專題1基因工程題圖：科技探索之路：1.1DNA重組技術的基本工具1.2基因工程的基本操作程序1.3基因工程的應用1.4蛋白質工程的崛起選修3：現代生物科技專題專題1基因工程題圖：選修3：現代生物科技專題專題1基因工程專題1基因工程專題1基因工程DNA重組技術的基本工具基因工程的基本操作程序基因工程應用蛋白質工程的崛起專題1基因工程DNA重組技術的基本工具煙草

據WTO調查：2004年全世界因狂犬病致死人數約5.5萬人

中國衛生部通報：2004年７月，狂犬病列法定報告傳染病死亡數之首。發病死亡率近100%

能產生狂犬病抗體蛋白的轉基因煙草據WTO調查：2004年全世界因狂犬病致死人數約5.5每100kg豬或牛的胰腺中僅可提取4~5g。

1979年，美國將人的胰島素基因重組到大腸桿菌內，實現了細菌生產胰島素，大大降低了生產成本。治療糖尿病特效藥——

據WTO調查：

2005年全世界約有糖尿病患者1.8億人，我國約6000萬。胰島素思考Q：轉基因技術實現了一種生物的某些性狀在另一種生物中表達。這些性狀的表達與我們學過的基因的什么過程有關？密碼子在生物界是的！DNA(基因)

mRNA蛋白質(性狀)轉錄翻譯通用每100kg豬或牛的胰腺中僅可提取4~5g。1979年基因工程：又叫DNA重組技術。通俗的說，就是按照人們的意愿，把一種生物的某種基因提取出來，加以修飾改造，然后放到另一種生物的細胞里，定向地改造生物的遺傳特性。基因工程的概念基因工程：又叫DNA重組技術。通俗的說，就是基礎理論和技術的發展催生了基因工程20世紀中葉,基礎理論取得了重大突破

DNA是遺傳物質的證明

DNA雙螺旋結構和中心法則的確立遺傳密碼的破譯技術發明使基因工程的實施成為可能

基因轉移載體的發現工具酶的發現

DNA合成和測序技術的發明

DNA體外重組的實現重組DNA表達實驗的成功第一例轉基因動物問世

PCR技術的發明基礎理論和技術的發展催生了基因工程20世紀中葉,基礎理論取得科技探索之路

艾弗里證明DNA是遺傳物質，DNA可從一種生物個體轉移到另一種生物個體。20世紀中葉,基礎理論取得了重大突破科技探索之路艾弗里證明DNA是遺傳物質，DN沃森、克里克提出DNA的雙螺旋結構模型。科技探索之路20世紀中葉,基礎理論取得了重大突破沃森、克里克提出DNA的雙螺旋結構模型。科技探索之路20世紀梅塞爾松、斯塔爾證明DNA的半保留復制科技探索之路20世紀中葉,基礎理論取得了重大突破梅塞爾松、斯塔爾證明DNA的半保留復制科技探索之路20世紀中克里克等提出中心法則DNARNA蛋白質轉錄翻譯逆轉錄復制科技探索之路20世紀中葉,基礎理論取得了重大突破克里克等提出中心法則DNARNA蛋白質轉錄翻譯逆轉錄復制科技科技探索之路

1963年尼倫伯格和馬太破譯編碼氨基酸的遺傳密碼，1966年霍拉納用實驗加以證明。20世紀中葉,基礎理論取得了重大突破科技探索之路1963年尼倫伯格和馬太破譯編碼氨基技術發明使基因工程的實施成為可能1)基因轉移載體的發現2)工具酶的發現3)DNA合成和測序技術的發明4)DNA體外重組的實現5)重組DNA表達實驗的成功6)第一例轉基因動物問世7)PCR技術的發明科技探索之路技術發明使基因工程的實施成為可能1)基因轉移載體的發現科技探基因工程的別名操作環境操作對象操作水平基本過程主要的技術結果基因拼接技術或DNA重組技術生物體外基因DNA分子水平人類需要的新生物類型和產品剪切→拼接→導入→表達一、基因工程的原理DNA重組技術或轉基因技術基因工程的別名操作環境操作對象操作水平基本過程主要的技術結果問題探討：蘇云金芽孢桿菌含有一種可以合成毒蛋白的基因。讓細菌的毒蛋白基因在棉花細胞中表達，可培育出抵抗棉鈴蟲害的抗蟲棉。想一想：需要做哪些關鍵工作？蘇云金芽孢桿菌毒蛋白普通棉花抗蟲棉問題探討：蘇云金芽孢桿菌含有一種可以蘇云金芽孢桿菌毒蛋白普通基因工程培育抗蟲棉的簡要過程：在以上過程中關鍵步驟或難點是什么？普通棉花(無抗蟲特性)蘇云金芽孢桿菌提取抗蟲基因通過運載體導入轉基因棉花含抗蟲基因轉基因棉花產生伴胞晶體轉基因棉花有抗蟲特性二、DNA重組技術的基本工具基因工程培育抗蟲棉的簡要過程：在以上過程中關鍵步驟或難點是什基因工程培育抗蟲棉的關鍵步驟：關鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細胞內提取出來關鍵步驟二：抗蟲基因與棉花DNA“縫合”關鍵步驟三：抗蟲基因進入棉花細胞二、DNA重組技術的基本工具基因工程培育抗蟲棉的關鍵步驟：關鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽解決培育抗蟲棉的關鍵步驟需要哪些工具？“分子手術刀”—限制性核酸內切酶關鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細胞內提取出來關鍵步驟二：抗蟲基因與棉花DNA“縫合”關鍵步驟三：抗蟲基因進入棉花細胞“分子縫合針”—DNA連接酶“分子運輸車”—基因進入受體細胞的載體二、DNA重組技術的基本工具解決培育抗蟲棉的關鍵步驟需要哪些工具？“分子手術刀”—限制思考Q:1.在自然界中有一些生物的DNA可能進入另一種生物的細胞中。我們有沒有學過相關的實例？2.單細胞生物并沒有在進化中，為什么不會因外源DNA的入侵而滅絕？有何保護機制？可能產生了一些特殊的酶來防范。可能這種酶能識別外來侵入的DNA并將其分解，而對自身的DNA不能起作用。“分子手術刀”——限制性核酸內切酶思考Q:1.在自然界中有一些生物的DNA尋根問底你能推測限制酶存在于原核生物中的作用是是什么嗎？

原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在長期的進化過程中形成了一套完善的防御機制，以防止外來病原物的侵害。限制酶就是細菌的一種防御性工具，當外源DNA侵入時，會利用限制酶將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，從而達到保護自身的目的。尋根問底你能推測限制酶存在于原核生物中的作用是是什么嗎？思考與探究P7（2）為什么限制酶不剪切細菌本身的DNA？通過長期的進化，細菌中含有某種限制酶的細胞，其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識別切割序列，或者通過甲基化酶將甲基轉移到所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。這樣，盡管細菌中含有某種限制酶也不會使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵。思考與探究P7（2）為什么限制酶不剪切細菌本身的DN⒈主要來源：⒉種類與命名：⒊作用特點（特異性）4.限制酶識別序列5.作用結果：1.識別雙鏈DNA分子中特定的核苷酸序列2.切割特定核苷酸序列中的特定位點主要從原核生物中分離純化產生黏性末端或平末端Goon大多數限制酶的識別序列由6個核苷酸組成少數的識別序列由4、5或8個核苷酸組成一、限制性核酸內切酶----分子手術刀⒈主要來源：1.識別雙鏈DNA分子中特定的核苷酸序列主要從原⒉種類與命名：現在已經從約300種微生物中分離出了約4000種限制性內切酶(限制酶)。EcoRⅠSmaⅠ粘質沙雷氏桿菌（Serratiamarcesens）大腸桿菌（EscherichiacoliR）Goback練習：流感嗜血桿菌的d菌株(Haemophilusinfluenzaed)中先后分離到3種限制酶，則分別命名為:HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ⒉種類與命名：現在已經從約300種微生物中分離出了約4000

T磷酸二酯鍵1234512345

AT磷酸二酯鍵1234512345A11《DNA重組技術的基本工具》課件(選修3)講義G

AA

TT

CC

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CCCGGGG

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CEcoRⅠ（4）作用結果：

黏性末端和平末端SmaⅠGAATTCCTTAAEcoRⅠ黏性末端黏性末端EcoRⅠ黏性末端黏性末端EcoRⅠ黏性末端黏性末端EcoRⅠ黏性末端黏性末端SmaⅠ平末端平末端SmaⅠ平末端平末端限制酶所識別的序列，無論是6個堿基還是4個堿基，都可以找到一條中心軸線（如圖），中軸線兩側的雙鏈DNA上的堿基是反向、對稱、重復排列的。想一想限制酶所識別的序列有什么特點？限制酶所識別的序列，無論是6個堿基還是4個堿

限制酶存在于原核細胞中的作用是什么？為什么限制酶不剪切細菌本身的DNA？限制酶存在于原核細胞中的作用是什么？為什么限制實例：1、下列關于限制酶的說法正確的是（）A.限制酶廣泛存在于各種生物中，但微生物中少B.一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列C.不同的限制酶切割DNA后都會形成黏性末端D.限制酶的作用部位是特定核苷酸形成的氫鍵Ｂ實例：1、下列關于限制酶的說法正確的是（）ＢQ:要想獲得某個特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個切口？可產生幾個黏性(平)末端？要切兩個切口，產生四個黏性(平)末端。Q:如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來切割，會怎樣呢？會產生相同的黏性(平)末端，然后讓兩者的黏性(平)末端黏合起來，就似乎可以合成重組的DNA分子了。思考?Q:要想獲得某個特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個切口？可產1、種類：2、作用部位：兩類E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶

磷酸二酯鍵DNA連接酶可把切下來的DNA片段拼接成新的DNA。即:把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來實質是把脫氧核糖和磷酸連接起來.二、DNA連接酶----分子縫合針1、種類：兩類E·coliDNA連接酶磷酸二酯鍵DNA連③類型：類型E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶來源功能大腸桿菌T4噬菌體恢復磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)相同點差別二、DNA連接酶----分子縫合針③類型：類型E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶來源功能可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，E·coliDNA連接酶或T4DNA連接酶即恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，E·coT4DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來，但效率較低T4DNA連接酶T4DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來，但效率DNA聚合酶DNA連接酶區別相同點尋根問底DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎?為什么?1)只能將單個核苷酸連接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯鍵形成磷酸二酯鍵1)在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵DNA聚合酶DNA連接酶相同點尋根問底DNA連接酶與DNA聚Q:外源基因(如抗蟲基因)怎樣才能導入受體細胞(如棉花細胞)？1.作用：2.種類：質粒、λ噬菌體的衍生物和動植物病毒等。

將外源基因送入受體細胞。三、基因進入受體細胞的載體--分子運輸車”Q:外源基因(如抗蟲基因)怎樣才能導入受體細胞(如棉花細胞)

最常用的質粒是大腸桿菌的質粒:常含有抗藥基因如:四環素的標記基因。(質粒的存在與否對受體細胞生存沒有決定性作用，但復制只能在受體細胞內完成)

質粒是一種裸露的、結構簡單、獨立于細菌染色體（即擬核DNA）之外，并且具有自我復制能力的雙鏈環狀DNA分子質粒是基因工程最常用的載體最常用的質粒是大腸桿菌的質粒:常含有抗藥基因如:四環素1.假如目的基因導入受體細胞后不能復制將怎樣？2.作為載體沒有切割位點將怎樣？3.目的基因是否進入受體細胞，你如何去察覺？4.如果載體對受體細胞有害將怎樣？作為運載體必須具備的條件1.假如目的基因導入受體細胞后不能復制將怎樣？作為運載體必須作為運載體必須具備的條件1.能夠在受體細胞中自我復制并穩定地保存。2.具有一個或多個限制酶切點，以便與外源基因連接。3.具有某些標記基因，便于進行篩選。4.必需是安全的，不會對受體細胞有害。注意：真正用作運載體的質粒都是人工改造過的作為運載體必須具備的條件1.能夠在受體細胞中自我復制并穩定地質粒的特點：1、細菌染色體外雙鏈環狀DNA分子2、能自我復制并在受體細胞中穩定存在3、有一個或多個限制酶切點4、有特殊的遺傳標記基因注意：真正用作運載體的質粒都是人工改造過的。質粒的特點：1、細菌染色體外雙鏈環狀DNA分子注意：注意：這兩條DNA分子的堿基對不是隨意亂寫的。一、每個DNA分子上的兩條鏈上的堿基要互補配對；二、每個DNA分子中每條鏈都存在一個G-A-A-T-T-C的堿基序列，也就是說是EcoRI限制酶的識別序列，并存在G-A的切割位點。四、模擬操作：重組DNA分子的模擬操作

注意：這兩條DNA分子的堿基對不是隨意亂寫的。四、模擬操作：小結：基因工程的工具限制酶主要存在于原核生物中具有專一性(識別序列)切開DNA分子的磷酸二酯鍵DNA連接酶連接磷酸二酯鍵種類E.coliDNA連接酶T4

DNA連接酶運載工具具備的條件結構簡單,大小適中能在宿主細胞中自我復制并穩定存在具一個多個限制酶切位點具標記基因質粒、λ噬菌體衍生物、動植物病毒小結：基因工程限制酶主要存在于原核生物中DNA連連接磷酸二酯1、關于限制酶的說法中，正確的是（）A、限制酶是一種酶，只識別GAATTC堿基序列B、EcoRI切割的是G—A之間的氫鍵C．限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外源DNAD．限制酶只存在于原核生物中課堂練習1、關于限制酶的說法中，正確的是（）課堂練習2、DNA連接酶催化的反應是()A．DNA復制時母鏈與子鏈之間形成氫鍵B．黏性末端堿基之間形成氫鍵C．兩個DNA片段黏性末端之間的縫隙的連接D．A、B、C都不正確2、DNA連接酶催化的反應是()3、作為基因的運輸工具——載體，必須具備的條件及理由是()A、能夠在宿主細胞中穩定地保存下來并大量復制，以便提供大量的目的基因B、具有多個限制酶切點，以便于目的基因的表達C．具有某些標記基因，以便為目的基因的表達提供條件D、能夠在宿主細胞中復制并穩定保存，以便于進行篩選3、作為基因的運輸工具——載體，必須具備的條件及理由是(4、質粒是基因工程最常見的載體，它的主要特點是()①能自主復制 ②不能自主復制 ③結構很小 ④是蛋白質 ⑤是環狀RNA ⑥是環狀DNA ⑦能“友好”地“借居”A、①③⑤⑦B、②④⑥C．①③⑥⑦D．②③⑥⑦4、質粒是基因工程最常見的載體，它的5、在受體細胞中能檢測出目的基因是因為()A、目的基因上有標記B、質粒具有某些標記基因C、重組質粒能夠復制D．以上都不正確5、在受體細胞中能檢測出目的基因是因為()6、關于質粒的敘述正確的是()A、質粒是能夠自我復制的環狀DNA分子B、質粒是唯一的載體C、重組質粒是目的基因D、質粒可在宿主外單獨復制6、關于質粒的敘述正確的是()7、基因工程中可用作載體的是()①質粒 ②噬菌體 ③病毒 ④動物細胞核A、①②③B、①②④C．②③④D、①③④7、基因工程中可用作載體的是()8、下列關于基因工程中所選用的質粒的說法，錯誤的是()A、不能沒有標記基因 B、是小型鏈狀的DNA分子C、能夠自我復制 D．可與目的基因重組8、下列關于基因工程中所選用的質粒9、下列黏性末端屬于同一限制酶切割而成的是()A、①② B、①③C、①④D、

②③9、下列黏性末端屬于同一限制酶切割而A、①② B10、要使目的基因與對應的載體重組，所需的兩種酶是()(1)限制酶(2)連接酶(3)解旋酶(4)還原酶A、(1)(2)(3)B、(1)(2)(4)C、(1)(2)D、(1)(3)10、要使目的基因與對應的載體重組，所需的兩種酶是()專題1基因工程題圖：科技探索之路：1.1DNA重組技術的基本工具1.2基因工程的基本操作程序1.3基因工程的應用1.4蛋白質工程的崛起選修3：現代生物科技專題專題1基因工程題圖：選修3：現代生物科技專題專題1基因工程專題1基因工程專題1基因工程DNA重組技術的基本工具基因工程的基本操作程序基因工程應用蛋白質工程的崛起專題1基因工程DNA重組技術的基本工具煙草

據WTO調查：2004年全世界因狂犬病致死人數約5.5萬人

中國衛生部通報：2004年７月，狂犬病列法定報告傳染病死亡數之首。發病死亡率近100%

能產生狂犬病抗體蛋白的轉基因煙草據WTO調查：2004年全世界因狂犬病致死人數約5.5每100kg豬或牛的胰腺中僅可提取4~5g。

1979年，美國將人的胰島素基因重組到大腸桿菌內，實現了細菌生產胰島素，大大降低了生產成本。治療糖尿病特效藥——

據WTO調查：

2005年全世界約有糖尿病患者1.8億人，我國約6000萬。胰島素思考Q：轉基因技術實現了一種生物的某些性狀在另一種生物中表達。這些性狀的表達與我們學過的基因的什么過程有關？密碼子在生物界是的！DNA(基因)

mRNA蛋白質(性狀)轉錄翻譯通用每100kg豬或牛的胰腺中僅可提取4~5g。1979年基因工程：又叫DNA重組技術。通俗的說，就是按照人們的意愿，把一種生物的某種基因提取出來，加以修飾改造，然后放到另一種生物的細胞里，定向地改造生物的遺傳特性。基因工程的概念基因工程：又叫DNA重組技術。通俗的說，就是基礎理論和技術的發展催生了基因工程20世紀中葉,基礎理論取得了重大突破

DNA是遺傳物質的證明

DNA雙螺旋結構和中心法則的確立遺傳密碼的破譯技術發明使基因工程的實施成為可能

基因轉移載體的發現工具酶的發現

DNA合成和測序技術的發明

DNA體外重組的實現重組DNA表達實驗的成功第一例轉基因動物問世

PCR技術的發明基礎理論和技術的發展催生了基因工程20世紀中葉,基礎理論取得科技探索之路

艾弗里證明DNA是遺傳物質，DNA可從一種生物個體轉移到另一種生物個體。20世紀中葉,基礎理論取得了重大突破科技探索之路艾弗里證明DNA是遺傳物質，DN沃森、克里克提出DNA的雙螺旋結構模型。科技探索之路20世紀中葉,基礎理論取得了重大突破沃森、克里克提出DNA的雙螺旋結構模型。科技探索之路20世紀梅塞爾松、斯塔爾證明DNA的半保留復制科技探索之路20世紀中葉,基礎理論取得了重大突破梅塞爾松、斯塔爾證明DNA的半保留復制科技探索之路20世紀中克里克等提出中心法則DNARNA蛋白質轉錄翻譯逆轉錄復制科技探索之路20世紀中葉,基礎理論取得了重大突破克里克等提出中心法則DNARNA蛋白質轉錄翻譯逆轉錄復制科技科技探索之路

1963年尼倫伯格和馬太破譯編碼氨基酸的遺傳密碼，1966年霍拉納用實驗加以證明。20世紀中葉,基礎理論取得了重大突破科技探索之路1963年尼倫伯格和馬太破譯編碼氨基技術發明使基因工程的實施成為可能1)基因轉移載體的發現2)工具酶的發現3)DNA合成和測序技術的發明4)DNA體外重組的實現5)重組DNA表達實驗的成功6)第一例轉基因動物問世7)PCR技術的發明科技探索之路技術發明使基因工程的實施成為可能1)基因轉移載體的發現科技探基因工程的別名操作環境操作對象操作水平基本過程主要的技術結果基因拼接技術或DNA重組技術生物體外基因DNA分子水平人類需要的新生物類型和產品剪切→拼接→導入→表達一、基因工程的原理DNA重組技術或轉基因技術基因工程的別名操作環境操作對象操作水平基本過程主要的技術結果問題探討：蘇云金芽孢桿菌含有一種可以合成毒蛋白的基因。讓細菌的毒蛋白基因在棉花細胞中表達，可培育出抵抗棉鈴蟲害的抗蟲棉。想一想：需要做哪些關鍵工作？蘇云金芽孢桿菌毒蛋白普通棉花抗蟲棉問題探討：蘇云金芽孢桿菌含有一種可以蘇云金芽孢桿菌毒蛋白普通基因工程培育抗蟲棉的簡要過程：在以上過程中關鍵步驟或難點是什么？普通棉花(無抗蟲特性)蘇云金芽孢桿菌提取抗蟲基因通過運載體導入轉基因棉花含抗蟲基因轉基因棉花產生伴胞晶體轉基因棉花有抗蟲特性二、DNA重組技術的基本工具基因工程培育抗蟲棉的簡要過程：在以上過程中關鍵步驟或難點是什基因工程培育抗蟲棉的關鍵步驟：關鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細胞內提取出來關鍵步驟二：抗蟲基因與棉花DNA“縫合”關鍵步驟三：抗蟲基因進入棉花細胞二、DNA重組技術的基本工具基因工程培育抗蟲棉的關鍵步驟：關鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽解決培育抗蟲棉的關鍵步驟需要哪些工具？“分子手術刀”—限制性核酸內切酶關鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細胞內提取出來關鍵步驟二：抗蟲基因與棉花DNA“縫合”關鍵步驟三：抗蟲基因進入棉花細胞“分子縫合針”—DNA連接酶“分子運輸車”—基因進入受體細胞的載體二、DNA重組技術的基本工具解決培育抗蟲棉的關鍵步驟需要哪些工具？“分子手術刀”—限制思考Q:1.在自然界中有一些生物的DNA可能進入另一種生物的細胞中。我們有沒有學過相關的實例？2.單細胞生物并沒有在進化中，為什么不會因外源DNA的入侵而滅絕？有何保護機制？可能產生了一些特殊的酶來防范。可能這種酶能識別外來侵入的DNA并將其分解，而對自身的DNA不能起作用。“分子手術刀”——限制性核酸內切酶思考Q:1.在自然界中有一些生物的DNA尋根問底你能推測限制酶存在于原核生物中的作用是是什么嗎？

原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在長期的進化過程中形成了一套完善的防御機制，以防止外來病原物的侵害。限制酶就是細菌的一種防御性工具，當外源DNA侵入時，會利用限制酶將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，從而達到保護自身的目的。尋根問底你能推測限制酶存在于原核生物中的作用是是什么嗎？思考與探究P7（2）為什么限制酶不剪切細菌本身的DNA？通過長期的進化，細菌中含有某種限制酶的細胞，其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識別切割序列，或者通過甲基化酶將甲基轉移到所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。這樣，盡管細菌中含有某種限制酶也不會使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵。思考與探究P7（2）為什么限制酶不剪切細菌本身的DN⒈主要來源：⒉種類與命名：⒊作用特點（特異性）4.限制酶識別序列5.作用結果：1.識別雙鏈DNA分子中特定的核苷酸序列2.切割特定核苷酸序列中的特定位點主要從原核生物中分離純化產生黏性末端或平末端Goon大多數限制酶的識別序列由6個核苷酸組成少數的識別序列由4、5或8個核苷酸組成一、限制性核酸內切酶----分子手術刀⒈主要來源：1.識別雙鏈DNA分子中特定的核苷酸序列主要從原⒉種類與命名：現在已經從約300種微生物中分離出了約4000種限制性內切酶(限制酶)。EcoRⅠSmaⅠ粘質沙雷氏桿菌（Serratiamarcesens）大腸桿菌（EscherichiacoliR）Goback練習：流感嗜血桿菌的d菌株(Haemophilusinfluenzaed)中先后分離到3種限制酶，則分別命名為:HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ⒉種類與命名：現在已經從約300種微生物中分離出了約4000

T磷酸二酯鍵1234512345

AT磷酸二酯鍵1234512345A11《DNA重組技術的基本工具》課件(選修3)講義G

AA

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CEcoRⅠ（4）作用結果：

黏性末端和平末端SmaⅠGAATTCCTTAAEcoRⅠ黏性末端黏性末端EcoRⅠ黏性末端黏性末端EcoRⅠ黏性末端黏性末端EcoRⅠ黏性末端黏性末端SmaⅠ平末端平末端SmaⅠ平末端平末端限制酶所識別的序列，無論是6個堿基還是4個堿基，都可以找到一條中心軸線（如圖），中軸線兩側的雙鏈DNA上的堿基是反向、對稱、重復排列的。想一想限制酶所識別的序列有什么特點？限制酶所識別的序列，無論是6個堿基還是4個堿

限制酶存在于原核細胞中的作用是什么？為什么限制酶不剪切細菌本身的DNA？限制酶存在于原核細胞中的作用是什么？為什么限制實例：1、下列關于限制酶的說法正確的是（）A.限制酶廣泛存在于各種生物中，但微生物中少B.一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列C.不同的限制酶切割DNA后都會形成黏性末端D.限制酶的作用部位是特定核苷酸形成的氫鍵Ｂ實例：1、下列關于限制酶的說法正確的是（）ＢQ:要想獲得某個特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個切口？可產生幾個黏性(平)末端？要切兩個切口，產生四個黏性(平)末端。Q:如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來切割，會怎樣呢？會產生相同的黏性(平)末端，然后讓兩者的黏性(平)末端黏合起來，就似乎可以合成重組的DNA分子了。思考?Q:要想獲得某個特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個切口？可產1、種類：2、作用部位：兩類E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶

磷酸二酯鍵DNA連接酶可把切下來的DNA片段拼接成新的DNA。即:把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來實質是把脫氧核糖和磷酸連接起來.二、DNA連接酶----分子縫合針1、種類：兩類E·coliDNA連接酶磷酸二酯鍵DNA連③類型：類型E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶來源功能大腸桿菌T4噬菌體恢復磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)相同點差別二、DNA連接酶----分子縫合針③類型：類型E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶來源功能可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，E·coliDNA連接酶或T4DNA連接酶即恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，E·coT4DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來，但效率較低T4DNA連接酶T4DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來，但效率DNA聚合酶DNA連接酶區別相同點尋根問底DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎?為什么?1)只能將單個核苷酸連接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯鍵形成磷酸二酯鍵1)在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵DNA聚合酶DNA連接酶相同點尋根問底DNA連接酶與DNA聚Q:外源基因(如抗蟲基因)怎樣才能導入受體細胞(如棉花細胞)？1.作用：2.種類：質粒、λ噬菌體的衍生物和動植物病毒等。

將外源基因送入受體細胞。三、基因進入受體細胞的載體--分子運輸車”Q:外源基因(如抗蟲基因)怎樣才能導入受體細胞(如棉花細胞)

最常用的質粒是大腸桿菌的質粒:常含有抗藥基因如:四環素的標記基因。(質粒的存在與否對受體細胞生存沒有決定性作用，但復制只能在受體細胞內完成)

質粒是一種裸露的、結構簡單、獨立于細菌染色體（即擬核DNA）之外，并且具有自我復制能力的雙鏈環狀DNA分子質粒是基因工程最常用的載體最常用的質粒是大腸桿菌的質粒:常含有抗藥基因如:四環素1.假如目的基因導入受體細胞后不能復制將怎樣？2.作為載體沒有切割位點將怎樣？3.目的基因是否進入受體細胞，你如何去察覺？4.如果載體對受體細胞有害將怎樣？作為運載體必須具備的條件1.假如目的基因導入受體細胞后不能復制將怎樣？作為運載體必須作為運載體必須具備的條件1.能夠在受體細胞中自我復制并穩定地保存。2.具有一個或多個限制酶切點，以便與外源基因連接。3.具有某些標記基因，便于進行篩選。4.必需是安全的，不會對受體細胞有害。注意：真正用作運載體的質粒都是人工改造過的作為運載體必須具備的條件1.能夠在受體細胞中自我復制并穩定地質粒的特點：1、細菌染色體外雙鏈環狀DNA分子2、能自我復制并在受體細胞中穩定存在3、有一個或多個限制酶切點4、有特殊的遺傳標記基因注意：真正用作運載體的質粒都是人工改造過的。質粒的特點：1、細菌染色體外雙鏈環狀DNA分子注意：注意：這兩條DNA分子的堿基對不是隨意亂寫的。一、每個DNA分子上的兩條鏈上的堿基要互補配對；二、每個DNA分子中每條鏈都存在一個G-A-A-T-T-C的堿基序列，也就是說是EcoRI限制酶的識別序列，并存在G-A的切割位點。四、模擬操作：重組DNA分子的模擬操作

注意：這兩條DNA分子的堿基對不是隨意亂寫的。四、模擬操作：小結：基因工程的工具限制酶主要存