酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定方法ELISA概述ELISA基本原理ELISA試劑的組成ELISA測定方法ELISA實驗過程ELISA在食品檢測中的應(yīng)用ELISA在國外研究進展ELISA概述enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISAELISA屬于標(biāo)記免疫學(xué)技術(shù)的一種，1971年由荷蘭和瑞典的學(xué)者提出，由于其操作過程簡單易行并可以定量，從而使其在食品安全和衛(wèi)生檢測中得到了廣泛的應(yīng)用。目前市場上有多種基于ELISA方法開發(fā)的用于食品中抗生素檢測的試劑盒產(chǎn)品。ELISA基本原理使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性（固相抗原／抗體的形成）在測定時，把受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)（抗原抗體反應(yīng)）用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與干擾物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。（酶標(biāo)抗原抗體復(fù)合物的分離）

加入底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進行定性或定量分析。（顯色反應(yīng)）ELISA基本原理圖示洗滌的方法將固相載體上的復(fù)合物與其他物質(zhì)分離

將抗原或抗體固定于合適的載體上，并保持其生物活性

使抗原或抗體與某種酶連接，形成酶標(biāo)抗原或抗體加入酶反應(yīng)底物，復(fù)合物上的酶催化底物使其分解，氧化或還原成有色產(chǎn)物

待測樣品與酶標(biāo)抗原或抗體反應(yīng)ELISA試劑組成完整的ELISA試劑盒應(yīng)包含以下各組分：

（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑，俗稱酶標(biāo)板）

（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（酶標(biāo)記物）（3）酶的底物（4）系列參考標(biāo)準(zhǔn)品（定量測定）

（5）酶標(biāo)記物及樣本的稀釋液

（6）洗滌液

（7）反應(yīng)終止液2.免疫吸附劑 已包被抗原或抗體的固相載體，是ELISA方法中的核心試劑。4.酶的底物HRP的底物

常用的供氫體有鄰苯二胺(OPD)和四甲基聯(lián)苯胺(TMB)。

OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應(yīng)后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度高。

OPD見光易變質(zhì)，與過氧化氫混合成底物應(yīng)用液后更不穩(wěn)定，須現(xiàn)配置現(xiàn)用。先進的ELISA試劑盒中則直接配成含保護劑的工作濃度為0.02%H2O2的應(yīng)用液,只需加入OPD后即可作為底物應(yīng)用。6.酶反應(yīng)終止液

常用的HRP反應(yīng)終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板式ELISA中一般采用2mol/L。7.參考標(biāo)準(zhǔn)品

定量測定的ELISA試劑盒應(yīng)含有制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用的參考標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)包括覆蓋可檢測范圍的4-5個濃度，一般均配入含蛋白保護劑及防腐劑的緩沖液中。

ELISA測定方法ELISA常用測定方法主要直接法和間接法。直接法是酶標(biāo)記抗體與待檢測樣本中固相抗原直接作用，加入底物后，顯色，其顏色深淺與樣本中抗原量成正比；間接法是使已知抗原吸附在固相載體上，與待檢測樣本中的抗體作用，加入酶底物，顯色，顏色深淺與樣本中抗體量成正比。ELISA大致分為三類：（1）測定抗體的間接法。（2）測定抗原的雙抗體夾心法。（3）測定抗原的競爭法。

前兩種方法主要用于測定抗體和大分子抗原，適用于臨床診斷上，而競爭法事測定小分子抗原的方法，因而尤其適用于食品分析。ELIZA方法圖示間接法雙抗體夾心法非競爭結(jié)合反應(yīng)常用于抗原的檢測適用于分子中具有至少兩個抗原決定簇的多價抗原，而不能用于小分子半抗原的檢測所用兩種抗體分別針對同一個抗原分子的不同抗原決定簇SandwichELISAAless-commonvariantofthistechnique,called"sandwich"ELISA,isusedtodetectsampleantigen.Thestepsareasfollows:Prepareasurfacetowhichaknownquantityofcaptureantibodyisbound.Blockanynonspecificbindingsitesonthesurface.Applytheantigen-containingsampletotheplate.Washtheplate,sothatunboundantigenisremoved.Applyenzymelinkedprimaryantibodiesasdetectionantibodieswhichalsobindspecificallytotheantigen.Washtheplate,sothattheunboundantibody-enzymeconjugatesareremoved.Applyachemicalwhichisconvertedbytheenzymeintoacolororfluorescentorelectrochemicalsignal.Measuretheabsorbencyorfluorescenceorelectrochemicalsignal(e.g.,current)oftheplatewellstodeterminethepresenceandquantityofantigen.AsandwichELISA.(1)Plateiscoatedwithacaptureantibody;(2)sampleisadded,andanyantigenpresentbindstocaptureantibody;(3)enzymelinkedcaptureantibodyusedasdetectingantibodyisadded,andbindstoantigen;(4)substrateisadded,andisconvertedbyenzymetodetectableform.測定孔EEEEE底物溶液對照孔EEEEEEEEEEEEEEE酶標(biāo)記物底物溶液參考液(不含抗原)EE樣本(含抗原)CompetitiveELISAAthirduseofELISAisthroughcompetitivebinding.ThestepsforthisELISAaresomewhatdifferentthanthefirsttwoexamples:Unlabeledantibodyisincubatedinthepresenceofitsantigen.Theseboundantibody/antigencomplexesarethenaddedtoanantigencoatedwell.Theplateiswashed,sothatunboundantibodyisremoved.(Themoreantigeninthesample,thelessantibodywillbeabletobindtotheantigeninthewell,hence"competition.")Thesecondaryantibody,specifictotheprimaryantibodyisadded.Thissecondantibodyiscoupledtotheenzyme.Asubstrateisadded,andremainingenzymeselicitachromogenicorfluorescentsignal.ELISA實驗過程1.實驗試劑的準(zhǔn)備 按試劑盒說明書的要求準(zhǔn)備實驗中需用的試劑。ELISA實驗中應(yīng)用蒸餾水或去離子水，自配的緩沖液的PH應(yīng)用pH計進行較正。從冰箱中取出的試驗用試劑應(yīng)待溫度與室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗不需用的部分應(yīng)及時放回冰箱保存。2.加樣 在ELISA實驗中一般有5次加樣步聚，即加標(biāo)準(zhǔn)品、加樣本、加酶標(biāo)記物、加底物、加反應(yīng)終止液。加樣時應(yīng)將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。

加樣時一般用微量加樣器，按規(guī)定的量加入板孔中。每次加標(biāo)本應(yīng)更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染。加酶結(jié)合物應(yīng)用液和底物應(yīng)用液時可用定量多道加液器，使加液過程迅速完成。3.保溫 在ELISA中一般加標(biāo)本和加酶標(biāo)記物后會有一次抗原抗體反應(yīng)。抗原抗體反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為溫育(incubation)。 ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。加入板孔中的標(biāo)本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機會，只有最貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐步平衡的過程，因此需經(jīng)擴散才能達(dá)到反應(yīng)的終點。在其后加入的酶標(biāo)記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此。這就是為什么ELISA反應(yīng)總是需要一定時間的溫育。

溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。為了便于操作目前絕大部分的試劑盒均采用室溫進行溫育反應(yīng)，操作時的室溫應(yīng)嚴(yán)格限制在規(guī)定的范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)室溫溫度是指20-25℃，但具體操作時可根據(jù)說明書的要求控制溫育。室溫溫育時，ELISA板只要平置于操作臺上即可。應(yīng)注意溫育的溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。4.洗滌 洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應(yīng)步驟，但卻也決定著實驗的成敗。ELSIA就是靠洗滌來達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來。可以說在ELISA操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)，應(yīng)引起操作者的高度重視，操作者應(yīng)嚴(yán)格按要求洗滌，不得馬虎。

洗滌的方式除某些ELISA儀器配有特殊的自動洗滌儀外，手工操作主要為浸泡式，過程如下：

a.吸干或甩干孔內(nèi)反應(yīng)液；b.用洗滌液過洗一遍（將洗滌液注滿板孔后，即甩去）；c.浸泡，即將洗滌液注滿板孔，放1-2分鐘，間歇搖動，浸泡時間不可隨意縮短；d.吸干孔內(nèi)液體。吸干應(yīng)徹底，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液體后在清潔毛巾或吸水紙上拍干；e.重復(fù)操作c和d，洗滌3-4次（或按說明規(guī)定）。在間接法中如本底較高，可增加洗滌次數(shù)或延長浸泡時間。5.顯色和比色5.1顯色 顯色是ELISA中的最后一步溫育反應(yīng)，此時酶催化無色的底物生成有色的產(chǎn)物。反應(yīng)的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在定量測定中，加入底物后的反應(yīng)溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。 底物顯色一般在室外溫或37℃反應(yīng)20-30分鐘后即不再加深，約40分鐘將達(dá)到顯色的頂峰，再延長反應(yīng)時間，可使本底值增高。底物液受光照會自行變色，顯色反應(yīng)應(yīng)避光進行，顯色反應(yīng)結(jié)束時加入終止液終止反應(yīng)。產(chǎn)物用各類酸性終止液終止后會使藍(lán)色轉(zhuǎn)變成黃色，此時可用特定的波長（450nm）測讀吸光值。5.2比色 比色前應(yīng)先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀的比色架中。

比色結(jié)果的表達(dá)以往通用光密度（oplicaldensity，OD），現(xiàn)按規(guī)定用吸光度（absorbence，A），兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸收波長寫于A字母的右下角，如TMB的吸收波長為450nm，表示方法為"A450nm"或"OD450nm"。

酶聯(lián)免疫技術(shù)（ELISA）比傳統(tǒng)的檢測技術(shù)具有靈敏度高、特異性好、快速、方法操作簡單、樣品處理量大、使用范圍寬、檢測費用低、易商品化等優(yōu)點。因此可以肯定，酶聯(lián)免疫在食品領(lǐng)域必將得到廣泛的應(yīng)用。ELISA在食品檢測中的應(yīng)用（1）檢測食品中的毒素目前發(fā)現(xiàn)能引起人中毒的霉菌代謝產(chǎn)物至少有150種以上，常見的產(chǎn)毒性真菌有曲霉菌屬、青霉菌屬、鐮刀菌屬等，其中最常見且研究最多的是黃曲霉毒素、超曲霉毒素等。例如有報道利用酶聯(lián)免疫法測定醬油中黃曲霉毒素B1(AFTB1)。過去醬油的AFTB1測定多采用限量法，指標(biāo)僅限于≤5μg/kg。有學(xué)者做了檢測證明，利用酶聯(lián)免疫測定法測定，最低檢出限為0.1ng/ml，如果采用樣品稀釋法排除干擾，稀釋50倍可排除共存物的干擾，按稀釋50倍算，最小檢出物濃度為50ng/ml。（2）檢測食品中的殘留農(nóng)藥在美國已將其作為飲用水的檢測指標(biāo)之一，規(guī)定最大殘留量為0.04mg/l。用酶聯(lián)免疫試劑盒檢測克百威，已有報道最低檢測限為0.01mg/l，線性檢測范圍為0.01～10mg/l，回收率高于90%。用酶聯(lián)免疫法檢測殺蟲劑克百威殘留較常規(guī)的儀器分析具有操作簡便、靈敏度高、特異性強等的優(yōu)點。（3）檢測食品中的微生物目前，傳統(tǒng)的微生物檢測方法仍然是食品中的常用方法，但是存在操作繁瑣、時間長、工作量大等缺點，對大部分微生物來說，用傳統(tǒng)的檢測方法至少要4～5d，有些致病的微生物甚至無法進行人工培養(yǎng)。各類肉品易受多種致病微生物的污染。其中沙門氏菌使人畜共患腸道病原菌和細(xì)菌性食物中毒重要的病原菌。原有的常規(guī)檢測方法，存在操作復(fù)雜、需要特殊的儀器、檢測時間長等弊端。因而開始有學(xué)者開始利用酶聯(lián)免疫吸附檢測法檢測沙門氏菌。該方法比常規(guī)的培養(yǎng)法提前3～4d，不需要特殊的實驗設(shè)備，肉眼即可觀察結(jié)果，且樣品易保存。（4）檢測食品中的其它成分免疫球蛋白指具有抗體活性、能與相應(yīng)的抗原發(fā)生特異性結(jié)合的球蛋白，是構(gòu)成體液免疫的重要物質(zhì)。牛乳中特別是初乳中免疫球蛋白的含量特別高，最近開發(fā)的免疫乳，就是通過對乳牛進行免疫注射從而提高牛乳中免疫球蛋白的含量。因免疫球蛋白也是一種蛋白質(zhì)，具有蛋白質(zhì)的共性，但其在上述制品中的含量又相對較少，常規(guī)的蛋白質(zhì)的測定方法無法測出免疫球蛋白的含量。用酶聯(lián)免疫法即可成功解決這個問題，且同時完成含量與活性的檢測。ELISA在國外研究進展Shearera.L.通過實驗證實了ELISA應(yīng)用于BFDV（一種導(dǎo)致鸚鵡的嘴和羽毛病變的病毒）的檢測中與先前一直應(yīng)用的HI試驗相比，試驗過程（對于樣品的處理等）大為簡化，而且ELISA試驗結(jié)果更加準(zhǔn)確。2008SachaStelzer-Braid在這篇文章中，通過試驗發(fā)現(xiàn)ELISA可以進行抗H5抗體快速檢測以適應(yīng)臨床需要。但同時發(fā)現(xiàn)ELISA在進行H5抗體檢測的過程中會受到H3N2和H1N1的聯(lián)合作用而呈現(xiàn)出假陽性。由于肉類產(chǎn)品在加工過程中摻假行為時有發(fā)生，同時考慮到以下三個方面的原因：首先肉類摻假會使經(jīng)濟波動，其次某些消費者有可能會發(fā)生變態(tài)反應(yīng)，第三宗教的原因。從以上三點出發(fā)，我們就應(yīng)該考慮到一種方法，來鑒定肉的真實性或是可靠性。由于ELISA的快速專一等優(yōu)點，很快使其在這一領(lǐng)域大顯身手。有學(xué)者就對熟肉制品的來源進行了ELISA的分析(Ayaz,Y.,Ayaz,N.D.,&Erol,I.(2006).Detectioninmeatandmeatproductsusingenzyme-linkedimmunosorbentassay.JournalofMuscleFoods,17,214.)同樣在魚類食品深加工的過程中，也存在外形被破壞后無法進行種類識別的問題。而這種問題的存在往往導(dǎo)致一定的商業(yè)欺騙，如將一些不值錢的小魚混充值錢的魚類做成罐頭。因此進行這一方面的研究也是有必要的，而Rehbein等人通過研究證實了ELISA再魚種類的檢測上與PCR技術(shù)比起來要簡單而且有效，更適合于大規(guī)模的生產(chǎn)應(yīng)用。【Rehbein,H.,Sotelo,C.G.,Pe′rez-Mart?′n,R.I.,Chapela-Garrido,M.J.,Hold,G.L.,Russell,V.J.,etal.(2002).Di?erentiationofraworprocessedeelbyPCR-basedtechniques:Restrictionfragmentlengthpolymorphismanalysis(RFLP)andsinglestrandconformationpolymorphismanalysis(SSCP).EuropeanFoodResearchandTechnol-ogy,214,171–177.】在牛奶制備奶酪的過程中摻假的行為會導(dǎo)致諸如變態(tài)反應(yīng)、宗教、道德等方面的問題。比如在以羊奶為原料的高級奶酪的制備過程中，常常有人會用一些山羊奶加上牛奶來冒充原料。而利用ELISA方法的可靠性和敏感性就可以檢測出那些造假的奶酪。Hurley等人就通過ELISA的方法在一些未注明含有牛奶的羊奶和水牛奶中將其檢測出來。【Hurley,I.P.,Coleman,R.C.,Ireland,H.E.,&Williams,J.H.H.(2004).MeasurementofbovineIgGbyindirectcompetitiveELISAasameansofdetectingmilkadulteration.JournalofDairyScience,87,215–221.】果汁造假的現(xiàn)象時有發(fā)生，比如摻水或是摻入一些人造的成分。隨著果汁化學(xué)成分的研究深入，人們逐漸向果汁中加入一些果皮的提取物或是兌入一些廉價的果汁。而為了保證消費者的權(quán)利，杜絕這種現(xiàn)象，就要求有一種安全、快速、可靠的檢測技術(shù)。Sass-Kiss在柚子汁和橘子汁方面的摻假檢驗方面做了深入的研究。【Sass-Kiss,A.,&Sass,M.(2000).Immunoanalyticalmethodforqualitycontroloforangejuiceproducts.JournalofAgriculturalandFoodChemistry,48,4027–4031.Sass-Kiss,A.,&Sass,M.(2002).Distributionofvariouspeptidesincitrusfruits(grapefruit,lemon,andorange).JournalofAgriculturalandFoodChemistry,50,2117–2120.】轉(zhuǎn)基因食品的不確定因素很多，如它或許可能會引起某些人的變態(tài)反應(yīng)，因此在包裝時要進行標(biāo)注。而有些廠家并不在意這一點，這實際上是一種欺騙行為。為了規(guī)范轉(zhuǎn)基因食品的市場，需要一種可靠的檢測手段能夠準(zhǔn)確地檢測出某種食品中是否含有轉(zhuǎn)基因成分。ELISA在一些半成品或是生食中可以做為轉(zhuǎn)基因食品的檢測手段，但是對于完全加工的產(chǎn)品來說，由于轉(zhuǎn)基因表達(dá)出來的蛋白質(zhì)降解，導(dǎo)致ELISA不能夠認(rèn)定該食品是否是轉(zhuǎn)基因食品。而大量的研究也都證實了這一點。【Terry,C.F.,Harris,N.,&Parkes,H.C.(2002).Detectionofgeneticallymodi?edcropsandtheirderivatives:Criticalstepsinsamplepreparationandextraction.JournalofAOACInternational,85,768–774.】【Margarit,E.,Reggiardo,M.I.,Vallejos,R.H.,&Permingeat,H.R.(2006).DetectionofBTtransgenicmaizeinfoodstu?s.FoodResearchInternational,39,250–255.】輻照作為一種是食品加工技術(shù)主要應(yīng)用在殺菌、延長某些蔬菜的貯藏期