第二十章免疫檢驗自動化儀器分析第二十章11．了解免疫檢測自動化的基本概念2．了解免疫檢測自動化設(shè)計的基本原理3．了解免疫檢測自動化儀器在臨床上的應(yīng)用4．掌握常用的幾種免疫檢測自動化儀器的檢測原理、應(yīng)用以及評價，本章重點1．了解免疫檢測自動化的基本概念本章重點2

免疫檢驗自動化(automationofimmunoassays)

是將免疫學(xué)反應(yīng)檢測過程中的取樣、加試劑、混合、溫育、固相載體分離、信號檢測、數(shù)據(jù)處理、打印報告和檢測后的儀器清洗等步驟由計算機控制，自動化進(jìn)行。免疫檢驗自動化3第一節(jié)自動化免疫濁度分析系統(tǒng)第20章(濁度)自動化儀器分析課件4免疫濁度分析屬液相沉淀試驗，其基本原理是：抗原、抗體在特定的電解質(zhì)溶液中反應(yīng)，形成小分子免疫復(fù)合物（<19S），在增濁劑（如PEG、NaF等）的作用下，迅速形成免疫復(fù)合物微粒（>19S），使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。在抗體稍微過量且固定的情況下，形成的免疫復(fù)合物量隨抗原量的增加而增加，反應(yīng)液的濁度亦隨之增大，即待測抗原量與反應(yīng)溶液的濁度呈正相關(guān)。

免疫濁度分析屬液相沉淀試驗，其基本原理是：5一、免疫透射比濁法【原理】一定波長的入射光線通過抗原抗體反應(yīng)后的溶液時，被其中的免疫復(fù)合物微粒吸收、反射和折射而減弱(圖9-7)，在一定范圍內(nèi)，吸光度與免疫復(fù)合物量呈正相關(guān)，而形成的免疫復(fù)合物量與參與反應(yīng)的抗原和抗體的量呈函數(shù)關(guān)系。與已知濃度的抗原標(biāo)準(zhǔn)品比較，可確定標(biāo)本中抗原含量。一、免疫透射比濁法【原理】一定波長的入射光線通過抗原抗體反6第20章(濁度)自動化儀器分析課件7

二、免疫膠乳比濁法

原理

用抗體致敏的大小適中、均勻一致的膠乳顆粒（一般為0.2μm），在遇到相應(yīng)抗原時，膠乳顆粒上的抗體與抗原特異結(jié)合，引起膠乳顆粒凝聚

，使透射光和散射光即出現(xiàn)顯著變化。如圖所示：a為單個膠乳顆粒不阻礙光線透過，b為抗原抗體結(jié)合形成的凝聚膠乳大顆粒使透射光減弱或散射光增強。

二、免疫膠乳比濁法8三、免疫散射比濁法【原理】

粒子對光線的散射作用是溶液中的微粒子受到光線照射后，微粒子對光線產(chǎn)生反射和折射而形成散射光。懸浮微粒對光散射形成的散射光強度與微粒的大小、數(shù)量、入射光的波長和強度、測量角度等因素密切相關(guān)，其公式如下：三、免疫散射比濁法【原理】9

式中Iθ為與入射光成θ角處散射光強度；λ和I0為入射光的波長和強度；dn/dc為校正因子，反映了溶液折射指數(shù)和顆粒濃度的變化；M為顆粒分子量；c為濃度；N為阿佛加德指數(shù)；γ為顆粒到檢測器的距離；θ為散射光與入射光的夾角（散射夾角）。Iθ＝I0［4π2（dn/dc)2Mc(1+cosθ)］Nγ2λ4式中Iθ為與入射光成θ角處散射光強度；λ和I0為入射光的波10顆粒直徑<1/10λRayleigh散射1/10λ<顆粒直徑≤λDebye散射顆粒直徑≥λMile散射顆粒直徑<1/10λRayle11

㈠定時散射比濁法（fixedtimenephelometry）

定時散射比濁法是在保證抗體過量的情況下，加入待測抗原，此時反應(yīng)立即開始，在反應(yīng)的第一階段，溶液中產(chǎn)生的散射光信號波動較大，所獲取的信號計算出的結(jié)果會產(chǎn)生一定的誤差。定時散射比濁法是避開抗原抗體反應(yīng)的不穩(wěn)定階段，即散射光信號在開始反應(yīng)7.5s～2min內(nèi)的第一次讀數(shù)，專門在抗原抗體反應(yīng)的最佳時段進(jìn)行讀數(shù)，將檢測誤差降到最低。

㈠定時散射比濁法（fixedtimenephelome12

㈡速率散射比濁法（ratenephelometry）速率散射比濁法是抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的動力學(xué)測定法。所謂速率是指抗原抗體反應(yīng)在單位時間內(nèi)形成免疫復(fù)合物的速度（不是免疫復(fù)合物累積的量），連續(xù)測定各單位時間內(nèi)復(fù)合物形成的速率與其產(chǎn)生的散射光信號聯(lián)系在一起，形成動態(tài)的速率散射比濁法，每項檢測僅1min～2min即可完成。

㈡速率散射比濁法（ratenephelometry）13表抗原抗體復(fù)合物形成的速率累計時間（s）形成IC總量速率累計時間（s）形成IC總量速率5

8－10

13

515

25

1220

60

3525

150

9030

230

8035

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6045

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4555

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3060

500

20表抗原抗體復(fù)合物形成的速率累計時間（s）形成IC總量14抗原抗體反應(yīng)速率的動態(tài)變化抗原抗體反應(yīng)速率的動態(tài)變化15第20章(濁度)自動化儀器分析課件16第20章(濁度)自動化儀器分析課件17BNProSpec全自動特定蛋白分析儀BNProSpec全自動特定蛋白分析儀18BNP防抗原過量的設(shè)計：優(yōu)化反應(yīng)條件，令初始稀釋度分析范圍更寬，保證抗原抗體反應(yīng)呈最佳比例預(yù)反應(yīng)程序：IgM，LamU，AlbU，β2MUVLinIntegral計算程序BNP防抗原過量的設(shè)計：19定時散射比濁法測定原理示意圖

定時散射比濁法測定原理示意圖20IMMAGE全自動特定蛋白分析儀IMMAGE全自動特定蛋白分析儀21第20章(濁度)自動化儀器分析課件22一、特異性二、比例性三、可逆性一、抗體來源：兔，羊，---二、親合力三、濃度四、電解質(zhì)，(增濁劑)五、pH

六、溫度抗原抗體反應(yīng)的特點抗原抗體反應(yīng)的影響因素一、特異性一、抗體來源：兔，羊，---抗原抗體反應(yīng)的特點抗原23抗體抗體的質(zhì)量

特異性強，效價高，親和力強，R型抗體的含量

抗體過量抗體抗體的質(zhì)量24抗體的特異性

抗體只針對相應(yīng)的抗原，非特異性的交叉反應(yīng)會引起偽濁度。抗體的特異性25抗體的效價

一個合格的比濁用抗體其效價必須在1：20（抗體稀釋度）以上，否則易形成偽濁度。抗體的效價26抗體的親和力

親和力強則抗體活性高，不僅可以加快抗原抗體反應(yīng)速度，而且形成的免疫復(fù)合物較牢固，不易發(fā)生解離。抗體的親和力27R型抗血清以家兔為代表的小動物血清，如豚鼠、大白鼠、家兔、家禽、羊等動物的免疫血清。這類抗血清親和力高，與抗原結(jié)合后不易再解離，抗體過剩時易形成大而穩(wěn)定的復(fù)合物，抗原過剩時則形成可溶性復(fù)合物。R型抗血清28H型抗血清以馬為代表的大動物血清，如驢、騾、馬等動物的免疫血清。該血清親和力弱，抗原抗體結(jié)合后極易再解離，抗原過剩和抗體過剩皆易形成可溶性復(fù)合物。H型抗血清29pH：6.5~8.5離子強度：在一定范圍內(nèi)，離子強度大，IC形成快；離子強度過低或無電解質(zhì)存在，則不易出現(xiàn)可見的沉淀反應(yīng)。pH：6.5~8.5303.增濁劑的使用

為了提高抗原抗體復(fù)合物的形成速度，常常要加入增濁劑，如分子量為6000～8000的3%～4%聚乙二醇（PEG）或吐溫-20（tween-20），以消除蛋白質(zhì)分子周圍的電子云和水化層，促進(jìn)抗原抗體結(jié)合。但PEG濃度過高，分子量過大會引起血清中其他蛋白質(zhì)（如IgM、α2巨球蛋白、脂蛋白）非特異性沉淀，形成偽濁度。因此，使用恰當(dāng)?shù)脑鰸釀线m的濃度是準(zhǔn)確測定所必須的。

3.增濁劑的使用

為了提高抗原抗體復(fù)合物的形成速度，常常314.偽濁度非抗原抗體特異性結(jié)合形成的濁度，稱為偽濁度，可導(dǎo)致抗原檢測結(jié)果假性升高。偽濁度形成的原因包括①混濁標(biāo)本、高血脂標(biāo)本、反復(fù)凍融標(biāo)本；②抗體效價低（<1:20）、抗血清滅活處理、抗血清含有交叉反應(yīng)性抗體等；③增濁劑PEG濃度過高；④抗血清細(xì)菌污染和變質(zhì)；⑤器材尤其是比色杯不清潔、塵埃污染等；⑥緩沖液的離子強度太高，pH和溫度不適合等，都對濁度產(chǎn)生影響。

4.偽濁度325.標(biāo)準(zhǔn)曲線制備與質(zhì)量控制

應(yīng)用儀器規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)品制備劑量-反應(yīng)曲線，一般采用5點或6點定標(biāo)，然后選擇適當(dāng)?shù)臄?shù)學(xué)方法進(jìn)行曲線擬合；

每更換一批試劑，應(yīng)重新制備劑量-反應(yīng)曲線。為保證結(jié)果準(zhǔn)確可靠，選取合適的質(zhì)控血清，每次開機進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)量控制是極其必要的。

5.標(biāo)準(zhǔn)曲線制備與質(zhì)量控制

應(yīng)用儀器規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)品制33第20章(濁度)自動化儀器分析課件34根據(jù)全自動酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)的處理模式，人們通常將全自動酶免分析儀分成二類，一類為分體機，一類為連體機。分體機是由“前處理系統(tǒng)”即全自動樣本處理工作站和“后處理系統(tǒng)”即全自動酶免分析儀兩個獨立的部分組成。連體機是由多個模塊組成，使用一臺計算機、一套操作系統(tǒng)實現(xiàn)了從標(biāo)本稀釋、加樣到酶標(biāo)板孵育、洗滌、加試劑、再孵育、洗滌、讀數(shù)和結(jié)果打印全自動進(jìn)行。

自動化酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)根據(jù)全自動酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)的處理模式，人們通常將全自35全自動酶免分析儀可對6～30塊板酶標(biāo)板同時進(jìn)行工作，具有一套完整的工作和分析系統(tǒng)，不同的儀器大小不同、配置不同，但性能基本相同。

全自動酶免分析儀可對6～30塊板酶標(biāo)板同時進(jìn)行工作，具有一套361.條形碼識別系統(tǒng)

2.樣本架和加樣系統(tǒng)

3.試劑架

4.溫育系統(tǒng)

5.液路系統(tǒng)

6.洗板系統(tǒng)

7.

酶標(biāo)板讀數(shù)儀

8.自動裝載傳遞系統(tǒng)

9.計算機管理和信息系統(tǒng)

1.條形碼識別系統(tǒng)37第20章(濁度)自動化儀器分析課件38第20章(濁度)自動化儀器分析課件39第20章(濁度)自動化儀器分析課件40儀器評價全自動酶免分析儀中的連體機是將樣本處理工作站和全自動酶免分析儀聯(lián)合起來，工作速度快，自動化程度高，適合大批量樣本的處理，如血站系統(tǒng)。分體機，由于它有一個獨立的全自動樣本處理站，加樣速度快，適合試驗項目變化多、樣本批量不等的臨床實驗室。儀器評價41自動化免疫比濁分析儀，全自動化學(xué)發(fā)光免疫測定系統(tǒng)，全自動化學(xué)發(fā)光酶免疫測定系統(tǒng)，全自動電化學(xué)發(fā)光免疫測定系統(tǒng)，自動化酶聯(lián)免疫測定系統(tǒng)等。本章重點自動化免疫比濁分析儀，本章重點42謝謝謝謝43第二十章免疫檢驗自動化儀器分析第二十章441．了解免疫檢測自動化的基本概念2．了解免疫檢測自動化設(shè)計的基本原理3．了解免疫檢測自動化儀器在臨床上的應(yīng)用4．掌握常用的幾種免疫檢測自動化儀器的檢測原理、應(yīng)用以及評價，本章重點1．了解免疫檢測自動化的基本概念本章重點45

免疫檢驗自動化(automationofimmunoassays)

是將免疫學(xué)反應(yīng)檢測過程中的取樣、加試劑、混合、溫育、固相載體分離、信號檢測、數(shù)據(jù)處理、打印報告和檢測后的儀器清洗等步驟由計算機控制，自動化進(jìn)行。免疫檢驗自動化46第一節(jié)自動化免疫濁度分析系統(tǒng)第20章(濁度)自動化儀器分析課件47免疫濁度分析屬液相沉淀試驗，其基本原理是：抗原、抗體在特定的電解質(zhì)溶液中反應(yīng)，形成小分子免疫復(fù)合物（<19S），在增濁劑（如PEG、NaF等）的作用下，迅速形成免疫復(fù)合物微粒（>19S），使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。在抗體稍微過量且固定的情況下，形成的免疫復(fù)合物量隨抗原量的增加而增加，反應(yīng)液的濁度亦隨之增大，即待測抗原量與反應(yīng)溶液的濁度呈正相關(guān)。

免疫濁度分析屬液相沉淀試驗，其基本原理是：48一、免疫透射比濁法【原理】一定波長的入射光線通過抗原抗體反應(yīng)后的溶液時，被其中的免疫復(fù)合物微粒吸收、反射和折射而減弱(圖9-7)，在一定范圍內(nèi)，吸光度與免疫復(fù)合物量呈正相關(guān)，而形成的免疫復(fù)合物量與參與反應(yīng)的抗原和抗體的量呈函數(shù)關(guān)系。與已知濃度的抗原標(biāo)準(zhǔn)品比較，可確定標(biāo)本中抗原含量。一、免疫透射比濁法【原理】一定波長的入射光線通過抗原抗體反49第20章(濁度)自動化儀器分析課件50

二、免疫膠乳比濁法

原理

用抗體致敏的大小適中、均勻一致的膠乳顆粒（一般為0.2μm），在遇到相應(yīng)抗原時，膠乳顆粒上的抗體與抗原特異結(jié)合，引起膠乳顆粒凝聚

，使透射光和散射光即出現(xiàn)顯著變化。如圖所示：a為單個膠乳顆粒不阻礙光線透過，b為抗原抗體結(jié)合形成的凝聚膠乳大顆粒使透射光減弱或散射光增強。

二、免疫膠乳比濁法51三、免疫散射比濁法【原理】

粒子對光線的散射作用是溶液中的微粒子受到光線照射后，微粒子對光線產(chǎn)生反射和折射而形成散射光。懸浮微粒對光散射形成的散射光強度與微粒的大小、數(shù)量、入射光的波長和強度、測量角度等因素密切相關(guān)，其公式如下：三、免疫散射比濁法【原理】52

式中Iθ為與入射光成θ角處散射光強度；λ和I0為入射光的波長和強度；dn/dc為校正因子，反映了溶液折射指數(shù)和顆粒濃度的變化；M為顆粒分子量；c為濃度；N為阿佛加德指數(shù)；γ為顆粒到檢測器的距離；θ為散射光與入射光的夾角（散射夾角）。Iθ＝I0［4π2（dn/dc)2Mc(1+cosθ)］Nγ2λ4式中Iθ為與入射光成θ角處散射光強度；λ和I0為入射光的波53顆粒直徑<1/10λRayleigh散射1/10λ<顆粒直徑≤λDebye散射顆粒直徑≥λMile散射顆粒直徑<1/10λRayle54

㈠定時散射比濁法（fixedtimenephelometry）

定時散射比濁法是在保證抗體過量的情況下，加入待測抗原，此時反應(yīng)立即開始，在反應(yīng)的第一階段，溶液中產(chǎn)生的散射光信號波動較大，所獲取的信號計算出的結(jié)果會產(chǎn)生一定的誤差。定時散射比濁法是避開抗原抗體反應(yīng)的不穩(wěn)定階段，即散射光信號在開始反應(yīng)7.5s～2min內(nèi)的第一次讀數(shù)，專門在抗原抗體反應(yīng)的最佳時段進(jìn)行讀數(shù)，將檢測誤差降到最低。

㈠定時散射比濁法（fixedtimenephelome55

㈡速率散射比濁法（ratenephelometry）速率散射比濁法是抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的動力學(xué)測定法。所謂速率是指抗原抗體反應(yīng)在單位時間內(nèi)形成免疫復(fù)合物的速度（不是免疫復(fù)合物累積的量），連續(xù)測定各單位時間內(nèi)復(fù)合物形成的速率與其產(chǎn)生的散射光信號聯(lián)系在一起，形成動態(tài)的速率散射比濁法，每項檢測僅1min～2min即可完成。

㈡速率散射比濁法（ratenephelometry）56表抗原抗體復(fù)合物形成的速率累計時間（s）形成IC總量速率累計時間（s）形成IC總量速率5

8－10

13

515

25

1220

60

3525

150

9030

230

8035

300

7040

360

6045

415

5550

450

4555

480

3060

500

20表抗原抗體復(fù)合物形成的速率累計時間（s）形成IC總量57抗原抗體反應(yīng)速率的動態(tài)變化抗原抗體反應(yīng)速率的動態(tài)變化58第20章(濁度)自動化儀器分析課件59第20章(濁度)自動化儀器分析課件60BNProSpec全自動特定蛋白分析儀BNProSpec全自動特定蛋白分析儀61BNP防抗原過量的設(shè)計：優(yōu)化反應(yīng)條件，令初始稀釋度分析范圍更寬，保證抗原抗體反應(yīng)呈最佳比例預(yù)反應(yīng)程序：IgM，LamU，AlbU，β2MUVLinIntegral計算程序BNP防抗原過量的設(shè)計：62定時散射比濁法測定原理示意圖

定時散射比濁法測定原理示意圖63IMMAGE全自動特定蛋白分析儀IMMAGE全自動特定蛋白分析儀64第20章(濁度)自動化儀器分析課件65一、特異性二、比例性三、可逆性一、抗體來源：兔，羊，---二、親合力三、濃度四、電解質(zhì)，(增濁劑)五、pH

六、溫度抗原抗體反應(yīng)的特點抗原抗體反應(yīng)的影響因素一、特異性一、抗體來源：兔，羊，---抗原抗體反應(yīng)的特點抗原66抗體抗體的質(zhì)量

特異性強，效價高，親和力強，R型抗體的含量

抗體過量抗體抗體的質(zhì)量67抗體的特異性

抗體只針對相應(yīng)的抗原，非特異性的交叉反應(yīng)會引起偽濁度。抗體的特異性68抗體的效價

一個合格的比濁用抗體其效價必須在1：20（抗體稀釋度）以上，否則易形成偽濁度。抗體的效價69抗體的親和力

親和力強則抗體活性高，不僅可以加快抗原抗體反應(yīng)速度，而且形成的免疫復(fù)合物較牢固，不易發(fā)生解離。抗體的親和力70R型抗血清以家兔為代表的小動物血清，如豚鼠、大白鼠、家兔、家禽、羊等動物的免疫血清。這類抗血清親和力高，與抗原結(jié)合后不易再解離，抗體過剩時易形成大而穩(wěn)定的復(fù)合物，抗原過剩時則形成可溶性復(fù)合物。R型抗血清71H型抗血清以馬為代表的大動物血清，如驢、騾、馬等動物的免疫血清。該血清親和力弱，抗原抗體結(jié)合后極易再解離，抗原過剩和抗體過剩皆易形成可溶性復(fù)合物。H型抗血清72pH：6.5~8.5離子強度：在一定范圍內(nèi)，離子強度大，IC形成快；離子強度過低或無電解質(zhì)存在，則不易出現(xiàn)可見的沉淀反應(yīng)。pH：6.5~8.5733.增濁劑的使用

為了提高抗原抗體復(fù)合物的形成速度，常常要加入增濁劑，如分子量為6000～8000的3%～4%聚乙二醇（PEG）或吐溫-20（tween-20），以消除蛋白質(zhì)分子周圍的電子云和水化層，促進(jìn)抗原抗體結(jié)合。但PEG濃度過高，分子量過大會引起血清中其他蛋白質(zhì)（如IgM、α2巨球蛋白、脂蛋白）非特異性沉淀，形成偽濁度。因此，使用恰當(dāng)?shù)脑鰸釀线m的濃度是準(zhǔn)確測定所必須的。

3.增濁劑的使用

為了提高抗原抗體復(fù)合物的形成速度，常常744.偽濁度非抗原抗體特異性結(jié)合形成的濁度，稱為偽濁度，可導(dǎo)致抗原檢測結(jié)果假性升高。偽濁度形成的原因包括①混濁標(biāo)本、高血脂標(biāo)本、反復(fù)凍融標(biāo)本；②抗體效價低（<1:20）、抗血清滅活處理、抗血清含有交叉反應(yīng)性抗體等；③增濁劑PEG濃度過高；④抗血清細(xì)菌污染和變質(zhì)；⑤器材尤其是比色杯不清潔、塵埃污染等；⑥緩沖液的離子強度太高，pH和溫度不適合等，都對濁度產(chǎn)生影響。