PAGE18-基于金屬有機(jī)框架載體的免疫球蛋白G印跡材料的構(gòu)筑及其識(shí)別性能研究從2022年底至今，席卷全球的新型冠狀病毒已給我國(guó)人民造成了巨大的人身傷害和經(jīng)濟(jì)損失.在當(dāng)前病毒依然肆虐之時(shí)，新型冠狀病毒的便捷、精準(zhǔn)檢測(cè)成為我國(guó)公共衛(wèi)生安全保障和社會(huì)經(jīng)濟(jì)復(fù)蘇的關(guān)鍵.血清抗體檢測(cè)具有方便快捷、用時(shí)較短等優(yōu)勢(shì)，是目前核酸檢測(cè)的有效補(bǔ)充手段.然而，在血清檢測(cè)中可對(duì)免疫球蛋白G和免疫球蛋白M抗體進(jìn)行特異性識(shí)別的單克隆抗體，制備過(guò)程繁瑣、價(jià)格昂貴、貯存穩(wěn)定性較差，這些都成為制備廉價(jià)、高效的血清抗體檢測(cè)裝置的阻礙.因此，尋求可替代單克隆抗體的蛋白識(shí)別新材料具有重要意義.分子印跡聚合物(molecularlyimprintedpolymers，MIPs)具有制備簡(jiǎn)單、成本低廉、產(chǎn)品性能穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，成為替代生物抗原-抗體識(shí)別作用的良好選擇[1].MIPs是通過(guò)聚合物中構(gòu)筑與模板分子形狀、大小以及官能團(tuán)具有相互匹配功能的印跡孔穴，來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)特定蛋白的識(shí)別.在分子印跡領(lǐng)域中，以小分子為模板的分子印跡技術(shù)發(fā)展較為成熟，已成功應(yīng)用于生物傳感器、固相萃取、醫(yī)學(xué)診斷等領(lǐng)域[2,3].然而，以蛋白質(zhì)分子為模板的分子印跡技術(shù)，由于模板蛋白龐大的分子體積和復(fù)雜的表面結(jié)構(gòu)，所制備的MIPs的識(shí)別性相對(duì)較低，不利于它的實(shí)際應(yīng)用，怎樣提高蛋白印跡聚合物的識(shí)別性，是目前該領(lǐng)域研究者關(guān)注的關(guān)鍵問(wèn)題.表面印跡策略是在基質(zhì)材料表面進(jìn)行印跡層聚合的方法.此策略的提出保證了模板蛋白的洗脫和傳質(zhì)過(guò)程基本位于或接近于印跡材料的表界面，降低了模板蛋白的傳質(zhì)阻力，因此能有效地提高印跡材料的識(shí)別性[4,5].近些年來(lái)，將模板固定化法與表面印跡技術(shù)結(jié)合的蛋白印跡材料制備策略成為熱點(diǎn).這主要是因?yàn)椋?1)通過(guò)蛋白的固定化，使其位于基質(zhì)材料表面相似位置與高度，因而有利于實(shí)現(xiàn)印跡層厚度與識(shí)別性、模板洗脫能力之間的規(guī)律調(diào)控；(2)通過(guò)調(diào)節(jié)基質(zhì)表面官能團(tuán)種類(lèi)和數(shù)目，可有效增強(qiáng)蛋白的固載量，從而提高M(jìn)IPs中印跡孔穴數(shù)目與識(shí)別性[6,7].例如：西北大學(xué)的陳方方，以醛基功能化的Fe3O4磁性微球?yàn)檩d體，多巴胺為功能單體和交聯(lián)劑，通過(guò)表面印跡技術(shù)與模板固定化相結(jié)合的策略，制備了具有優(yōu)異識(shí)別性(印跡因子4.54)、良好吸附量(最大吸附量70.2mg/g)的人血清白蛋白MIPs[8].然而，上述性能優(yōu)異的載體材料，由于蛋白負(fù)載或接枝印跡層的需求，其制備過(guò)程相對(duì)復(fù)雜.此外，進(jìn)一步提高載體的比表面積也是該策略實(shí)現(xiàn)高性能MIPs構(gòu)筑的關(guān)鍵.金屬有機(jī)框架材料(metalorganicframeworks，MOF)，是一類(lèi)由金屬離子與有機(jī)配體合成的多孔納米材料[9].它具有極大的比表面積和豐富的表面官能團(tuán)，并且制備簡(jiǎn)單、改性方便，是成為模板固定化策略中載體的良好選擇.然而，到目前為止，將MOF作為蛋白固定化載體用于構(gòu)筑高識(shí)別性蛋白印跡材料的報(bào)道依然較少[10,11].此外，與傳統(tǒng)小分子模板相對(duì)單一以及有限個(gè)數(shù)的官能團(tuán)相比，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，表面富含多種性質(zhì)的氨基酸殘基，因而不可避免的能與印跡孔穴之外的材料表面產(chǎn)生作用，造成非特異性吸附，引起MIPs識(shí)別性的降低.怎樣降低MIPs中非印跡區(qū)域與蛋白之間的相互作用是提高其識(shí)別性的有效方法.兩性離子材料是一類(lèi)新型的蛋白“惰性”作用材料，這類(lèi)材料通過(guò)兩性離子官能團(tuán)與水分子的水合作用，在材料表面形成水殼層，有效阻礙了蛋白與材料之間的相互作用[12].利用上述原理，西北工業(yè)大學(xué)張秋禹團(tuán)隊(duì)成功將兩性離子單體，2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽堿(2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine,MPC)引入牛血清白蛋白印跡微球的制備過(guò)程中，獲得非印跡區(qū)域富含“惰性組分”的印跡材料[13].與未加入MPC的印跡微球相比，基于MPC制備的MIPs顯示出對(duì)模板蛋白更加優(yōu)良的識(shí)別能力.本文以免疫球蛋白G(IgG)作為模板分子，以表面修飾雙鍵官能團(tuán)的MOF材料UIO-66作為載體，丙烯酰胺、甲基丙烯酸作為功能單體，磺基甜菜堿甲基丙烯酸酯(SBMA)為兩性離子單體，N,N-亞甲基雙丙烯酰胺作為交聯(lián)劑，采用模板固定化與表面印跡技術(shù)結(jié)合策略，擬構(gòu)筑高性能蛋白印跡材料.利用傅里葉紅外光譜、掃描電子顯微鏡等手段系統(tǒng)地表征了MIPs的化學(xué)結(jié)構(gòu)和物理形貌，并通過(guò)吸附等溫實(shí)驗(yàn)和動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)研究了印跡材料的吸附性能.最后，采用選擇性吸附實(shí)驗(yàn)和競(jìng)爭(zhēng)吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了MIPs對(duì)IgG的選擇性和特異識(shí)別性.1實(shí)驗(yàn)部分1.1主要原料和儀器人免疫球蛋白G(IgG，純度95%，Mw=150kDa，pI=8.0)，辣根過(guò)氧化物酶(HRP，純度98%，Mw=40kDa，pI=7.2)，卵清白蛋白(OVA，純度98%，Mw=45kDa，pI=4.7)，人血清白蛋白(HSA，純度98%，Mw=66kDa，pI=4.8)和細(xì)胞色素C(CytC，純度95%，Mw=10.5kDa，pI=12.5)購(gòu)自Sigma-Aldrich公司.四氯化鋯(ZrCl4)和2-氨基對(duì)苯二甲酸(H2BDC-NH2)，分析純，購(gòu)自上海麥克林生物化學(xué)技術(shù)有限公司；N,N,N,N-四甲基二胺(TEMED，純度98%)、N,N-亞甲基雙丙烯酰胺(MBA，純度98%)、丙烯酰胺(AAm，純度98%)、甲基丙烯酸(AM，純度98%)、過(guò)硫酸銨(APS，純度98%)購(gòu)自國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司；3-二甲基-(甲基丙烯酰氧乙基)丙烷磺酸銨(SBMA，純度99%)和甲基丙烯酸酐(MA，分析純)購(gòu)自上海阿拉丁化學(xué)試劑有限公司；整個(gè)過(guò)程中都使用去離子水；所有其他溶劑和洗脫劑，如N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，氯仿和乙醇至少是分析級(jí)的，無(wú)需進(jìn)一步處理即可使用.傅里葉變換紅外光譜(FTIR)采用Bruker公司所生產(chǎn)的TENSOR27型號(hào)FTIR分光計(jì)來(lái)測(cè)量.X射線光電子能譜(XPS)采用KratosAxisUltraDLD儀器來(lái)測(cè)量樣品的化學(xué)組成.樣品的晶體結(jié)構(gòu)通過(guò)Bruker公司生產(chǎn)的D8Advance型X射線衍射儀(XRD)來(lái)檢測(cè).熱重(TG)表征通過(guò)日立公司的STA200RV型熱重分析儀來(lái)測(cè)試.紫外吸收光譜(UV)通過(guò)紫外分光光度計(jì)(Varian,Cary-1E)來(lái)測(cè)量.材料的動(dòng)態(tài)光散射(DLS)檢測(cè)通過(guò)Malvern公司的ZetasizerNanoZS來(lái)完成，該設(shè)備配備了波長(zhǎng)為633nm的激光，散射角為173°.電子掃描顯微鏡(SEM)的測(cè)試采用Oxford公司生產(chǎn)的IncaOxford型號(hào)電子掃描顯微鏡來(lái)完成.材料的比表面積通過(guò)Micromeritics公司的ASAP2460型氮?dú)馕?解析儀通過(guò)Brunauer-Emmett-Teller(BET)方法來(lái)測(cè)量.采用DYY-6C電泳系統(tǒng)(北京六一儀器廠)進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)檢測(cè).1.2UIO-66的合成與功能化通過(guò)溶劑熱法合成了UIO-66納米粒子[14]，具體實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下：首先，在三頸圓底燒瓶中混合191mgZrCl4、146mgH2BDC-NH2和82mLDMF；然后，在攪拌下加入4.83g乙酸，反應(yīng)體系在25℃下攪拌30min；隨后，將混合物轉(zhuǎn)移到有聚四氟乙烯內(nèi)膽的不銹鋼高壓釜中，將高壓釜放入馬弗爐中于120°C加熱24h；冷卻后，將納米顆粒用DMF和甲醇分別洗滌3次，并在60℃下真空干燥.為了在其表面引入乙烯基官能團(tuán)，將0.60gUIO-66納米粒子進(jìn)一步分散在50mL氯仿中，隨后添加2.46g甲基丙烯酸酐和0.20g三乙胺.將混合物在55℃下攪拌并回流24h后，將產(chǎn)物離心并用氯仿洗滌3次，并在60℃下真空干燥過(guò)夜，獲得乙烯基官能團(tuán)功能化的UIO-66-MA.1.3蛋白印跡材料UIO-66@MIPs的制備將20mg的UIO-66-MA納米顆粒靜置于10mL含濃度為3mg/mLIgG的磷酸鹽緩沖液(pH=7.0，10mmol/L).25℃恒溫震蕩3h后，通過(guò)離心分離納米顆粒，并用去離子水洗滌.隨后，將負(fù)載IgG的UIO-66納米顆粒分散在10mL磷酸鹽緩沖液(pH=7.0，10mmol/L)中，隨后加入35.5mgAAm，34.4mgAM，10mgMBA和一定質(zhì)量的SBMA.將預(yù)聚合溶液在25°C下靜置1h，然后添加20μLTEMED和20mgAPS.反應(yīng)溶液在25℃下將攪拌24h后，將產(chǎn)物離心.在室溫下用0.5mol/L的NaCl溶液和乙酸溶液(6.0vt%)交替洗滌，直至洗脫液無(wú)法在紫外分光光度計(jì)中檢測(cè)到蛋白特征峰強(qiáng)度(280nm).最后，用去離子水洗滌并冷凍干燥后得到UIO-66@MIPs.非印跡材料(UIO-66@NIPs)的制備過(guò)程采用與UIO-66@MIPs相似的流程，但不添加模板蛋白IgG.1.4UIO-66@MIPs的吸附性能研究1.4.1吸附等溫實(shí)驗(yàn)吸附等溫實(shí)驗(yàn)用來(lái)研究UIO-66@MIPs和UIO-66@NIPs對(duì)IgG的飽和吸附量以及印跡效果.具體流程如下：將10mg的吸附材料在25℃下至于20mL不同IgG初始濃度的磷酸緩沖溶液(0.01mol/L，pH=7)中，恒溫振蕩50min.隨后，利用高速離心機(jī)將吸附材料從溶液中進(jìn)行分離，并采用紫外分光光度法(280nm)對(duì)其濃度進(jìn)行檢測(cè).其吸附量可以通過(guò)Q=(c0-ce)V/m來(lái)計(jì)算.其中c0(mg/mL)和ce(mg/mL)分別是IgG溶液的初始和吸附后的濃度，V(mL)是溶液的體積，而m(g)為吸附劑的質(zhì)量.印跡因子(IF)來(lái)衡量MIPs對(duì)模板蛋白質(zhì)識(shí)別能力，其公式為IF=QMIPs/QNIPs.其中QMIPs和QNIPs分別是印跡和非印跡材料對(duì)IgG的吸附量.1.4.2吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)用來(lái)研究印跡和非印跡材料的吸附平衡時(shí)間.具體流程如下：將10mg的吸附材料在25℃下置于20mL、濃度為2.0mg/mLIgG的磷酸緩沖溶液(0.01mol/L，pH=7)中.采用上述相同的檢測(cè)方法，確定吸附材料在不同吸附時(shí)間對(duì)IgG的吸附量.1.4.3選擇性吸附實(shí)驗(yàn)選擇性吸附實(shí)驗(yàn)用來(lái)研究UIO-66@MIPs對(duì)不同蛋白的選擇性.具體流程如下：將10mg的吸附材料在25℃下置于20mL、含濃度為2.0mg/mLIgG或參比蛋白的磷酸緩沖溶液(0.01mol/L，pH=7)中.采用與上述相同的檢測(cè)方法，確定吸附材料在不同吸附時(shí)間內(nèi)對(duì)蛋白的吸附量.利用選擇性因子(β)來(lái)衡量材料對(duì)蛋白的吸附選擇性，其公式為，β=IFtemp/IFana，其中IFtemp和IFana分別是印跡材料對(duì)模板蛋白和參比蛋白的印跡因子.1.4.4競(jìng)爭(zhēng)吸附實(shí)驗(yàn)競(jìng)爭(zhēng)吸附實(shí)驗(yàn)來(lái)研究UIO-66@MIPs和UIO-66@NIPs對(duì)IgG的特異性識(shí)別作用.具體流程如下：將10mg的印跡或非印跡材料置于10mL分別含有2mg/mLIgG和HSA的磷酸緩沖溶液(0.01mol/L，pH=7)中.隨后在25℃下恒溫振蕩50min，并利用高速離心機(jī)將吸附材料從溶液中進(jìn)行分離.將分離后的材料在室溫下采用0.5mol/L的NaCl溶液和乙酸溶液(6.0vt％)交替洗滌，直至洗脫液無(wú)法在紫外分光光度計(jì)中檢測(cè)到蛋白特征峰強(qiáng)度(280nm).收集合并洗脫液，并利用截留分子量量為1000的透析袋進(jìn)行透析，并冷凍干燥產(chǎn)物.隨后將凍干產(chǎn)物溶解在2mL的磷酸緩沖溶液(0.01mol/L，pH=7)中，并采用SDS進(jìn)行檢測(cè).SDS中分離膠和濃縮膠濃度分別為10%的和5%.1.4.5統(tǒng)計(jì)分析對(duì)于吸附等溫實(shí)驗(yàn)、吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)、選擇性吸附實(shí)驗(yàn)以及SBMA用量對(duì)吸附性能影響實(shí)驗(yàn)，這些吸附量數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)表示，每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件重復(fù)2次.使用單向方差分析和隨后的Tukey檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.當(dāng)p值小于0.05時(shí)，2組之間的差異被認(rèn)為是顯著的.2結(jié)果與討論2.1UIO-66@MIPs的設(shè)計(jì)本文以UIO-66為載體，AM、AAm和兩性離子單體SBMA作為功能單體組，MBA作為交聯(lián)劑，通過(guò)表面印跡技術(shù)結(jié)合蛋白固定化策略的方法，用于構(gòu)筑高性能IgG印跡材料(UIO-66@MIPs)，如圖1所示.由于UIO-66材料自身極高的比表面積、表面豐富的氨基官能團(tuán)、苯環(huán)結(jié)構(gòu)以及不飽和的鋯離子，應(yīng)能夠通過(guò)氫鍵、靜電、π-π堆疊等作用，對(duì)IgG產(chǎn)生優(yōu)異的固載量.因而，由大量負(fù)載IgG的MOF而制備的聚合物材料，在IgG洗脫后，將形成眾多的、與模板蛋白在形狀、大小以及官能團(tuán)相互匹配的印跡孔穴，最終有利于MIPs在吸附量和識(shí)別性的高性能表現(xiàn).此外，將兩性離子單體(SBMA)引入到印跡層的構(gòu)筑過(guò)程中，理論上能有效減少印跡材料對(duì)蛋白質(zhì)的非特異性吸附.Fig.1SchematicillustrationofthepreparationofUIO-66@MIPs.2.2UIO-66@MIPs的化學(xué)結(jié)構(gòu)表征通過(guò)FTIR表征了所制備材料的化學(xué)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖2(a)所示.在原始UIO-66的譜圖中，位于3452，3345，1255和766cm-1的峰分別對(duì)應(yīng)于UIO-66中氨基(―NH2)的對(duì)稱和反對(duì)稱伸縮振動(dòng)，碳氮鍵(Car―N)伸縮振動(dòng)以及N－H的擺動(dòng)振動(dòng)[15].而在1669和1504cm-1位置處的特征峰為羰基的不對(duì)稱和對(duì)稱伸縮振動(dòng).與原始UIO-66相比，UIO-66-MA光譜圖在1664cm-1處的峰強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，這應(yīng)該是甲基丙烯酸酐改性所引起的[16].此外，UIO-66@MIPs的紅外光譜圖除了具備上述特征峰之外，在1042cm-1處出現(xiàn)了新的特征峰，它對(duì)應(yīng)于兩性離子官能團(tuán)中SO3-的伸縮振動(dòng)[17].Fig.2FTIRspectra(a),XPSspectra(b),TGAcurves(c)andXRDpatterns(d)ofUIO-66,UIO-66-MA,andUIO-66@MIPs.采用XPS來(lái)表征所制備材料的元素組成，結(jié)果顯示于圖2(b).可以發(fā)現(xiàn)，原始UIO-66和UIO-66-MA在398.54eV和182.38，329.56，343.22，429.92eV位置處，分別為N元素和Zr元素的結(jié)合能[18].在UIO-66-MA表面進(jìn)行聚合后，UIO-66@MIPs在167.81eV處出現(xiàn)了S元素的特征峰，證明了兩性離子官能團(tuán)的存在.此外，從TGA分析結(jié)果(圖2(c))也可以發(fā)現(xiàn)，印跡材料比UIO-66和UIO-66-MA在100~600℃范圍內(nèi)具有更大的熱失重，這應(yīng)該是上述材料表面含有聚合物層的原因所致.另外，XRD分析結(jié)果(圖2(d))也表明UIO-66@MIPs在2θ=7.34°，8.48°處，存在與UIO-66和UIO-66-MA晶體一致的特征峰[18].因而，上述表征的綜合結(jié)果可以說(shuō)明UIO-66@MIPs已被成功制備.2.3UIO-66@MIPs的形貌和物理性質(zhì)表征SEM和DLS分別用于材料的形貌和粒徑的表征.如圖3(a)和3(b)所示，UIO-66和UIO-66-MA晶體呈現(xiàn)出規(guī)則的正八面體形狀，并且結(jié)合圖4(a)中DLS結(jié)果發(fā)現(xiàn)，它們的平均粒徑尺寸為143和138nm.此外，不論從SEM圖還是DLS圖結(jié)果都說(shuō)明，UIO-66和UIO-66-MA具有極好的單分散性.與之相比，UIO-66@MIPs和UIO-66@NIPs的SEM圖(圖3(c)和3(d))顯示出UIO-66被新的物質(zhì)包覆，并且材料顯示出明顯的團(tuán)聚現(xiàn)象.這一現(xiàn)象也與DLS結(jié)果(圖4(a))一致.這可能是UIO-66極大的比表面積和極高的表面能，使其在后續(xù)印跡過(guò)程中發(fā)生了嚴(yán)重的團(tuán)聚現(xiàn)象所致.Fig.3SEMimagesofUIO-66(a),UIO-66-MA(b),UIO-66@MIPs(c)andUIO-66@NIPs(d).Fig.4DLS(a)andN2adsorption-desorptionisotherms(b)ofUIO-66,UIO-66-MA,UIO-66@MIPsandUIO-66@NIPs.為了進(jìn)一步研究所制備材料的孔結(jié)構(gòu)和比表面積，所制備的材料用于氮?dú)馕?脫附等溫實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖4(b)和表1所示.從圖中可以發(fā)現(xiàn)，含UIO-66晶體的4種材料都呈現(xiàn)出典型的I型吸附脫附等溫曲線，說(shuō)明了它們含有微孔結(jié)構(gòu)[19].Table1Propertiesofsyntheticmaterials.MaterialSpecificsurfacearea(BETa)(m2/g)Averageporesize(nm)Porevolume(cm3/g)UIO-66648.32.1320.344UIO-66-MA627.92.1180.328UIO-66@MIPs362.52.8090.267UIO-66@NIPs357.92.9840.251aBrunauer-Emmett-Tellermethod.此外，相應(yīng)BET、平均孔徑和孔隙體積數(shù)據(jù)如表1所示，原始UIO-66和UIO-66-MA能夠顯示出優(yōu)異的比表面積648.3和627.9m2/g，并且它們的平均孔徑為2.132和2.118nm，說(shuō)明lgG蛋白與UIO-66晶體的結(jié)合應(yīng)該發(fā)生在材料表面.此外，UIO-66@MIPs和UIO-66@NIPs的比表面積和孔體積與UIO-66和UIO-66-MA相比明顯降低，這也與上述SEM表征結(jié)果相符.盡管這樣，印跡和非印跡材料的比表面積依然達(dá)到較高的362.5和357.9m2/g，這對(duì)于它們高效分離目標(biāo)蛋白具有積極作用.2.4兩性離子單體用量對(duì)UIO-66@MIPs識(shí)別性的影響本文將兩性離子單體SBMA用于MIPs的制備，以降低該材料對(duì)蛋白的非特異性結(jié)合.因此，SBMA用量對(duì)UIO-66@MIPs吸附量和識(shí)別性的影響被進(jìn)一步探究.如圖5所示，不加入SBMA的MIPs對(duì)IgG的吸附量可達(dá)到306.9mg/g，明顯優(yōu)于之前報(bào)道的IgG印跡凍膠55.1和106.1mg/g的最大吸附量[20,21].這應(yīng)該歸因于UIO-66載體極大的比表面積，使得所制備的UIO-66@MIPs具有更多的作用位點(diǎn)所致.然而，在不加入SBMA的情況下，UIO-66@NIPs亦能對(duì)IgG產(chǎn)生較大的吸附量，因而，該制備條件下的UIO-66@MIPs印跡因子只有1.63.隨著SBMA用量的增加，MIPs和NIPs的吸附量逐漸降低，這應(yīng)該是由于兩性離子官能團(tuán)的存在可以通過(guò)溶劑化作用和氫鍵形成水殼層，因此減弱了吸附劑與蛋白之間的相互作用.此外，可以發(fā)現(xiàn)隨著SBMA用量的增加，所制備MIPs的識(shí)別性出現(xiàn)先增加后降低的現(xiàn)象.這可能是因?yàn)楫?dāng)?shù)鞍住岸栊浴弊饔脝误wSBMA用量較低時(shí)，它不能像其他功能單體一樣通過(guò)靜電、氫鍵等作用與模板蛋白進(jìn)行結(jié)合.因而，MIPs中的兩性離子基團(tuán)主要分布在印跡孔穴之外的材料區(qū)域，降低了其對(duì)蛋白的非特異性吸附，提高了識(shí)別性[12,13].進(jìn)一步增加SBMA用量，可能導(dǎo)致它會(huì)同時(shí)參與到印跡孔穴和孔穴之外的區(qū)域構(gòu)筑，因此降低印跡孔穴對(duì)模板蛋白的結(jié)合，最終可能會(huì)減弱UIO-66@MIPs的識(shí)別能力[22,23].為了獲得最佳的識(shí)別性，占功能單體總質(zhì)量20%的SBMA用量成為制備UIO-66@MIPs的最優(yōu)條件.Fig.5EffectofSBMAdosageonadsorptioncapacityandrecognitionofUIO-66@MIPs.TheconcentrationofIgGis2.0mg/mL,andadsorptiontimeis50min.Significance:ns≡notsignificant(p≥0.05),*≡significant(p0.05).2.5UIO-66@MIPs吸附性能表征吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)用來(lái)研究吸附時(shí)間對(duì)MIPs和NIPs吸附性能的影響.如圖6(a)所示，在初始40min內(nèi)，UIO-66@MIPs對(duì)2.0mg/mLIgG溶液的吸附量明顯高于UIO-66@NIPs，說(shuō)明UIO-66@MIPs與IgG之間作用力更強(qiáng).這應(yīng)該是印跡材料中形成了與模板分子在形狀和大小相互匹配的印跡孔穴所致.在吸附40min后，UIO-66@MIPs和UIO-66@NIPs的吸附速率逐漸降低，最終在50min左右達(dá)到吸附平衡.UIO-66@MIPs較快的吸附平衡時(shí)間可能是由于本工作中采用了表面印跡技術(shù)，降低了蛋白在聚合物層的傳質(zhì)阻力所致.因此，本文后續(xù)的吸附實(shí)驗(yàn)采用50min作為最佳吸附實(shí)驗(yàn)條件.Fig.6Adsorptionkinetics(a)andisothermcurves(b)ofUIO-66@MIPsandUIO-66@NIPs.Significance:ns≡notsignificant(p≥0.05),*≡significant(p0.05).吸附等溫實(shí)驗(yàn)用來(lái)研究UIO-66@MIPs和UIO-66@NIPs的吸附量隨IgG初始濃度變化的影響.如圖6(b)所示，2種材料的吸附量隨著蛋白濃度的增加而增大.并且UIO-66@MIPs和UIO-66@NIPs分別在1.5和2.0mg/mL分別達(dá)到飽和吸附.此外，UIO-66@MIPs的飽和吸附量(217.4mg/g)明顯高于UIO-66@NIPs的值(87.6mg/g)，印跡因子IF可達(dá)2.48.這進(jìn)一步證明UIO-66@MIPs中存在對(duì)IgG具有識(shí)別作用的印跡孔穴.因此，為了更好地對(duì)比印跡和非印跡材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，本工作中后續(xù)吸附實(shí)驗(yàn)的IgG濃度選為2.0mg/mL.為了研究上述MIPs和NIPs對(duì)IgG的吸附機(jī)理，本工作分別采用Langmuir吸附模型和Freundlich吸附模型對(duì)吸附等溫曲線進(jìn)行擬合.Langmuir吸附模型描述的是在吸附劑表面形成飽和單分子層的過(guò)程，而Freundlich吸附模型通常用于模擬非均相吸附劑表面的吸附現(xiàn)象.Langmuir吸附模型公式為ce/Qe=1/KLQm+ce/Qm，KL是親合常數(shù)，而是Qm理論最大吸附量.Freundlich吸附模型公式為InQe=InKf+(1/n)InCe，Kf和1/n分別是與Freundlich模型擬合相關(guān)的吸附量和吸附強(qiáng)度.擬合結(jié)果如表2所示.可以發(fā)現(xiàn)，印跡和非印跡材料對(duì)Langmuir吸附模型擬合的R2均大于Freundlich吸附模型，說(shuō)明UIO-66@MIPs和UIO-66@NIPs對(duì)IgG的吸附行為應(yīng)是以單分子層吸附為主.此外，可以看到UIO-66@MIPs對(duì)IgG的親合常數(shù)KL與理論最大吸附量Qm都明顯高于UIO-66@NIPs，這進(jìn)一步證明印跡材料中存在眾多的、能夠與IgG相互匹配的印跡孔穴，能夠?qū)崿F(xiàn)它對(duì)模板蛋白的吸附識(shí)別.Table2TheoreticaladsorptionconstantfromtheLangmuirandFreundlichmodel.SampleLangmuirmodelFreundlichmodelKL(mL/mg)Qm(mg/g)R2KF(L/mg)n-1R2UIO-66@MIPs1.43333.30.984195.90.6450.971UIO-66@NIPs0.81144.90.99361.90.7290.9802.6UIO-66@MIPs的選擇吸附性能研究UIO-66@MIPs的選擇吸附性能可以通過(guò)它們對(duì)模板蛋白和參比蛋白的比較來(lái)獲得.本文以不同分子量和等電點(diǎn)的HRP(Mw=40kDa，pI=7.2)，OVA(Mw=45kDa，pI=4.7)，HSA(Mw=66kDa，pI=4.8)和CytC(Mw=10.5kDa，pI=12.5)分別作為參比蛋白.如圖7所示，UIO-66@MIPs對(duì)模板蛋白IgG的印跡因子IF值遠(yuǎn)高于對(duì)其他蛋白，再次說(shuō)明了MIPs中存在與IgG大小和官能團(tuán)相