..中國海洋大學實驗報告姓名：常天易系年級：海洋生命學院2012級專業：生物科學科目：分子細胞生物學實驗學號：一、實驗目的：、通過對植物葉綠體的分離,了解細胞器分離的一般原理和方法、觀察葉綠體的間接熒光,并了解熒光顯微鏡的使用方法二、實驗原理顆粒在離心場中的沉降速率取決于顆粒的大小、形狀和密度,也同離心力以及懸浮介質的黏度有關。在一定的離心場中,同一時間內,密度和大小不同的顆粒其沉降速率不同,一次增加離心力和離心時間,就能使非均一懸浮液中的顆粒按其大小。密度的先后分批沉降在離心管的底部分批收集,即可獲得各個亞細胞的組分。葉綠體的分離應該在等滲溶液中進行,以免滲透壓影響葉綠體,對其造成損傷。在熒光顯微鏡下可以觀察葉綠體的自發熒光和間接熒光。三、實驗材料新鮮菠菜。等滲溶液：0.35mol/L氯化鈉溶液,試劑：0.01%吖啶橙<acridineorange>四、實驗方法１、葉綠體的分離選取新鮮的菠菜葉30.0g,放入150ml的等滲溶液中,在組織搗碎機中搗碎3min選取新鮮的菠菜葉30.0g,放入150ml的等滲溶液中,在組織搗碎機中搗碎3min取6層紗布將溶液過濾于燒杯中,取濾液4ml在1000r/min下離心2min棄去沉淀取6層紗布將溶液過濾于燒杯中,取濾液4ml在1000r/min下離心2min棄去沉淀將上清液在3000/min中離心5min,棄去上清液,沉淀即是所需的葉綠體將上清液在3000/min中離心5min,棄去上清液,沉淀即是所需的葉綠體將沉淀用等滲溶液懸浮將沉淀用等滲溶液懸浮2、菠菜葉手撕片的制備①、下表皮因海綿組織較疏松,可以直接手撕下表皮的薄膜在顯微鏡下觀察。②、上表皮因柵欄組織較致密,可以用刀片將下表皮刮掉,在顯微鏡下觀察上表皮的細胞和氣孔。3、菠菜的葉綠體的觀察在普通光學顯微鏡下,將制得的手撕片放在載玻片的等滲溶液中,游離的葉綠體懸濁液點在在載玻片上,輕輕地蓋上蓋玻片〔防止氣泡產生,即可觀察。在熒光顯微鏡下,將游離葉綠體懸濁液的的標本放在熒光顯微鏡下,先后用綠光、藍光對其進行照射,在電腦上觀察其產生的自發熒光。向手撕片的標本、游離葉綠體懸濁液的的標本中加入1-2滴0.01%吖啶橙染液,先后用綠光、藍光對其進行照射,在電腦上觀察其產生的間接熒光。五、實驗結果氣孔氣孔保衛細胞葉綠體圖圖1菠菜手撕片的標本中,上表皮及其氣孔游離葉綠體保衛細胞游離葉綠體保衛細胞表皮細胞表皮細胞圖2菠菜手撕片的標本中,下表皮及其氣孔氣孔氣孔葉肉細胞葉肉細胞游離葉綠體游離葉綠體圖3葉表皮在綠光照射下的間接熒光游離葉綠體表皮細胞氣孔保衛細胞游離葉綠體表皮細胞氣孔保衛細胞圖4葉表皮在藍光照射下的間接熒光圖6游離葉綠體在綠光照射下的間接熒光圖5游離葉綠體在藍光照射下的間接熒光圖6游離葉綠體在綠光照射下的間接熒光圖5游離葉綠體在藍光照射下的間接熒光討論本實驗證明,在1000r/min離心2min,棄去沉淀上清液在3000r/min下離心5min,棄去上清液的差速離心,沉淀含有葉綠體,混有部分細胞核。在藍光照射下發出的間接熒光可見到細胞核物質發出的綠色熒光?！矆D5在制備菠菜葉手撕片時,由于下表皮上方的海綿組織較為疏松,所以可以較容易地制得下表皮的手撕片；上表皮下方的柵欄組著較為致密,所以可以通過從下表皮輕輕地掛掉下表皮和葉肉的方法來制備上表皮的手撕片。在對上下表皮的對比中可以發現,上表皮的氣孔比下表皮的氣孔更少,上表皮的細胞間隙比下表皮的細胞間隙更狹窄；其原因可能是上防止上表皮的水分蒸發過于強烈,以保水。菠菜是雙子葉植物,其保衛細胞呈腎形,明顯內壁薄,外壁厚,保衛細胞中含有葉綠體,支持淀粉——糖變化學說和蘋果酸生成學說。在對菠菜手撕片標本在綠光照射下發出的間接熒光進行觀察,葉片的背景顏色呈現紅色,葉綠體處紅色最深,可以較為清晰的顯示出葉綠體的位置；同時說明葉片中還有其他物質在綠光的照射下發出紅色的熒光〔圖3。在對菠菜手撕片標本在藍光照射下發出的間接熒光進行觀察,葉片的背景顏色呈現綠色,部分呈現紅色,不能清晰的顯示葉綠體的位置。這可能是由于細胞中的核物質在藍光的照射下造成了綠色的背景〔圖4。７、在綠光照射下游離葉綠體的自發熒光呈紅色,觀察到的葉綠體數目較多〔圖3,藍光照射下葉綠體的自發熒光也呈紅色,觀察到的葉綠體數目較少〔圖5。８、游離的葉綠體在綠光照射下的間接熒光呈現紅色。９、游離的葉綠體在藍光照射下下的間接熒光呈現紅色,有部分綠色是細胞核物質在藍光照射下發出的。顯示的葉綠體數目比在藍光照射下的自發熒光顯示的數目多。１０、綜上比較,游離的葉綠體由藍光照射發出的間接熒光的顏色強度比手撕片中葉綠體由藍光照射發出的間接熒光的顏色強度強,游離的葉綠體由綠光照射發出的間接熒光的顏色強度和手撕片中葉綠體在由綠光照射發出的間接熒光的顏色強度差距不大；葉綠體在綠光照射下的熒光顏色強度比同樣標本藍光照射下的熒光顏色強度強；葉綠體在藍光照射下的間接熒光強度比葉綠體在藍光照射下的自發熒光強度強；葉綠體在綠光照射下的間接熒光強度比葉綠體在綠光照射下的自發熒光強度稍強。七、作業1.在熒光顯微鏡下,觀察葉綠體的自發熒光時,更換濾鏡系統,葉綠體的顏色是否有變化？答：實驗觀察到,在觀察葉綠體自發熒光時,在不同的光的照射下,葉綠體的自發熒光波長沒有明顯的變化,因為葉綠體在吸收相應波長的光達到激發態時只會發射出一定波長的光。綠光為葉綠體的最適激發波段。在藍光的照射下,葉綠體的自發熒光的顏色強度明顯低于在綠光照射下的葉綠體自發熒光的顏色強度。實驗中濾鏡的作用是吸收對人眼會造成危害的光線。2.游離葉綠體和整體細胞內的葉綠體,在熒光顯微鏡下,其顏色和強度有無差異？為什么？答：有。游離葉綠體在藍光照射下發出的間接熒光顏色比整體細胞在藍光照射下發出的間接熒光顏色要深,因為游離葉綠體進行光合作用積累了大量的胞內物質其中大多沒有被及時利用,因此其中