第二節(jié)基因突變和誘變育種第二節(jié)基因突變和誘變育種1基因突變誘變育種基因突變2一、基因突變（genemutation）一個(gè)基因內(nèi)部遺傳結(jié)構(gòu)或DNA序列的任何改變簡稱突變，是變異的一種，泛指細(xì)胞內(nèi)（或病毒粒內(nèi)）遺傳物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)或數(shù)量突然發(fā)生的可遺傳的變化，可自發(fā)或誘導(dǎo)產(chǎn)生。突變幾率一般很低（10-6～10-9）一、基因突變（genemutation）一個(gè)基因內(nèi)部遺傳結(jié)構(gòu)3從自然界分離到的菌株，簡稱野生型。

野生型經(jīng)突變后形成的帶有新性狀的菌株，又稱突變體或突變型。突變株（mutant）野生型菌株（wildtypestrain）從自然界分離到的菌株，簡稱野生型。野生型經(jīng)突變后形成的帶有4（一）突變類型凡能用選擇性培養(yǎng)基（或其他選擇性培養(yǎng)條件）快速選擇出來的突變株。選擇性突變株（selectivemutant）非選擇性突變株（non-selectivemutant）反之。（一）突變類型凡能用選擇性培養(yǎng)基（或其他選擇性培養(yǎng)條5表型基因型這里主要介紹幾種常用的由于基因突變而造成微生物表型變化的突變型及其分離表型基因型這里主要介紹幾種常用的由于基因突變而造成微生物表型6link1突變株的表型非選擇性突變株選擇性突變株抗性突變型（株）營養(yǎng)缺陷型（株）條件致死突變型（株）形態(tài)突變型（株）抗原突變型（株）產(chǎn)量突變型（株）link1突變株的表型非選擇性突變株選擇性突變株抗性突變型（7突變率每一細(xì)胞在每一世代中發(fā)生某一性狀突變的幾率例如，突變率為10-8的，指該細(xì)胞在1億次細(xì)胞分裂中，會(huì)發(fā)生1次突變。某一單位群體在每一世代（即分裂1次）中產(chǎn)生突變株（mutant，即突變型）的數(shù)目來表示例如，一個(gè)含108個(gè)細(xì)胞的群體，當(dāng)其分裂為2×108個(gè)細(xì)胞時(shí)，即可平均發(fā)生一次突變的突變率也是10-8。（二）突變率（mutationrate）突變率每一細(xì)胞在每一世代中發(fā)生某一性狀突變的幾率例如，突變率8第八章微生物的遺傳變異和育種2課件9突變一般是獨(dú)立發(fā)生的。某一基因發(fā)生突變不會(huì)影響其他基因的突變率。同一細(xì)胞中同時(shí)發(fā)生兩個(gè)基因突變的幾率是極低的。突變一般是獨(dú)立發(fā)生的。某一基因發(fā)生突變不會(huì)影響其他基因的突變10（三）基因突變的特點(diǎn)基因突變的7個(gè)共同點(diǎn)（1）自發(fā)性各種性狀的突變，可在無人為的誘變因素處理下自發(fā)地產(chǎn)生。（三）基因突變的特點(diǎn)基因突變的7個(gè)共同點(diǎn)（1）自發(fā)性各種性狀11（2）非對(duì)應(yīng)性突變的性狀與引起突變的原因間無直接的對(duì)應(yīng)關(guān)系。這是突變的一個(gè)重要特點(diǎn)，也是容易引起爭論的問題（3）稀有性自發(fā)突變雖可隨時(shí)發(fā)生，但其突變率卻是極低和穩(wěn)定的，一般在10-6～10-9間。（2）非對(duì)應(yīng)性突變的性狀與引起突變的原因間這是突變的一個(gè)重要12某基因的突變率不受它種基因突變率的影響。（5）可誘變性自發(fā)突變的頻率可因誘變劑（mutagen）的影響而大為提高（10～105倍）。（4）獨(dú)立性某基因的突變率不受它種基因突變率的影響。（5）可誘變性自發(fā)突13基因突變后的新遺傳性狀是穩(wěn)定的、可遺傳的。野生型菌株某一性狀可發(fā)生正向突變（forwardmutation），也可發(fā)生相反的回復(fù)突變（reversemutation或backmutation

，也稱回變）。（7）可逆性（6）穩(wěn)定性基因突變后的新遺傳性狀是穩(wěn)定的、可遺傳的。野生型菌株某一性狀14（四）基因突變自發(fā)性和不對(duì)應(yīng)性

的實(shí)驗(yàn)證明如何證明基因突變的非對(duì)應(yīng)性？（四）基因突變自發(fā)性和不對(duì)應(yīng)性

的實(shí)驗(yàn)證明如何證明基因突變的15證明突變的性狀與引起突變的原因間無直接對(duì)應(yīng)關(guān)系！三個(gè)經(jīng)典實(shí)驗(yàn)變量實(shí)驗(yàn)、涂布實(shí)驗(yàn)、影印實(shí)驗(yàn)證明突變的性狀與引起突變的原因間無直接對(duì)應(yīng)關(guān)系！三個(gè)經(jīng)典實(shí)驗(yàn)161.變量試驗(yàn)（fluctuationtest）又稱波動(dòng)試驗(yàn)或彷徨試驗(yàn)。1943年，S.E.Luria和M.Delbrück根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)的原理，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。SalvadorLuriaMaxDelbruckTheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1969甲管乙管1.變量試驗(yàn)（fluctuationtest）又稱波動(dòng)172.涂布試驗(yàn)（Newcombeexperiment）1949年，H.B.Newcombe在《NATURE》上發(fā)表了一篇與變量試驗(yàn)屬同一觀點(diǎn)的但實(shí)驗(yàn)方法更為簡單的涂布試驗(yàn)結(jié)果。2.涂布試驗(yàn)（Newcombeexperiment）1183.平板影印培養(yǎng)試驗(yàn)（replicaplating）1952年，J.Lederberg夫婦發(fā)表了一篇著名的《平板影印培養(yǎng)法和細(xì)菌突變株的間接選擇》論文，它更好地證明了微生物的抗藥性是在未接觸藥物前自發(fā)地產(chǎn)生的，這一突變與相應(yīng)的藥物環(huán)境毫不相干。3.平板影印培養(yǎng)試驗(yàn)（replicaplating）119影印的作用是保證這3個(gè)平板上所長出的菌落的親緣和相對(duì)位置保持嚴(yán)格的對(duì)應(yīng)性。影印的作用是保證這3個(gè)平板上所長出的菌落的親緣和相對(duì)位置保持20JoshuaLederbergJ.LederbergisawardedtheNoblePrizeinMedicineandPhysiologyin1958JoshuaLederbergJ.Lederbergi21（五）基因突變及其機(jī)制僅影響一對(duì)堿基影響一段染色體（五）基因突變及其機(jī)制僅影響一對(duì)堿基影響一段染色體22

誘發(fā)突變簡稱誘變，是指通過人為的方法，利用物理、化學(xué)或生物因素顯著提高基因自發(fā)突變頻率的手段。1.誘發(fā)突變（inducedmutation）凡具有誘變效應(yīng)的任何因素，都稱誘變劑（mutagen）。誘發(fā)突變簡稱誘變，是指通過人為的方法，利用物理、化學(xué)或生23(1)堿基的置換（substitution）堿基的置換只涉及一對(duì)堿基被另一對(duì)堿基所置換，屬于典型的點(diǎn)突變（pointmutation）。染色體的微小損傷（microlesion）(1)堿基的置換（substitution）堿基的置換只24堿基的置換轉(zhuǎn)換（transition）顛換（transversion）一個(gè)嘌呤另一個(gè)嘌呤一個(gè)嘧啶另一個(gè)嘧啶一個(gè)嘌呤另一個(gè)嘌呤一個(gè)嘧啶另一個(gè)嘧啶堿基的置換轉(zhuǎn)換（transition）顛換（transver25第八章微生物的遺傳變異和育種2課件26置換的機(jī)制①直接引起置換的誘變劑一類可直接與核酸的堿基發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的化學(xué)誘變劑，在體內(nèi)（invivo）或離體（invitro）條件下均有作用。置換的機(jī)制①直接引起置換的誘變劑一類可直接與核酸的堿基27各種烷化劑（alkylatingagent）等硫酸二乙酯（DES），甲基磺酸乙酯（EMS），N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍，N-甲基-N-亞硝基脲，乙烯亞胺，環(huán)氧乙酸，氮芥等。亞硝酸羥胺各種烷化劑（alkylatingagent）等硫酸二乙酯（28第八章微生物的遺傳變異和育種2課件29它們可與一個(gè)或幾個(gè)堿基發(fā)生生化反應(yīng)，引起DNA復(fù)制時(shí)發(fā)生轉(zhuǎn)換，能引起顛換的誘變劑很少。它們可與一個(gè)或幾個(gè)堿基發(fā)生生化反應(yīng)，30②間接引起置換的誘變劑引起這類變異的誘變劑都是一些堿基類似物（baseanalog）。5-溴尿嘧啶（5-BU）、5-氨基尿嘧啶（5-AU）、8-氮鳥嘌呤（8-NG）、2-氨基嘌呤（2-AP）6-氯嘌呤（6-CP）等。②間接引起置換的誘變劑引起這類變異的誘變劑都是一些堿基31它們的作用是通過活細(xì)胞的代謝活動(dòng)摻入到DNA分子中后而引起的，故是間接的。它們的作用是通過活細(xì)胞的代謝活動(dòng)摻入到DNA分子中32(2)移碼突變（frame-shiftmutation，phase-shiftmutation）指誘變劑使DNA序列中的一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)核苷酸發(fā)生增添（插入）或缺失，從而使其后面的全部遺傳密碼發(fā)生閱讀框發(fā)生改變，并進(jìn)一步引起轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯錯(cuò)誤的一類突變。(2)移碼突變（frame-shiftmutation，p33由移碼突變所產(chǎn)生的突變株，稱為移碼突變株（frame-shiftmutant）。DNA分子的微小損傷點(diǎn)突變由移碼突變所產(chǎn)生的突變株，稱為移碼突變株（fram34能引起移碼突變的有效誘變劑——吖啶類染料原黃素吖啶黃吖啶橙α-氨基吖啶ICR類的化合物能引起移碼突變的有效誘變劑——吖啶類染料原黃素吖啶黃吖啶橙α35由吖啶類化合物誘發(fā)的移碼突變及其回復(fù)突變圖示：（雙線部分代表正常密碼子，單線部分表示不正常）①正常DNA鏈上的三聯(lián)密碼子：②第三個(gè)密碼子中增添一個(gè)堿基后的三聯(lián)密碼子：由吖啶類化合物誘發(fā)的移碼突變及其回復(fù)突變圖示：①正常DNA36③在第二個(gè)密碼子上缺失一個(gè)堿基A后引起的變化：④增添一個(gè)堿基和缺失一個(gè)堿基后，其后的密碼子又恢復(fù)正常：③在第二個(gè)密碼子上缺失一個(gè)堿基A后引起的變化：④增添一個(gè)37⑥如缺失三個(gè)堿基，也只引起一段密碼子不正常：⑤增添三個(gè)堿基后，只引起一段密碼子不正常：⑥如缺失三個(gè)堿基，也只引起一段密碼子不正常：⑤增添三個(gè)堿38吖啶類化合物引起移碼突變的機(jī)制：在DNA復(fù)制過程中使鏈上增添或缺失一個(gè)堿基，引起移碼突變。吖啶類化合物嘌呤－嘧啶對(duì)平面型三環(huán)分子結(jié)構(gòu)相似嵌入兩個(gè)相鄰的DNA堿基對(duì)之間造成雙螺旋的部分解開吖啶類化合物引起移碼突變的機(jī)制：在DNA復(fù)制過程中使鏈上增添39(3)染色體畸變（chromosomalaberration）電離輻射（X射線等）烷化劑亞硝酸等某些強(qiáng)烈理化因子引起點(diǎn)突變DNA的大損傷（macrolesion）(3)染色體畸變（chromosomalaberratio40DNA的大損傷（macrolesion）染色體畸變?nèi)笔В╠eletion）重復(fù)（duplication）插入（insertion）易位（translocation）倒位（inversion）染色體結(jié)構(gòu)上染色體數(shù)目的變化DNA的大損傷（macrolesion）染色體畸變?nèi)笔В╠e41DNA序列通過非同源重組的方式，從染色體某一部位轉(zhuǎn)移到同一染色體上另一部位或其他染色體上某一部位的現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)座（transposition）。DNA序列通過非同源重組的方式，42凡具有轉(zhuǎn)座作用的一段DNA序列，稱轉(zhuǎn)座因子（transposibleelement，TE），又稱跳躍基因（jumpinggene）、可移動(dòng)基因（moveablegene）、可移動(dòng)遺傳因子（mobilegeneticelement）。凡具有轉(zhuǎn)座作用的一段DNA序列，稱轉(zhuǎn)座因子43轉(zhuǎn)座因子插入序列（insertionsequence，IS）轉(zhuǎn)座子（transposon，Tn）Mu噬菌體（mutatorphage）轉(zhuǎn)座噬菌體（transposablephage）原核生物E.coli轉(zhuǎn)座因子插入序列（insertionsequence，IS44進(jìn)化研究抗藥性產(chǎn)生機(jī)制各種研究用的突變株的獲得轉(zhuǎn)座作用的頻率為10-5～10-7“自發(fā)基因工程”、“內(nèi)源性基因工程”進(jìn)化研究轉(zhuǎn)座作用的頻率為10-5～10-7“自發(fā)基因工程”、45轉(zhuǎn)座因子的特點(diǎn)①在轉(zhuǎn)座時(shí)，通過轉(zhuǎn)座因子的復(fù)制，可將新形成的拷貝以非同源重組的方式轉(zhuǎn)移到染色體的新部位上；②在轉(zhuǎn)座因子兩端各有一段一定長度的末端重復(fù)序列，包括正向重復(fù)（directrepeat）和反向重復(fù)（invertedrepeat，或顛倒重復(fù)）；③每個(gè)轉(zhuǎn)座因子還帶有一個(gè)對(duì)轉(zhuǎn)座有特異功能的轉(zhuǎn)座酶基因（transposasegene）。轉(zhuǎn)座因子的特點(diǎn)①在轉(zhuǎn)座時(shí)，通過轉(zhuǎn)座因子的復(fù)制，可將新形成的462.自發(fā)突變（spontaneousmutation）

自發(fā)突變（spontaneousmutation）是指生物體在無人工干預(yù)下自然發(fā)生的低頻率突變。2.自發(fā)突變（spontaneousmutation）47自發(fā)突變的原因（1）背景輻射和環(huán)境因素（3）DNA復(fù)制過程中堿基配對(duì)錯(cuò)誤（2）微生物自身有害代謝產(chǎn)物一個(gè)1000bp的基因自發(fā)突變頻率約為10-6例如，過氧化氫等例如，天然的宇宙射線等自發(fā)突變的原因（1）背景輻射和環(huán)境因素（3）DNA復(fù)制過程中48（六）紫外線對(duì)DNA的損傷及其修復(fù)嘧啶（敏感性）＞嘌呤紫外線（ultravioletray，U.V.）嘧啶二聚體（TT，TC，CC）和水合物（六）紫外線對(duì)DNA的損傷及其修復(fù)嘧啶（敏感性）＞嘌呤紫外線49第八章微生物的遺傳變異和育種2課件50把經(jīng)UV照射后的微生物立即暴露于可見光下時(shí)，可明顯降低其死亡率的現(xiàn)象，稱為光復(fù)活作用。1.光復(fù)活作用（photoreactivation，photorestoration）最早是A.Kelner（1949）在Streptomycesgriseus（灰色鏈霉菌）中發(fā)現(xiàn)的。后來，在許多微生物中都得到了證實(shí)。把經(jīng)UV照射后的微生物立即暴露于可見光下時(shí)，可明顯降51最明顯的是在E.coli的實(shí)驗(yàn)①對(duì)照：8×106個(gè)／mLE.coli→100個(gè)／mLE.coli②試驗(yàn)：8×106個(gè)／mLE.coli→－－－－→2×106個(gè)／mLE.coliUVUV360～490nm可見光，30min最明顯的是在E.coli的實(shí)驗(yàn)UVUV360～490nm可見52使二聚體（dimer）重新分解成單體（monomer）帶有嘧啶二聚體的DNA分子DNA分子UV照射黑暗下結(jié)合光激活酶——光解酶（光裂合酶，photolyase）復(fù)合物300～500nm可見光獲得光能而激活釋放光解酶使二聚體（dimer）重新分解成單體（monomer）帶有嘧53在一般的微生物中都存在光復(fù)活作用，在利用UV進(jìn)行誘變育種等工作時(shí)，應(yīng)在紅光下進(jìn)行照射和后續(xù)操作，并放置在黑暗條件下培養(yǎng)。注意在一般的微生物中都存在光復(fù)活作用，在利用UV進(jìn)行誘變542.切除作用（excisionrepair）是活細(xì)胞內(nèi)一種用于修復(fù)被UV等誘變劑（包括烷化劑、X射線和γ射線等）損傷后DNA的修復(fù)方式之一，又稱暗修復(fù)（darkrepair），通過酶切作用去除嘧啶二聚體，隨后重新合成一段正常DNA鏈的核酸修復(fù)方式。2.切除作用（excisionrepair）是活細(xì)55酶切合成切開切除聚合連接酶切合成切開切除聚合連接56二、突變與育種

（一）自發(fā)突變與育種

（breedingbyspontaneousmutation）

1.從生產(chǎn)中育種在生產(chǎn)第一線易獲得較優(yōu)良的生產(chǎn)菌株。二、突變與育種

（一）自發(fā)突變與育種

572.定向培育優(yōu)良菌株定向培育是一種利用微生物自發(fā)突變，并采用特定的選擇條件，通過對(duì)微生物群體不斷移植以選育出較優(yōu)良菌株的古老方法。2.定向培育優(yōu)良菌株定向培育是一種利用微生物58（二）誘變育種（breedingbyinducedmutation）

誘變育種是指利用物理、化學(xué)等誘變劑處理均勻而分散的微生物細(xì)胞群，在促進(jìn)其突變率顯著提高的基礎(chǔ)上，采用簡便、快速和高效的篩選方法，從中挑選出少數(shù)符合育種目的的突變株，以供科學(xué)實(shí)驗(yàn)或生產(chǎn)實(shí)踐使用。（二）誘變育種（breedingbyinducedmu59篩選誘變誘變育種定向的——更重要隨機(jī)的篩選誘變誘變育種定向的——更重要隨機(jī)的60可獲得供工業(yè)和實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用的各種菌株；提高有用代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量；減少雜質(zhì)、提高產(chǎn)品質(zhì)量、擴(kuò)大品種和簡化工藝等。誘變育種具有重大的實(shí)踐意義可獲得供工業(yè)和實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用的各種菌株；誘變育種具有重大的實(shí)踐意61誘變育種的特點(diǎn)（1）提高突變率，擴(kuò)大突變譜（2）有效地改良個(gè)別、單一性狀（3）縮短育種年限（4）定向變異和有益突變的頻率低誘變育種的特點(diǎn)（1）提高突變率，擴(kuò)大突變譜621.誘變育種的基本環(huán)節(jié)1.誘變育種的基本環(huán)節(jié)63出發(fā)菌株純化、同步培養(yǎng)培養(yǎng)液離心收集細(xì)胞，洗滌，制菌懸液玻璃珠打散，過濾細(xì)胞或孢子懸液誘變處理平板分離初篩復(fù)篩保藏及擴(kuò)大試驗(yàn)活菌計(jì)數(shù)，誘變預(yù)備試驗(yàn)存活細(xì)胞計(jì)數(shù)，致死率計(jì)算變異率計(jì)算出發(fā)菌株純化、同步培養(yǎng)培養(yǎng)液離心收集細(xì)胞，洗滌，制菌懸液玻璃642.誘變育種中的原則

（1）選擇簡便有效的誘變劑誘變劑（mutagen）物理因素化學(xué)誘變劑非電離輻射類的紫外線、激光和離子束（ionbeam，有小型加速器提供）等引起電離輻射的X射線、γ射線和快中子等主要有烷化劑、堿基類似物和吖啶類化合物2.誘變育種中的原則

（1）選擇簡便有效的誘變劑誘65

烷化劑可與巰基、氨基和羧基等直接發(fā)生反應(yīng)，更易引起基因突變。最常用的烷化劑N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍（NTG）、甲基磺酸乙酯（EMS）、甲基亞硝基脲（NMU）、硫酸二乙酯（DES）、氮芥、乙烯亞胺和環(huán)氧乙烷等。烷化劑可與巰基、氨基和羧基等直接發(fā)生反應(yīng)，更易66擬輻射物質(zhì)氮芥、硫芥和環(huán)氧乙烷等各種點(diǎn)突變一般只有輻射才能誘發(fā)的染色體畸變誘發(fā)擬輻射物質(zhì)氮芥、硫芥和環(huán)氧乙烷等各種點(diǎn)突變一般只有輻射才能誘67

出發(fā)菌株（originalstrain）是指用于育種的原始菌株，選用合適的出發(fā)菌株有利于提高育種的效率。（2）挑選優(yōu)良的出發(fā)菌株出發(fā)菌株（originalstrain）是指用于育種68合適的出發(fā)菌株來源：①由自然界直接分離獲得的野生型菌株；②在生產(chǎn)中經(jīng)歷生產(chǎn)條件考驗(yàn)的菌株；③已經(jīng)過誘變甚至多次改造的菌株；④選用對(duì)誘變劑敏感性較高增變變異株；等等。合適的出發(fā)菌株來源：69在誘變育種中，所處理的細(xì)胞必須是單細(xì)胞、均勻的懸液狀態(tài)。（3）處理單細(xì)胞或單孢子懸液菌懸液制備目的在于提高誘變處理的效果因?yàn)?一方面，分散狀態(tài)的細(xì)胞可以均勻地接觸誘變劑，另一方面，又可避免長出不純菌落。在誘變育種中，所處理的細(xì)胞必須是單細(xì)胞、均勻的懸液狀70誘變劑一般只作用于DNA雙鏈中的某一條單鏈，故某一突變還是無法反映在當(dāng)代的表型上。只有當(dāng)經(jīng)過DNA的復(fù)制和細(xì)胞分裂后，這一變異才會(huì)在表型上表達(dá)出來，于是出現(xiàn)了不純菌落，這就叫表型延遲（phenotypiclag）。誘變劑一般只作用于DNA雙鏈中的某一條單鏈，故某一突71表型延遲（phenotypiclag）表型延遲（phenotypiclag）72用于誘變育種的細(xì)胞應(yīng)盡量選用單核細(xì)胞，例如，細(xì)菌的芽孢；霉菌或放線菌的分生孢子。用于誘變育種的細(xì)胞應(yīng)盡量選用單核細(xì)胞，73誘變劑的作用有三條：一是提高誘變的頻率二是擴(kuò)大變異的幅度三是使變異向正變的方向移動(dòng)（產(chǎn)量提高）（4）選用最適的誘變劑量誘變劑的作用有三條：（4）選用最適的誘變劑量74凡在提高誘變率的基礎(chǔ)上，既能擴(kuò)大變異幅度，又能促使變異移向正變范圍的劑量，就是合適的劑量。凡在提高誘變率的基礎(chǔ)上，既能擴(kuò)大變異幅度，又能促使變75兩條重要的實(shí)驗(yàn)曲線橫坐標(biāo)縱坐標(biāo)①劑量存活率曲線誘變劑的劑量細(xì)胞存活數(shù)的對(duì)數(shù)值②劑量－誘變率曲線誘變劑的劑量誘變后獲得的突變細(xì)胞數(shù)兩條重要的實(shí)驗(yàn)曲線橫坐標(biāo)縱坐標(biāo)①劑量存活率曲線誘變劑的劑量76通過比較上述兩曲線，可找到某誘變劑的劑量－存活率－誘變率三者的最佳結(jié)合點(diǎn)。通常采用低劑量、長時(shí)間處理。通過比較上述兩曲線，可找到通常采用低劑量、長時(shí)間處理。77誘變劑的復(fù)合處理常常表現(xiàn)出明顯的協(xié)同效應(yīng)，這對(duì)育種工作是有利的。（5）充分利用復(fù)合處理的協(xié)同效應(yīng)（synergism）誘變劑的復(fù)合處理常常表現(xiàn)出明顯的協(xié)同效應(yīng)，這對(duì)育種工78第八章微生物的遺傳變異和育種2課件79復(fù)合處理有幾類：①兩種或多種誘變劑的先后使用；②同一種誘變劑的重復(fù)使用；③兩種或多種誘變劑的同時(shí)使用。復(fù)合處理有幾類：80為了大大提高育種時(shí)初篩的效率，必須進(jìn)行大量的分析測定和統(tǒng)計(jì)工作，并找到形態(tài)變異與產(chǎn)量變異兩者間的相關(guān)性。（6）利用和創(chuàng)造形態(tài)、生理與產(chǎn)量間的相關(guān)指標(biāo)為了大大提高育種時(shí)初篩的效率，必須進(jìn)行大量的分析測定81利用鑒別性培養(yǎng)基的原理或其他途徑，就可有效地把原先肉眼無法觀察的生理性狀或產(chǎn)量性狀轉(zhuǎn)化為可見的“形態(tài)”性狀?？焖倨桨鍣z出法利用鑒別性培養(yǎng)基的原理或其他途徑，就可有效地把原先肉82在瓊脂平板上，通過觀察測定某突變菌落周圍蛋白酶水解圈的大小、淀粉酶變色圈（用碘液使淀粉顯色）的大小，氨基酸顯色圈（將菌落用打孔機(jī)取下，轉(zhuǎn)移到濾紙上，再用茚三酮試劑顯色）的大小，檸檬酸變色圈（可在厚濾紙上培養(yǎng)，用溴甲酚綠作指示劑）的大小，抗生素抑制圈的大小，指示菌生長圈的大小（測定生長因子產(chǎn)生），纖維素酶對(duì)纖維素水解圈（用剛果紅染色）的大小，外毒素的沉淀反應(yīng)圈的大小等，均可為初篩工作中估計(jì)某突變株代謝產(chǎn)物量的“形態(tài)”指標(biāo)。在瓊脂平板上，通過觀察測定某突變菌落周圍83（7）設(shè)計(jì)高效篩選方案設(shè)計(jì)簡便、高效的科學(xué)篩選方案。初篩篩選工作復(fù)篩以量為主（選留較多有生產(chǎn)潛力的菌株）以質(zhì)為主（對(duì)少量潛力大的菌株的代謝產(chǎn)物量作精確測定）（7）設(shè)計(jì)高效篩選方案設(shè)計(jì)簡便、高效的科學(xué)篩選方案。初篩篩選84常用的篩選方案第一輪：第二輪：第三輪： 同第二輪第四輪： 同上

... 直至獲得較滿意的結(jié)果為止常用的篩選方案第一輪：第二輪：第三輪： 同第二輪直至獲得較85初篩復(fù)篩對(duì)產(chǎn)量突變株生產(chǎn)性能的測定方法粗測為主在培養(yǎng)皿平板上在搖瓶中（8）創(chuàng)造新型篩選方法較精確的測定搖瓶培養(yǎng)or臺(tái)式自控發(fā)酵罐培養(yǎng)初篩復(fù)篩對(duì)產(chǎn)量突變株生產(chǎn)性能的測定方法粗測為主在培養(yǎng)皿平863.3類突變株的篩選方法

（1）產(chǎn)量突變株的篩選1971年，國外有人報(bào)道了篩選春日霉素（kasugamycin，即“春雷霉素”）生產(chǎn)菌時(shí)所采用的一種瓊脂塊培養(yǎng)法，一年內(nèi)曾使該抗生素產(chǎn)量提高10倍。3.3類突變株的篩選方法

（1）產(chǎn)量突變株的篩選87此法的關(guān)鍵是用打孔器取出含有一個(gè)小菌落的瓊脂塊作分別培養(yǎng)。這樣，各瓊脂塊所含養(yǎng)料和接觸空氣面積基本相同，且產(chǎn)生的抗生素等代謝產(chǎn)物不致擴(kuò)散出瓊脂塊外。數(shù)據(jù)精確，效率高此法的關(guān)鍵是用打孔器取出含有一個(gè)小菌落的瓊脂塊作分別88（2）抗藥性突變株的篩選基因突變使菌株對(duì)某種或某幾種藥物，特別是抗生素，產(chǎn)生抗性。特點(diǎn)：正選擇標(biāo)記（突變株可直接從抗性平板上獲得-----在加有相應(yīng)抗生素的平板上，只有抗性突變能生長。所以很容易分離得到。）（2）抗藥性突變株的篩選基因突變使菌株對(duì)某種89梯度平板法（gradientplate）是定向篩選抗藥性突變株的一種有效方法，通過制備瓊脂表面存在藥物濃度梯度的平板、在其上涂布誘變處理后的細(xì)胞懸液、經(jīng)培養(yǎng)后再從其上選取抗藥性菌落等步驟，就可定向篩選到相應(yīng)抗藥性突變株。梯度平板法（gradientplate）是定90梯度平板法（gradientplate）是定向篩選抗藥性突變株的一種有效方法。梯度平板法（gradientplate）91表示方法：所抗藥物的前三個(gè)小寫斜體英文字母加上“r”。strrstrs對(duì)鏈霉素的抗性敏感性表示方法：所抗藥物的前三個(gè)小寫斜體英文字母加上“r”。str92（3）營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選營養(yǎng)缺陷型突變株（auxotrophicmutant）在生物學(xué)基礎(chǔ)理論和應(yīng)用研究以及生產(chǎn)實(shí)踐上都有極其重要的意義。（3）營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選營養(yǎng)缺陷型突變株（93營養(yǎng)缺陷型的表示方法：基因型：所需營養(yǎng)物的前三個(gè)英文小寫斜體字母表示：hisC（組氨酸缺陷型，其中的大寫字母C同一表型中不同基因的突變）表型：同上，但第一個(gè)字母大寫，且不用斜體：HisC在具體使用時(shí)多用hisC-和hisC+，分別表示缺陷型和野生型。營養(yǎng)缺陷型的表示方法：基因型：所需營養(yǎng)物的前三個(gè)英文小寫斜體94a.基本培養(yǎng)基（MM，符號(hào)為［－］）①

與篩選營養(yǎng)缺陷型突變株有關(guān)的3類培養(yǎng)基僅能滿足某微生物的野生型菌株生長所需的最低成分的組合培養(yǎng)基，稱MM。a.基本培養(yǎng)基（MM，符號(hào)為［－］）①與篩選營養(yǎng)缺陷型突95b.完全培養(yǎng)基（completemedium，CM，符號(hào)為［＋］）凡可滿足一切營養(yǎng)缺陷型菌株?duì)I養(yǎng)需要的天然或半組合培養(yǎng)基，稱為CM。一般可在基本培養(yǎng)基中加入一些富含氨基酸、維生素、核苷酸和堿基之類的天然物質(zhì)，如蛋白胨或酵母膏等配制而成。b.完全培養(yǎng)基（completemedium，CM，符號(hào)96c.補(bǔ)充培養(yǎng)基（supplementalmedium，SM，符號(hào)為［A］或［B］等）凡只能滿足相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型突變株生長需要的組合或半組合培養(yǎng)基，稱為SM。在基本培養(yǎng)基上再添加對(duì)某一營養(yǎng)缺陷型突變株所不能合成的某相應(yīng)代謝產(chǎn)物所組成，可專門選擇相應(yīng)的突變株。c.補(bǔ)充培養(yǎng)基（supplementalmedium，S97原養(yǎng)型（prototroph）②

與營養(yǎng)缺陷型突變有關(guān)的3類遺傳型個(gè)體野生型（wildtype，wildstrain）營養(yǎng)缺陷型（auxotroph）從自然界分離到的原始菌株（A＋B＋）經(jīng)誘變劑處理后的突變株（A—B—）經(jīng)回復(fù)突變或重組后產(chǎn)生的菌株（A＋B＋）原養(yǎng)型（prototroph）②與營養(yǎng)缺陷型突變有關(guān)的3類98③

營養(yǎng)缺陷型的篩選方法第一步，誘變劑處理第二步，淘汰野生型第三步，檢出缺陷型第四步，鑒定缺陷型③營養(yǎng)缺陷型的篩選方法第一步，誘變劑處理99第三步，檢出缺陷型夾層培養(yǎng)法（layerplatingmethod）限量補(bǔ)充培養(yǎng)法逐個(gè)檢出法影印平板法第三步，檢出缺陷型夾層培養(yǎng)法（layerplatingm100第四步，鑒定缺陷型借助生長譜法（auxanography）進(jìn)行。第四步，鑒定缺陷型借助生長譜法（auxanography）進(jìn)101下節(jié)課再見了……第八章微生物的遺傳變異和育種2課件1021.營養(yǎng)缺陷型（auxotroph）

某一野生型菌株因發(fā)生基因突變而喪失合成一種或幾種生長因子、堿基或氨基酸的能力，只有從周圍環(huán)境或培養(yǎng)基中獲得這些營養(yǎng)或其前體物（precursor）才能正常生長繁殖的變異類型，稱為營養(yǎng)缺陷型。1.營養(yǎng)缺陷型（auxotroph）某一野生型菌103營養(yǎng)缺陷型突變株在遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳育種和遺傳工程等研究中——十分重要表型判斷的標(biāo)準(zhǔn)：在基本培養(yǎng)基上能否生長營養(yǎng)缺陷型突變株表型判斷的標(biāo)準(zhǔn)：在基本培養(yǎng)基上能否生長104營養(yǎng)缺陷型的表示方法：基因型：所需營養(yǎng)物的前三個(gè)英文小寫斜體字母表示：hisC（組氨酸缺陷型，其中的大寫字母C同一表型中不同基因的突變）表型：同上，但第一個(gè)字母大寫，且不用斜體：HisC營養(yǎng)缺陷型的表示方法：基因型：所需營養(yǎng)物的前三個(gè)英文小寫斜體105hisC－缺陷型hisC＋野生型hisC－缺陷型hisC＋野生型1062.抗性突變型（resistantmutant）指野生型菌株因發(fā)生基因突變，使菌株對(duì)對(duì)某化學(xué)藥物或致死物理因子，特別是抗生素，產(chǎn)生抗性的抗性變異類型。2.抗性突變型（resistantmutant）107特點(diǎn)：正選擇標(biāo)記（突變株可直接從抗性平板上獲得——在加有相應(yīng)抗生素的平板上，只有抗性突變能生長。所以很容易分離得到。）特點(diǎn)：正選擇標(biāo)記108表示方法：所抗藥物的前三個(gè)小寫斜體英文字母加上“r”表示。strr對(duì)鏈霉素的抗性strs對(duì)鏈霉素的敏感性表示方法：所抗藥物的前三個(gè)小寫斜體英文字母加上“r”表示。s109抗性突變菌株在遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳育種和遺傳工程等研究中——極為重要抗性突變菌株1103.條件致死突變型（conditionallethalmutant）某菌株或病毒經(jīng)基因突變后，在某種條件下可正常地生長、繁殖并呈現(xiàn)其固有的表型，而在另一種條件下卻無法生長、繁殖，這種突變類型稱為條件致死突變型。3.條件致死突變型（conditionallethal111在25℃下可感染其E.coli宿主在37℃卻不能感染Ts突變株即溫度敏感突變株（temperaturesensitivemutant，Tsmutant）是一類典型的條件致死突變株。E.coli的某些菌株在37℃下正常生長不能在42℃下生長某些T4噬菌體突變株在25℃下可感染其E.coli宿主Ts突變株即溫度敏感突變112產(chǎn)生Ts突變的原因在某特定的溫度下具有功能在另一溫度（一般為較高溫度）下則無功能突變使某些重要蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，產(chǎn)生Ts突變的原因在某特定的溫度下具有功能在另一溫度（一般為1134.形態(tài)突變型（morphologicalmutant）指由于突變而引起的個(gè)體或菌落形態(tài)的非選擇性變異。個(gè)體變異孢子有無、孢子顏色、鞭毛有無或莢膜有無等的突變菌落變異菌落表面光滑、粗糙、噬菌斑的大小或清晰度等的突變4.形態(tài)突變型（morphologicalmutant）114特點(diǎn)：非選擇性突變突變株和野生型菌株均可生長，但可從形態(tài)特征上進(jìn)行區(qū)分。特點(diǎn)：非選擇性突變115舉例：菌落顏色變化β半乳糖苷酶基因的插入失活重組子菌落白色非重組子菌落蘭色舉例：菌落顏色變化β半乳糖苷酶基因的插入失活重組子菌落白色非1165.抗原突變型（antigenicmutant）指由于基因突變引起的細(xì)胞抗原結(jié)構(gòu)發(fā)生的變異類型，一般也屬非選擇性突變。例如，細(xì)胞壁缺陷變異（L型細(xì)菌等）、莢膜或鞭毛成分變異等。5.抗原突變型（antigenicmutant）1176.產(chǎn)量突變型（metabolitequantitativemutant）通過基因突變而產(chǎn)生的在代謝產(chǎn)物產(chǎn)量上明顯有別于原始菌株的突變株，稱為產(chǎn)量突變型?！罢冎辍保╬lus-mutant）產(chǎn)量高于原始菌株“負(fù)變株”（minus-mutant）產(chǎn)量低于原始菌株6.產(chǎn)量突變型（metabolitequantitati118篩選高產(chǎn)正變株的工作對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐極其重要在育種實(shí)踐上誘變育種重組育種遺傳工程育種篩選高產(chǎn)正變株的工作對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐極其重要在育種實(shí)踐上誘變育種119平板法的優(yōu)點(diǎn)：快速簡便，工作量小，結(jié)果直觀性強(qiáng)（例如可用上述變色圈、透明圈、抑制圈、生長圈或沉淀圈等方法測定某代謝產(chǎn)物的量）；平板法的缺點(diǎn)：在培養(yǎng)皿平板上固態(tài)培養(yǎng)的結(jié)果不一定能反映搖瓶培養(yǎng)或發(fā)酵罐中液體培養(yǎng)的結(jié)果。back1平板法的優(yōu)點(diǎn)：平板法的缺點(diǎn)：back1120第二節(jié)基因突變和誘變育種第二節(jié)基因突變和誘變育種121基因突變誘變育種基因突變122一、基因突變（genemutation）一個(gè)基因內(nèi)部遺傳結(jié)構(gòu)或DNA序列的任何改變簡稱突變，是變異的一種，泛指細(xì)胞內(nèi)（或病毒粒內(nèi)）遺傳物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)或數(shù)量突然發(fā)生的可遺傳的變化，可自發(fā)或誘導(dǎo)產(chǎn)生。突變幾率一般很低（10-6～10-9）一、基因突變（genemutation）一個(gè)基因內(nèi)部遺傳結(jié)構(gòu)123從自然界分離到的菌株，簡稱野生型。

野生型經(jīng)突變后形成的帶有新性狀的菌株，又稱突變體或突變型。突變株（mutant）野生型菌株（wildtypestrain）從自然界分離到的菌株，簡稱野生型。野生型經(jīng)突變后形成的帶有124（一）突變類型凡能用選擇性培養(yǎng)基（或其他選擇性培養(yǎng)條件）快速選擇出來的突變株。選擇性突變株（selectivemutant）非選擇性突變株（non-selectivemutant）反之。（一）突變類型凡能用選擇性培養(yǎng)基（或其他選擇性培養(yǎng)條125表型基因型這里主要介紹幾種常用的由于基因突變而造成微生物表型變化的突變型及其分離表型基因型這里主要介紹幾種常用的由于基因突變而造成微生物表型126link1突變株的表型非選擇性突變株選擇性突變株抗性突變型（株）營養(yǎng)缺陷型（株）條件致死突變型（株）形態(tài)突變型（株）抗原突變型（株）產(chǎn)量突變型（株）link1突變株的表型非選擇性突變株選擇性突變株抗性突變型（127突變率每一細(xì)胞在每一世代中發(fā)生某一性狀突變的幾率例如，突變率為10-8的，指該細(xì)胞在1億次細(xì)胞分裂中，會(huì)發(fā)生1次突變。某一單位群體在每一世代（即分裂1次）中產(chǎn)生突變株（mutant，即突變型）的數(shù)目來表示例如，一個(gè)含108個(gè)細(xì)胞的群體，當(dāng)其分裂為2×108個(gè)細(xì)胞時(shí)，即可平均發(fā)生一次突變的突變率也是10-8。（二）突變率（mutationrate）突變率每一細(xì)胞在每一世代中發(fā)生某一性狀突變的幾率例如，突變率128第八章微生物的遺傳變異和育種2課件129突變一般是獨(dú)立發(fā)生的。某一基因發(fā)生突變不會(huì)影響其他基因的突變率。同一細(xì)胞中同時(shí)發(fā)生兩個(gè)基因突變的幾率是極低的。突變一般是獨(dú)立發(fā)生的。某一基因發(fā)生突變不會(huì)影響其他基因的突變130（三）基因突變的特點(diǎn)基因突變的7個(gè)共同點(diǎn)（1）自發(fā)性各種性狀的突變，可在無人為的誘變因素處理下自發(fā)地產(chǎn)生。（三）基因突變的特點(diǎn)基因突變的7個(gè)共同點(diǎn)（1）自發(fā)性各種性狀131（2）非對(duì)應(yīng)性突變的性狀與引起突變的原因間無直接的對(duì)應(yīng)關(guān)系。這是突變的一個(gè)重要特點(diǎn)，也是容易引起爭論的問題（3）稀有性自發(fā)突變雖可隨時(shí)發(fā)生，但其突變率卻是極低和穩(wěn)定的，一般在10-6～10-9間。（2）非對(duì)應(yīng)性突變的性狀與引起突變的原因間這是突變的一個(gè)重要132某基因的突變率不受它種基因突變率的影響。（5）可誘變性自發(fā)突變的頻率可因誘變劑（mutagen）的影響而大為提高（10～105倍）。（4）獨(dú)立性某基因的突變率不受它種基因突變率的影響。（5）可誘變性自發(fā)突133基因突變后的新遺傳性狀是穩(wěn)定的、可遺傳的。野生型菌株某一性狀可發(fā)生正向突變（forwardmutation），也可發(fā)生相反的回復(fù)突變（reversemutation或backmutation

，也稱回變）。（7）可逆性（6）穩(wěn)定性基因突變后的新遺傳性狀是穩(wěn)定的、可遺傳的。野生型菌株某一性狀134（四）基因突變自發(fā)性和不對(duì)應(yīng)性

的實(shí)驗(yàn)證明如何證明基因突變的非對(duì)應(yīng)性？（四）基因突變自發(fā)性和不對(duì)應(yīng)性

的實(shí)驗(yàn)證明如何證明基因突變的135證明突變的性狀與引起突變的原因間無直接對(duì)應(yīng)關(guān)系！三個(gè)經(jīng)典實(shí)驗(yàn)變量實(shí)驗(yàn)、涂布實(shí)驗(yàn)、影印實(shí)驗(yàn)證明突變的性狀與引起突變的原因間無直接對(duì)應(yīng)關(guān)系！三個(gè)經(jīng)典實(shí)驗(yàn)1361.變量試驗(yàn)（fluctuationtest）又稱波動(dòng)試驗(yàn)或彷徨試驗(yàn)。1943年，S.E.Luria和M.Delbrück根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)的原理，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。SalvadorLuriaMaxDelbruckTheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1969甲管乙管1.變量試驗(yàn)（fluctuationtest）又稱波動(dòng)1372.涂布試驗(yàn)（Newcombeexperiment）1949年，H.B.Newcombe在《NATURE》上發(fā)表了一篇與變量試驗(yàn)屬同一觀點(diǎn)的但實(shí)驗(yàn)方法更為簡單的涂布試驗(yàn)結(jié)果。2.涂布試驗(yàn)（Newcombeexperiment）11383.平板影印培養(yǎng)試驗(yàn)（replicaplating）1952年，J.Lederberg夫婦發(fā)表了一篇著名的《平板影印培養(yǎng)法和細(xì)菌突變株的間接選擇》論文，它更好地證明了微生物的抗藥性是在未接觸藥物前自發(fā)地產(chǎn)生的，這一突變與相應(yīng)的藥物環(huán)境毫不相干。3.平板影印培養(yǎng)試驗(yàn)（replicaplating）1139影印的作用是保證這3個(gè)平板上所長出的菌落的親緣和相對(duì)位置保持嚴(yán)格的對(duì)應(yīng)性。影印的作用是保證這3個(gè)平板上所長出的菌落的親緣和相對(duì)位置保持140JoshuaLederbergJ.LederbergisawardedtheNoblePrizeinMedicineandPhysiologyin1958JoshuaLederbergJ.Lederbergi141（五）基因突變及其機(jī)制僅影響一對(duì)堿基影響一段染色體（五）基因突變及其機(jī)制僅影響一對(duì)堿基影響一段染色體142

誘發(fā)突變簡稱誘變，是指通過人為的方法，利用物理、化學(xué)或生物因素顯著提高基因自發(fā)突變頻率的手段。1.誘發(fā)突變（inducedmutation）凡具有誘變效應(yīng)的任何因素，都稱誘變劑（mutagen）。誘發(fā)突變簡稱誘變，是指通過人為的方法，利用物理、化學(xué)或生143(1)堿基的置換（substitution）堿基的置換只涉及一對(duì)堿基被另一對(duì)堿基所置換，屬于典型的點(diǎn)突變（pointmutation）。染色體的微小損傷（microlesion）(1)堿基的置換（substitution）堿基的置換只144堿基的置換轉(zhuǎn)換（transition）顛換（transversion）一個(gè)嘌呤另一個(gè)嘌呤一個(gè)嘧啶另一個(gè)嘧啶一個(gè)嘌呤另一個(gè)嘌呤一個(gè)嘧啶另一個(gè)嘧啶堿基的置換轉(zhuǎn)換（transition）顛換（transver145第八章微生物的遺傳變異和育種2課件146置換的機(jī)制①直接引起置換的誘變劑一類可直接與核酸的堿基發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的化學(xué)誘變劑，在體內(nèi)（invivo）或離體（invitro）條件下均有作用。置換的機(jī)制①直接引起置換的誘變劑一類可直接與核酸的堿基147各種烷化劑（alkylatingagent）等硫酸二乙酯（DES），甲基磺酸乙酯（EMS），N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍，N-甲基-N-亞硝基脲，乙烯亞胺，環(huán)氧乙酸，氮芥等。亞硝酸羥胺各種烷化劑（alkylatingagent）等硫酸二乙酯（148第八章微生物的遺傳變異和育種2課件149它們可與一個(gè)或幾個(gè)堿基發(fā)生生化反應(yīng)，引起DNA復(fù)制時(shí)發(fā)生轉(zhuǎn)換，能引起顛換的誘變劑很少。它們可與一個(gè)或幾個(gè)堿基發(fā)生生化反應(yīng)，150②間接引起置換的誘變劑引起這類變異的誘變劑都是一些堿基類似物（baseanalog）。5-溴尿嘧啶（5-BU）、5-氨基尿嘧啶（5-AU）、8-氮鳥嘌呤（8-NG）、2-氨基嘌呤（2-AP）6-氯嘌呤（6-CP）等。②間接引起置換的誘變劑引起這類變異的誘變劑都是一些堿基151它們的作用是通過活細(xì)胞的代謝活動(dòng)摻入到DNA分子中后而引起的，故是間接的。它們的作用是通過活細(xì)胞的代謝活動(dòng)摻入到DNA分子中152(2)移碼突變（frame-shiftmutation，phase-shiftmutation）指誘變劑使DNA序列中的一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)核苷酸發(fā)生增添（插入）或缺失，從而使其后面的全部遺傳密碼發(fā)生閱讀框發(fā)生改變，并進(jìn)一步引起轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯錯(cuò)誤的一類突變。(2)移碼突變（frame-shiftmutation，p153由移碼突變所產(chǎn)生的突變株，稱為移碼突變株（frame-shiftmutant）。DNA分子的微小損傷點(diǎn)突變由移碼突變所產(chǎn)生的突變株，稱為移碼突變株（fram154能引起移碼突變的有效誘變劑——吖啶類染料原黃素吖啶黃吖啶橙α-氨基吖啶ICR類的化合物能引起移碼突變的有效誘變劑——吖啶類染料原黃素吖啶黃吖啶橙α155由吖啶類化合物誘發(fā)的移碼突變及其回復(fù)突變圖示：（雙線部分代表正常密碼子，單線部分表示不正常）①正常DNA鏈上的三聯(lián)密碼子：②第三個(gè)密碼子中增添一個(gè)堿基后的三聯(lián)密碼子：由吖啶類化合物誘發(fā)的移碼突變及其回復(fù)突變圖示：①正常DNA156③在第二個(gè)密碼子上缺失一個(gè)堿基A后引起的變化：④增添一個(gè)堿基和缺失一個(gè)堿基后，其后的密碼子又恢復(fù)正常：③在第二個(gè)密碼子上缺失一個(gè)堿基A后引起的變化：④增添一個(gè)157⑥如缺失三個(gè)堿基，也只引起一段密碼子不正常：⑤增添三個(gè)堿基后，只引起一段密碼子不正常：⑥如缺失三個(gè)堿基，也只引起一段密碼子不正常：⑤增添三個(gè)堿158吖啶類化合物引起移碼突變的機(jī)制：在DNA復(fù)制過程中使鏈上增添或缺失一個(gè)堿基，引起移碼突變。吖啶類化合物嘌呤－嘧啶對(duì)平面型三環(huán)分子結(jié)構(gòu)相似嵌入兩個(gè)相鄰的DNA堿基對(duì)之間造成雙螺旋的部分解開吖啶類化合物引起移碼突變的機(jī)制：在DNA復(fù)制過程中使鏈上增添159(3)染色體畸變（chromosomalaberration）電離輻射（X射線等）烷化劑亞硝酸等某些強(qiáng)烈理化因子引起點(diǎn)突變DNA的大損傷（macrolesion）(3)染色體畸變（chromosomalaberratio160DNA的大損傷（macrolesion）染色體畸變?nèi)笔В╠eletion）重復(fù)（duplication）插入（insertion）易位（translocation）倒位（inversion）染色體結(jié)構(gòu)上染色體數(shù)目的變化DNA的大損傷（macrolesion）染色體畸變?nèi)笔В╠e161DNA序列通過非同源重組的方式，從染色體某一部位轉(zhuǎn)移到同一染色體上另一部位或其他染色體上某一部位的現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)座（transposition）。DNA序列通過非同源重組的方式，162凡具有轉(zhuǎn)座作用的一段DNA序列，稱轉(zhuǎn)座因子（transposibleelement，TE），又稱跳躍基因（jumpinggene）、可移動(dòng)基因（moveablegene）、可移動(dòng)遺傳因子（mobilegeneticelement）。凡具有轉(zhuǎn)座作用的一段DNA序列，稱轉(zhuǎn)座因子163轉(zhuǎn)座因子插入序列（insertionsequence，IS）轉(zhuǎn)座子（transposon，Tn）Mu噬菌體（mutatorphage）轉(zhuǎn)座噬菌體（transposablephage）原核生物E.coli轉(zhuǎn)座因子插入序列（insertionsequence，IS164進(jìn)化研究抗藥性產(chǎn)生機(jī)制各種研究用的突變株的獲得轉(zhuǎn)座作用的頻率為10-5～10-7“自發(fā)基因工程”、“內(nèi)源性基因工程”進(jìn)化研究轉(zhuǎn)座作用的頻率為10-5～10-7“自發(fā)基因工程”、165轉(zhuǎn)座因子的特點(diǎn)①在轉(zhuǎn)座時(shí)，通過轉(zhuǎn)座因子的復(fù)制，可將新形成的拷貝以非同源重組的方式轉(zhuǎn)移到染色體的新部位上；②在轉(zhuǎn)座因子兩端各有一段一定長度的末端重復(fù)序列，包括正向重復(fù)（directrepeat）和反向重復(fù)（invertedrepeat，或顛倒重復(fù)）；③每個(gè)轉(zhuǎn)座因子還帶有一個(gè)對(duì)轉(zhuǎn)座有特異功能的轉(zhuǎn)座酶基因（transposasegene）。轉(zhuǎn)座因子的特點(diǎn)①在轉(zhuǎn)座時(shí)，通過轉(zhuǎn)座因子的復(fù)制，可將新形成的1662.自發(fā)突變（spontaneousmutation）

自發(fā)突變（spontaneousmutation）是指生物體在無人工干預(yù)下自然發(fā)生的低頻率突變。2.自發(fā)突變（spontaneousmutation）167自發(fā)突變的原因（1）背景輻射和環(huán)境因素（3）DNA復(fù)制過程中堿基配對(duì)錯(cuò)誤（2）微生物自身有害代謝產(chǎn)物一個(gè)1000bp的基因自發(fā)突變頻率約為10-6例如，過氧化氫等例如，天然的宇宙射線等自發(fā)突變的原因（1）背景輻射和環(huán)境因素（3）DNA復(fù)制過程中168（六）紫外線對(duì)DNA的損傷及其修復(fù)嘧啶（敏感性）＞嘌呤紫外線（ultravioletray，U.V.）嘧啶二聚體（TT，TC，CC）和水合物（六）紫外線對(duì)DNA的損傷及其修復(fù)嘧啶（敏感性）＞嘌呤紫外線169第八章微生物的遺傳變異和育種2課件170把經(jīng)UV照射后的微生物立即暴露于可見光下時(shí)，可明顯降低其死亡率的現(xiàn)象，稱為光復(fù)活作用。1.光復(fù)活作用（photoreactivation，photorestoration）最早是A.Kelner（1949）在Streptomycesgriseus（灰色鏈霉菌）中發(fā)現(xiàn)的。后來，在許多微生物中都得到了證實(shí)。把經(jīng)UV照射后的微生物立即暴露于可見光下時(shí)，可明顯降171最明顯的是在E.coli的實(shí)驗(yàn)①對(duì)照：8×106個(gè)／mLE.coli→100個(gè)／mLE.coli②試驗(yàn)：8×106個(gè)／mLE.coli→－－－－→2×106個(gè)／mLE.coliUVUV360～490nm可見光，30min最明顯的是在E.coli的實(shí)驗(yàn)UVUV360～490nm可見172使二聚體（dimer）重新分解成單體（monomer）帶有嘧啶二聚體的DNA分子DNA分子UV照射黑暗下結(jié)合光激活酶——光解酶（光裂合酶，photolyase）復(fù)合物300～500nm可見光獲得光能而激活釋放光解酶使二聚體（dimer）重新分解成單體（monomer）帶有嘧173在一般的微生物中都存在光復(fù)活作用，在利用UV進(jìn)行誘變育種等工作時(shí)，應(yīng)在紅光下進(jìn)行照射和后續(xù)操作，并放置在黑暗條件下培養(yǎng)。注意在一般的微生物中都存在光復(fù)活作用，在利用UV進(jìn)行誘變1742.切除作用（excisionrepair）是活細(xì)胞內(nèi)一種用于修復(fù)被UV等誘變劑（包括烷化劑、X射線和γ射線等）損傷后DNA的修復(fù)方式之一，又稱暗修復(fù)（darkrepair），通過酶切作用去除嘧啶二聚體，隨后重新合成一段正常DNA鏈的核酸修復(fù)方式。2.切除作用（excisionrepair）是活細(xì)175酶切合成切開切除聚合連接酶切合成切開切除聚合連接176二、突變與育種

（一）自發(fā)突變與育種

（breedingbyspontaneousmutation）

1.從生產(chǎn)中育種在生產(chǎn)第一線易獲得較優(yōu)良的生產(chǎn)菌株。二、突變與育種

（一）自發(fā)突變與育種

1772.定向培育優(yōu)良菌株定向培育是一種利用微生物自發(fā)突變，并采用特定的選擇條件，通過對(duì)微生物群體不斷移植以選育出較優(yōu)良菌株的古老方法。2.定向培育優(yōu)良菌株定向培育是一種利用微生物178（二）誘變育種（breedingbyinducedmutation）

誘變育種是指利用物理、化學(xué)等誘變劑處理均勻而分散的微生物細(xì)胞群，在促進(jìn)其突變率顯著提高的基礎(chǔ)上，采用簡便、快速和高效的篩選方法，從中挑選出少數(shù)符合育種目的的突變株，以供科學(xué)實(shí)驗(yàn)或生產(chǎn)實(shí)踐使用。（二）誘變育種（breedingbyinducedmu179篩選誘變誘變育種定向的——更重要隨機(jī)的篩選誘變誘變育種定向的——更重要隨機(jī)的180可獲得供工業(yè)和實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用的各種菌株；提高有用代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量；減少雜質(zhì)、提高產(chǎn)品質(zhì)量、擴(kuò)大品種和簡化工藝等。誘變育種具有重大的實(shí)踐意義可獲得供工業(yè)和實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用的各種菌株；誘變育種具有重大的實(shí)踐意181誘變育種的特點(diǎn)（1）提高突變率，擴(kuò)大突變譜（2）有效地改良個(gè)別、單一性狀（3）縮短育種年限（4）定向變異和有益突變的頻率低誘變育種的特點(diǎn)（1）提高突變率，擴(kuò)大突變譜1821.誘變育種的基本環(huán)節(jié)1.誘變育種的基本環(huán)節(jié)183出發(fā)菌株純化、同步培養(yǎng)培養(yǎng)液離心收集細(xì)胞，洗滌，制菌懸液玻璃珠打散，過濾細(xì)胞或孢子懸液誘變處理平板分離初篩復(fù)篩保藏及擴(kuò)大試驗(yàn)活菌計(jì)數(shù)，誘變預(yù)備試驗(yàn)存活細(xì)胞計(jì)數(shù)，致死率計(jì)算變異率計(jì)算出發(fā)菌株純化、同步培養(yǎng)培養(yǎng)液離心收集細(xì)胞，洗滌，制菌懸液玻璃1842.誘變育種中的原則

（1）選擇簡便有效的誘變劑誘變劑（mutagen）物理因素化學(xué)誘變劑非電離輻射類的紫外線、激光和離子束（ionbeam，有小型加速器提供）等引起電離輻射的X射線、γ射線和快中子等主要有烷化劑、堿基類似物和吖啶類化合物2.誘變育種中的原則

（1）選擇簡便有效的誘變劑誘185

烷化劑可與巰基、氨基和羧基等直接發(fā)生反應(yīng)，更易引起基因突變。最常用的烷化劑N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍（NTG）、甲基磺酸乙酯（EMS）、甲基亞硝基脲（NMU）、硫酸二乙酯（DES）、氮芥、乙烯亞胺和環(huán)氧乙烷等。烷化劑可與巰基、氨基和羧基等直接發(fā)生反應(yīng)，更易186擬輻射物質(zhì)氮芥、硫芥和環(huán)氧乙烷等各種點(diǎn)突變一般只有輻射才能誘發(fā)的染色體畸變誘發(fā)擬輻射物質(zhì)氮芥、硫芥和環(huán)氧乙烷等各種點(diǎn)突變一般只有輻射才能誘187

出發(fā)菌株（originalstrain）是指用于育種的原始菌株，選用合適的出發(fā)菌株有利于提高育種的效率。（2）挑選優(yōu)良的出發(fā)菌株出發(fā)菌株（originalstrain）是指用于育種188合適的出發(fā)菌株來源：①由自然界直接分離獲得的野生型菌株；②在生產(chǎn)中經(jīng)歷生產(chǎn)條件考驗(yàn)的菌株；③已經(jīng)過誘變甚至多次改造的菌株；④選用對(duì)誘變劑敏感性較高增變變異株；等等。合適的出發(fā)菌株來源：189在誘變育種中，所處理的細(xì)胞必須是單細(xì)胞、均勻的懸液狀態(tài)。（3）處理單細(xì)胞或單孢子懸液菌懸液制備目的在于提高誘變處理的效果因?yàn)?一方面，分散狀態(tài)的細(xì)胞可以均勻地接觸誘變劑，另一方面，又可避免長出不純菌落。在誘變育種中，所處理的細(xì)胞必須是單細(xì)胞、均勻的懸液狀190誘變劑一般只作用于DNA雙鏈中的某一條單鏈，故某一突變還是無法反映在當(dāng)代的表型上。只有當(dāng)經(jīng)過DNA的復(fù)制和細(xì)胞分裂后，這一變異才會(huì)在表型上表達(dá)出來，于是出現(xiàn)了不純菌落，這就叫表型延遲（phenotypiclag）。誘變劑一般只作用于DNA雙鏈中的某一條單鏈，故某一突191表型延遲（phenotypiclag）表型延遲（phenotypiclag）192用于誘變育種的細(xì)胞應(yīng)盡量選用單核細(xì)胞，例如，細(xì)菌的芽孢；霉菌或放線菌的分生孢子。用于誘變育種的細(xì)胞應(yīng)盡量選用單核細(xì)胞，193誘變劑的作用有三條：一是提高誘變的頻率二是擴(kuò)大變異的幅度三是使變異向正變的方向移動(dòng)（產(chǎn)量提高）（4）選用最適的誘變劑量誘變劑的作用有三條：（4）選用最適的誘變劑量194凡在提高誘變率的基礎(chǔ)上，既能擴(kuò)大變異幅度，又能促使變異移向正變范圍的劑量，就是合適的劑量。凡在提高誘變率的基礎(chǔ)上，既能擴(kuò)大變異幅度，又能促使變195兩條重要的實(shí)驗(yàn)曲線橫坐標(biāo)縱坐標(biāo)①劑量存活率曲線誘變劑的劑量細(xì)胞存活數(shù)的對(duì)數(shù)值②劑量－誘變率曲線誘變劑的劑量誘變后獲得的突變細(xì)胞數(shù)兩條重要的實(shí)驗(yàn)曲線橫坐標(biāo)縱坐標(biāo)①劑量存活率曲線誘變劑的劑量196通過比較上述兩曲線，可找到某誘變劑的劑量－存活率－誘變率三者的最佳結(jié)合點(diǎn)。通常采用低劑量、長時(shí)間處理。通過比較上述兩曲線，可找到通常采用低劑量、長時(shí)間處理。197誘變劑的復(fù)合處理常常表現(xiàn)出明顯的協(xié)同效應(yīng)，這對(duì)育種工作是有利的。（5）充分利用復(fù)合處理的協(xié)同效應(yīng)（synergism）誘變劑的復(fù)合處理常常表現(xiàn)出明顯的協(xié)同效應(yīng)，這對(duì)育種工198第八章微生物的遺傳變異和育種2課件199復(fù)合處理有幾類：①兩種或多種誘變劑的先后使用；②同一種誘變劑的重復(fù)使用；③兩種或多種誘變劑的同時(shí)使用。復(fù)合處理有幾類：200為了大大提高育種時(shí)初篩的效率，必須進(jìn)行大量的分析測定和統(tǒng)計(jì)工作，并找到形態(tài)變異與產(chǎn)量變異兩者間的相關(guān)性。（6）利用和創(chuàng)造形態(tài)、生理與產(chǎn)量間的相關(guān)指標(biāo)為了大大提高育種時(shí)初篩的效率，必須進(jìn)行大量的分析測定201利用鑒別性培養(yǎng)基的原理或其他途徑，就可有效地把原先肉眼無法觀察的生理性狀或產(chǎn)量性狀轉(zhuǎn)化為可見的“形態(tài)”性狀?？焖倨桨鍣z出法利用鑒別性培養(yǎng)基的原理或其他途徑，就可有效地把原先肉202在瓊脂平板上，通過觀察測定某突變菌落周圍蛋白酶水解圈的大小、淀粉酶變色圈（用碘液使淀粉顯色）的大小，氨基酸顯色圈（將菌落用打孔機(jī)取下，轉(zhuǎn)移到濾紙上，再用茚三酮試劑顯色）的大小，檸檬酸變色圈（可在厚濾紙上培養(yǎng)，用溴甲酚綠作指示劑）的大小，抗生素抑制圈的大小，指示菌生長圈的大?。y定生長因子產(chǎn)生），纖維素酶對(duì)纖維素水解圈（用剛果紅染色）的大小，外毒素的沉淀反應(yīng)圈的大小等，均可為初篩工作中估計(jì)某突變株代謝產(chǎn)物量的“形態(tài)”指標(biāo)。在瓊脂平板上，通過觀察測定某突變菌落周圍203（7）設(shè)計(jì)高效篩選方案設(shè)計(jì)簡便、高效的科學(xué)篩選方案。初篩篩選工作復(fù)篩以量為主（選留較多有生產(chǎn)潛力的菌株）以質(zhì)為主（對(duì)少量潛力大的菌株的代謝產(chǎn)物量作精確測定）（7）設(shè)計(jì)高效篩選方案設(shè)計(jì)簡便、高效的科學(xué)篩選方案。初篩篩選204常用的篩選方案第一輪：第二輪：第三輪： 同第二輪第四輪： 同上

... 直至獲得較滿意的結(jié)果為止常用的篩選方案第一輪：第二輪：第三輪： 同第二輪直至獲得較205初篩復(fù)篩對(duì)產(chǎn)量突變株生產(chǎn)性能的測定方法粗測為主在培養(yǎng)皿平板上在搖瓶中（8）創(chuàng)造新型篩選方法較精確的測定搖瓶培養(yǎng)or臺(tái)式自控發(fā)酵罐培養(yǎng)初篩復(fù)篩對(duì)產(chǎn)量突變株生產(chǎn)性能的測定方法粗測為主在培養(yǎng)皿平2063.3類突變株的篩選方法

（1）產(chǎn)量突變株的篩選1971年，國外有人報(bào)道了篩選春日霉素（kasugamycin，即“春雷霉素”）生產(chǎn)菌時(shí)所采用的一種瓊脂塊培養(yǎng)法，一年內(nèi)曾使該抗生素產(chǎn)量提高10倍。3.3類突變株的篩選方法

（1）產(chǎn)量突變株的篩選207此法的關(guān)鍵是用打孔器取出含有一個(gè)小菌落的瓊脂塊作分別培養(yǎng)。這樣，各瓊脂塊所含養(yǎng)料和接觸空氣面積基本相同，且產(chǎn)生的抗生素等代謝產(chǎn)物不致擴(kuò)散出瓊脂塊外。數(shù)據(jù)精確，效率高此法的關(guān)鍵是用打孔器取出含有一個(gè)小菌落的瓊脂塊作分別208（2）抗藥性突變株的篩選基因突變使菌株對(duì)某種或某幾種藥物，特別是抗生素，產(chǎn)生抗性。特點(diǎn)：正選擇標(biāo)記（突變株可直接從抗性平板上獲得-----在加有相應(yīng)抗生素的平板上，只有抗性突變能生長。所以很容易分離得到。）（2）抗藥性突變株的篩選基因突變使菌株對(duì)某種209梯度平板法（gradientplate）是定向篩選抗藥性突變株的一種有效方法，通過制備瓊脂表面存在藥物濃度梯度的平板、在其上涂布誘變處理后的細(xì)胞懸液、經(jīng)培養(yǎng)后再從其上選取抗藥性菌落等步驟，就可定向篩選到相應(yīng)抗藥性突變株。梯度平板法（gradientplate）是定210梯度平板法（gradientplate）是定向篩選抗藥性突變株的一種有效方法。梯度平板法（gradientplate）211表示方法：所抗藥物的前三個(gè)小寫斜體英文字母加上“r”。strrstrs對(duì)鏈霉素的抗性敏感性表示方法：所抗藥物的前三個(gè)小寫斜體英文字母加上“r”。str212（3）營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選營養(yǎng)缺陷型突變株（auxotrophicmutant）在生物學(xué)基礎(chǔ)理論和應(yīng)用研究以及生產(chǎn)實(shí)踐上都有極其重要的意義。（3）營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選營養(yǎng)缺陷型突變株（213營養(yǎng)缺陷型的表示方法：基因型：所需營養(yǎng)物的前三個(gè)英文小寫斜體字母表示：hisC（組氨酸缺陷型，其中的大寫字母C同一表型中不同基因的突變）表型：同上，但第一個(gè)字母大寫，且不用斜體：HisC在具體使用時(shí)多用hisC-和hisC+，分別表示缺陷型和野生型。營養(yǎng)缺陷型的表示方法：基因型：所需營養(yǎng)物的前三個(gè)英文小寫斜體214a.基本培養(yǎng)基（MM，符號(hào)為［－］）①

與篩選營養(yǎng)缺陷型突變株有關(guān)的3類培養(yǎng)基僅能滿足某微生物的野生型菌株生長所需的最低成分的組合培養(yǎng)基，稱MM。a.基本培養(yǎng)基（MM，符號(hào)為［－］）①與篩選營養(yǎng)缺陷型突215b.完全培養(yǎng)基（completemedium，CM，符號(hào)為［＋］）凡可滿足一切營養(yǎng)缺陷型菌株?duì)I養(yǎng)需要的天然或半組合培養(yǎng)基，稱為CM。一般可在基本培養(yǎng)基中加入一些富含氨基酸、維生素、核