡ(非生物素化親和)8aaStreptavdinN端或C端脫硫生物素pPR-IBA,pASK-IBA可進行分泌表達可進行表達蛋白檢測,可進行目標蛋白固定化,可在變性條件下純化組氨酸標簽(PolyHis)6,8,10,18aa螯和Ni2+N端或C端咪唑/低pHpET,pHAT,pQE可在變性條件下純化FLAG標簽8aa單抗M1/M2M1:N端M2:N端/C端M1:EDTAM2:低pH或合成的FLAG肽p-FLAG,p3×FLAG已具有腸激酶酶切位點S標簽15aaRNaseA的S片段N端或C端低pHpET可進行表達水平的監測T7標簽11aa單抗N端低pHpET可增強表達水平可在弱變性條件下純化親和標簽分子大小結合配體融合部位洗脫條件注釋谷胱甘肽巰基轉移親和標簽的去除三種情況不必去除標簽：目標蛋白作為免疫原用來產生和純化抗體；目標蛋白的生物活性不受融合標簽的影響；目標蛋白用來直接固定化在介質上。去除法：化學法（廉價，缺乏選擇，反應劇烈）

酶法（溫和，特異性強，成本較高）親和標簽的去除三種情況不必去除標簽：剪切方法剪切位點序列注釋

化學法溴化氰Met^需70%甲酸，室溫羥胺Asn^GlypH＝9，需加熱，甲酸Asp^Pro70%甲酸，需加熱酶法腸激酶Asp-Asp-Asp-Asp-Lys^內切酶賴氨酸后為脯氨酸不能剪切其它堿性氨基酸殘基后有非特異性剪切具有活性的pH范圍為4.5到9.5，溫度范圍4℃到45℃凝血因子Ⅹa蛋白酶Ile-Glu/Asp-Gly-Arg^內切酶精氨酸后為脯氨酸和精氨酸不能剪切在Gly-Arg后為非特異性剪切凝血酶Leu-Val-Pro-Arg^Gly-Ser牛來源內切酶存在非特異性剪切生物素化后可用鏈霉抗生物素蛋白親和層析清除PreScission蛋白酶Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln^Gly-ProGST