本科生畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）中文題目萊茵衣藻突變體對(duì)酸性環(huán)境的耐受性評(píng)價(jià)英文題目EvaluationofToleranceofChlamydomonasreinhardtiiMutanttoAcidicEnvironment學(xué)生姓名班級(jí)821305學(xué)號(hào)學(xué)院植物科學(xué)學(xué)院專(zhuān)業(yè)生物技術(shù)（植物）指導(dǎo)教師職稱(chēng)講師目錄TOC\o"1-3"\h\u中文摘要 前言第一節(jié)萊茵衣藻1.1萊茵衣藻簡(jiǎn)介萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)是一種單細(xì)胞光合真核藻類(lèi)，屬于綠藻門(mén)團(tuán)藻目衣藻科．它與酵母有許多共同之處，如生長(zhǎng)速度快且周期短；既可在固體平板培養(yǎng)基上形成單克隆，也可進(jìn)行液體培養(yǎng);衣藻具有核染色體、葉綠體和線粒體等3套基因組，而且這3套基因組都能進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化[1]。作為單細(xì)胞真核綠藻，萊因衣藻具有生長(zhǎng)周期短，生長(zhǎng)迅速快，光合效率高等特點(diǎn)，萊茵衣藻目前被認(rèn)為是具有廣泛應(yīng)用前景的轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器，至今已有多種外源基因在萊茵衣藻細(xì)胞核和葉綠體中獲得成功表達(dá)。然而，迄今為止，只有酵母(Saccharomycescerevisiae)線粒體遺傳系統(tǒng)能夠進(jìn)行穩(wěn)定的外源基因表達(dá)，在高等動(dòng)物和植物線粒體遺傳轉(zhuǎn)化中，只有體外離體線粒體轉(zhuǎn)化的報(bào)告。萊茵衣藻是唯一可以進(jìn)行細(xì)胞線粒體遺傳轉(zhuǎn)化的光合生物[2]。ＲandolpH-Anderson等最早報(bào)道了萊茵衣藻線粒體遺傳轉(zhuǎn)化，他們用野生型萊茵衣藻和野生型史密斯衣藻的完整mtDNA，成功轉(zhuǎn)化了呼吸缺陷型萊茵衣藻dum-1突變株，得到能夠完全修復(fù)突變株呼吸缺陷的轉(zhuǎn)基因藻[3~4]。1.2真核藻類(lèi)與綠藻門(mén)簡(jiǎn)介真核藻類(lèi)為一群沒(méi)有根、莖、葉分化，能進(jìn)行光合作用的低等自養(yǎng)真核植物，大約出現(xiàn)于15億～14億年前。形態(tài)包括單細(xì)胞、各式群體、絲狀體、葉狀體、管狀體等。大小從幾微米到幾米（海帶），甚至百米（巨藻）結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，無(wú)明顯組織分化[5~6]。綠藻門(mén)約有8600種，為藻類(lèi)最大一門(mén)[7]。藻體有單細(xì)胞、群體、絲狀體、葉狀體、管狀多核體等各種類(lèi)型。細(xì)胞壁由纖維素構(gòu)成。細(xì)胞內(nèi)各有一定形態(tài)的葉綠素，如杯狀、環(huán)狀、星狀、網(wǎng)狀等；葉綠體中含有和高等植物一樣的葉綠素a、b、胡蘿卜素和葉黃素，故植物呈綠色[8~9]。葉綠體中有一至多個(gè)蛋白核。貯藏的養(yǎng)料主要是淀粉，也有脂類(lèi)。生殖方式多樣，無(wú)性和有性生殖都很普遍，不少種類(lèi)有世代交替現(xiàn)象。少數(shù)種類(lèi)的營(yíng)養(yǎng)體和多數(shù)種類(lèi)的孢子或配子多具2條或4條頂生等長(zhǎng)的鞭毛，少數(shù)1、8或多條，尾鞭型。分布很廣，但大多產(chǎn)于淡水，少數(shù)分布于潮濕土表或海產(chǎn)。一般可分為2綱：綠藻綱ChloropHyceae和接合藻綱ConjugatopHyceae。常見(jiàn)如團(tuán)藻屬Volvox、衣藻屬Chlamydomonas、水綿屬Spirogyra、小球藻屬Chlorella、實(shí)球藻屬Pandorina等。[10~11]1.3與萊茵衣藻相關(guān)的研究1.3.1萊茵衣藻去除污水中氮磷的研究萊茵衣藻對(duì)氮磷的去除率在初始氮磷濃度分別低于55mg·L-1和7mg·L-1時(shí)接近100%,但初始氨氮濃度進(jìn)一步升高至75mg·L-1以上時(shí)會(huì)導(dǎo)致氨氮去除率急劇下降至50%。當(dāng)?shù)妆葹?:1和10:1時(shí),衣藻在3d內(nèi)完全吸收水體中的氨氮,而當(dāng)?shù)妆葹?5:1時(shí)則需要6d；3種氮磷比下衣藻基本上4d內(nèi)能完全去除水體中的磷。2種光照條件下(L/D為24h:0h和12h:12h)衣藻對(duì)氮磷的去除率都能達(dá)到100%,但L/D為24h:0h時(shí)的去除速率更快.衣藻去除氮磷的最適pH范圍為6～7。藻細(xì)胞固定化后對(duì)氨氮的去除能力顯著提高,在初始氨氮濃度為75mg·L-1時(shí)去除率由游離細(xì)胞的50%提高到100%；對(duì)磷的去除率不變,但速率有所減慢。[12]1.3.2萊茵衣藻在遺傳轉(zhuǎn)化方面的研究萊茵衣藻的遺傳轉(zhuǎn)化為獲得大量突變體,并分離導(dǎo)致突變的基因以及研究其功能等提供了很有效的手段。電擊轉(zhuǎn)化法是萊茵衣藻遺傳轉(zhuǎn)化的有效方法之一。用BIO-RAD165-2110型電擊儀對(duì)萊茵衣藻進(jìn)行多次電擊轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示,其最佳電壓值為900V。用藻類(lèi)生產(chǎn)藥用蛋白是基因工程中的一個(gè)重要領(lǐng)域。[13]1.3.3萊茵衣藻鞭毛結(jié)構(gòu)的研究使用帶有巴龍霉素(Paromomycin)抗性的基因片段隨機(jī)插入衣藻細(xì)胞基因組中,通過(guò)性狀篩選和基因序列分析獲得與CrPP2C(Chlamydomonasreinhardtiitype2CproteinpHospHatase)基因相關(guān)的鞭毛異常突變體,根據(jù)突變體基本生物學(xué)性狀和生化分析對(duì)CrPP2C基因的功能進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)CrPP2C基因的破壞導(dǎo)致鞭毛過(guò)渡區(qū)結(jié)構(gòu)缺失,影響鞭毛組裝過(guò)程,不組裝鞭毛或組裝短鞭毛。[14]第二節(jié)水體酸化對(duì)藻類(lèi)生長(zhǎng)的影響目前，隨著工業(yè)等CO2氣體排放量的提高，水體酸化已成為當(dāng)今世界廣為關(guān)注的環(huán)境問(wèn)題之一，除無(wú)機(jī)酸外，有機(jī)酸也是引起環(huán)境酸化的重要原因，其中乙酸是有機(jī)酸的主要成分，廣泛存在于自然界中，其含量可高達(dá)毫摩爾水平，對(duì)藻類(lèi)植物的生長(zhǎng)具有巨大的潛在威脅。[15]第一章萊茵衣藻酸化突變體庫(kù)的建立第一節(jié)相關(guān)材料1.1實(shí)驗(yàn)材料藻株：萊茵衣藻野生型21gr細(xì)胞株系（由清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院潘俊敏教授惠贈(zèng)）。1.2相關(guān)試劑CTAB、RNA降解酶（RNaseA）、氯化鈉等、電泳相關(guān)試劑、實(shí)驗(yàn)室常用抗生素如：頭孢霉素（Cefotaxime）、鏈霉素（Streptomycin）、氨芐青霉素（Ampicillin）、四環(huán)素（Tetracycline）、氯霉素（ChlorampHenicol）、利福平（Rifampicin）等（羅氏公司）；Marker（DL2000，1kb）等分子克隆試劑均購(gòu)自生工大連公司。相應(yīng)載體：pSI103質(zhì)粒，含有巴龍霉素抗性，可以由KpnⅠ線性化。1.3實(shí)驗(yàn)儀器：移液器（Finnpipette），超凈工作臺(tái) （AIRTHEC）,離心機(jī)(Thermo)，PCR擴(kuò)增儀（BIOER），電泳儀（君意），pH計(jì)（儀電科學(xué)儀器）,水平電泳槽 (君意),分光光度計(jì),海爾冰箱,相機(jī)(Canon),微波爐(格蘭仕),旋渦混合器(北京鼎國(guó)),生物安全柜(AIRTECH)，-80℃低溫冰箱（SANYO），恒溫水浴鍋（浙江寧波江南儀器廠），電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器），恒溫振蕩培養(yǎng)箱（CRYSTAL），凝膠成像儀（君意），光照培養(yǎng)箱（浙江寧波賽福儀器廠），壓力蒸汽滅菌鍋（LDZX-75KBS）,分析電子天平(EEA),往復(fù)式脫色搖床(TS.B-108),磁力加熱攪拌器(江南儀器廠)。第二節(jié)實(shí)驗(yàn)方法2.1基因組DNA提取先將培養(yǎng)了7天左右，生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)后期的萊茵衣藻藻液在4℃下放置一天，再提取萊茵衣藻的總DNA。2.1.1萊茵衣藻DNA基因組的小量提?。–TAB法）（1）將于-4℃中放置的萊茵衣藻藻液收集在1.5ml的離心管中，然后進(jìn)行離心，轉(zhuǎn)速為13300rpm，離心8-10min，棄上清，得到萊茵衣藻的藻材料，可重復(fù)上述步驟以提高濃度。（2）向萊茵衣藻的藻材料中加入800μl提取緩沖液CTAB（提前65℃中預(yù)熱），并加入12μl的β-巰基乙醇，用槍頭吸打混勻之后轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，并在65℃的水浴鍋中加熱45min-60min，加熱期間每隔8-10min輕輕搖晃離心管一次。（3）將在65℃水浴鍋中的萊茵衣藻藻液取出后，吸取大約700μl的藻液于新的離心管中，然后再加入700μl的氯仿/異戊醇(體積比為24:1)的抽提液，然后將其混勻，上下顛倒20-30次，然后將其離心，設(shè)置轉(zhuǎn)速為13300rpm，離心8-10min。（4）緩慢地吸取上清液550μl，將其小心地轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管中，并在37℃水浴鍋中保溫30min。（5）將水浴的EP管取出后，再加入550μl的氯仿/異戊醇抽提液，混合均勻，然后將離心管置于離心機(jī)進(jìn)行離心，設(shè)置轉(zhuǎn)速為13300rpm，離心8-10分鐘。（6）緩慢地吸取上清液，再次將其小心的轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管中，加入480μl的異丙醇，室溫放置10min，目的是為了讓DNA充分沉淀，然后將離心管置于離心機(jī)，設(shè)置轉(zhuǎn)速為13300rpm，離心8-10min。（7）棄掉上清液，加入2倍體積事先已經(jīng)預(yù)冷的無(wú)水乙醇，輕輕地緩慢地上下?lián)u動(dòng)1.5ml離心管，達(dá)到洗滌萊茵衣藻DNA沉淀的目的，放置5分鐘后，然后將離心管置于離心機(jī)，設(shè)置轉(zhuǎn)速為13300rpm，離心8-10min。（8）棄掉上清液，加入1ml的事先預(yù)冷70%的乙醇溶液，然后將離心管置于離心機(jī)，設(shè)置轉(zhuǎn)速為13300rpm，離心4-5min。（9）棄掉上清液，12500rpm，空甩1min，然后用移液器小心吸取出殘余的液體，放于超凈工作臺(tái)里風(fēng)干。（10）加入30μl含有RNase的ddH2O，溶解得到的DNA沉淀，置于-20℃保存。實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：（1）恒溫水浴鍋事先加熱至65℃；（2）無(wú)水乙醇和70%乙醇應(yīng)該提前放在-20℃冰箱預(yù)冷；（3）配制含RNA酶的ddH2O（5μlRNA酶與995μl的ddH2O混勻）。2.1.2CTAB提取緩沖液的配制1、1MTris-HCl配制方法（500ml的配制量）1）用天平稱(chēng)取60.55gTris置于500ml燒杯中。2）往三角瓶中加入一部分去離子水（大約400ml），用磁力攪拌器充分溶解。3）加入適量的濃鹽酸調(diào)節(jié)所需要的pH值。pH值濃鹽酸（ml）7.4357.6308.0214）將溶液用ddH2O定容到500ml。5）121℃滅菌20min后，放置于室溫保存。2、5MNaCl的配制方法（500ml的配制量）1）用天平稱(chēng)取146.1g的氯化鈉放置于500ml的燒杯中，加入一部分的ddH2O（大約400ml）后用磁力攪拌器充分溶解。2）再次添加ddH2O將溶液定容到500ml后，適量分裝在小瓶中。3）121℃滅菌20min后，4℃保存。3、0.5MEDTA的配制方法（500ml的配制量）1）稱(chēng)取93.05g的Na2EDTA·2H2O，放置于500ml燒杯中。2）加入大約400mL的ddH2O，用磁力攪拌器充分溶解。3）使用NaOH調(diào)節(jié)pH值到8.0（大約20gNaOH）（注意：pH值得到8.0的時(shí)候EDTA才能夠完全溶解）4）加入達(dá)到H2O將溶液定容至500ml。5）適量分裝，進(jìn)行滅菌處理。6放置于室溫中保存。二、CTAB緩沖液的配制方法CTAB緩沖液500mL終濃度Tris-HCl（1mol/LpH8.0）100mmol/L50mlNaCl（5mol/L)140ml1.4mol/LEDTA（0.5mol/LpH8.0）20ml20mmol/LCTAB10g2%(w/v)添加ddH2O將溶液定容到500ml，使用磁力攪拌器混合均勻，充分溶解。高溫高壓滅菌后，室溫保存。2.1.3萊茵衣藻DNA的檢測(cè)瓊脂糖凝膠電泳1）用1×TAE溶液配制的1%的瓊脂糖凝膠緩沖液30ml。2）在微波爐中加熱至所有微粒融化（加熱時(shí)從微波爐中拿出來(lái)?yè)u晃觀察）。3）倒入凝膠板中凝固。4)加入1μl提取的DNA，事先加入5μl的LoadingBuffer。5）使用DL2000、1kb的Marker作為對(duì)照。6）在120V的條件下跑20min。7）在EB染料中泡20min。8）在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并記錄。2.2質(zhì)粒酶切及沉淀回收2.2.1質(zhì)粒的酶切酶切體系配制：組分少量酶切（10μl）大量酶切（50μl）10xBuffer1μl5μl內(nèi)切酶KpnI0.3μl1μl質(zhì)粒1μl5μlddH2O7.4μl39μl將配制好的酶切體系，放置在37℃中酶切，如果只是進(jìn)行質(zhì)粒酶切檢測(cè)30min即可進(jìn)行檢測(cè)，如果下一步需要進(jìn)行片段回收則最好酶切4h以上，達(dá)到徹底酶切。2.2.2乙醇沉淀法片段回收1) 反應(yīng)結(jié)束后，取3μl樣品跑電泳，檢測(cè)酶切效果；若酶切效果好，將酶切完成的體系置于65℃水浴15min，使體系中限制酶失活。2) 在酶切體系中加入100μl（或大于100μL）ddH2O，將體系補(bǔ)至200μl；3) 加1/10體積（20μl）的NaAc（3M，pH5.2）；4) 在其中加入2.5倍體積（500μL）的無(wú)水乙醇，進(jìn)行顛倒混勻20-30次；5) 冰浴15min，然后在離心機(jī)中以12500rpm的轉(zhuǎn)速離心8-10min，棄上清液；6) 加入500μl70%乙醇，在離心機(jī)中以12500rpm的轉(zhuǎn)速離心4-5min，棄上清液；7) 空甩（當(dāng)離心機(jī)轉(zhuǎn)速達(dá)到了4000rpm即可停止），吸出或吹干殘余液體；8) 加入適量的ddH2O（一般10μl左右）溶解酶切線性片段即可，于-20℃保存。2.3衣藻電擊轉(zhuǎn)化1. 衣藻細(xì)胞預(yù)處理：將搖培好待轉(zhuǎn)化衣藻細(xì)胞加入1/2000(v/v)的10%吐溫Tween-20，并放置在冰上冷卻，促使衣藻細(xì)胞?；?，均勻懸浮。將細(xì)胞培養(yǎng)物收集到離心瓶中以800g離心力，4℃離心5min，棄上清。2. 電轉(zhuǎn)液細(xì)胞懸?。杭尤脒m量的含有40mM蔗糖的TAP(TrisacetatepHospHate)液體培養(yǎng)基重懸，并確保細(xì)胞濃度在1-4養(yǎng)基重8每毫升。3. 加入外源轉(zhuǎn)化載體：正常情況下，加入10ug/ml的pSI103(通過(guò)KpnI線性化載體)和200μg/ml的鮭魚(yú)精DNA，與衣藻細(xì)胞混勻。4. 淀粉溶液預(yù)處理：稱(chēng)取適量的玉米淀粉cornstarch：用蒸餾水和酒精沖洗，將淀粉儲(chǔ)藏在75%的酒精中，防治細(xì)菌污染。實(shí)驗(yàn)前，用TAP-蔗糖溶液（電轉(zhuǎn)緩沖液）潤(rùn)洗，除去酒精。最終在TAP-sucrose培養(yǎng)基溶解，并調(diào)至其濃度為20%(w/v)。并加入終濃度為0.4%(w/v)的PEG-8000（polyethyleneglycol8000），這能促進(jìn)體系的潤(rùn)滑和淀粉的分散。5. 電擊轉(zhuǎn)化：首先調(diào)試電擊儀（SHIMADZU,Kyoto,Japan)參數(shù)：設(shè)置電容為10μF（無(wú)分流電阻），電壓以1900-2400V/cm；吸取250μL待轉(zhuǎn)化的細(xì)胞懸浮液，加入到提前預(yù)冷的一次性的4-mm的電擊杯(Bio-RadLabs.,Hercules,CA)中，擦除外部水滴，放入電擊槽中以進(jìn)行電擊。注意：從菌體收集到電轉(zhuǎn)操作時(shí)間不能超過(guò)一小時(shí)。電擊后，將電轉(zhuǎn)混合物放置在25攝氏度水浴中孵育，至少5min（不能超過(guò)60min）。6. 淀粉鑲嵌：加入預(yù)先處理的淀粉溶液，終濃度為0.2%，顛倒混勻，吸取混合物，輕輕涂布于含有巴龍霉素的TAP的0.5%瓊脂的固體培養(yǎng)基上，最好不要用涂布器來(lái)回涂布，避免細(xì)胞損傷！將平板放置在常溫光照條件下培養(yǎng)。2.4衣藻酸敏感篩選1）將通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化的萊茵衣藻轉(zhuǎn)化子放在96孔的細(xì)胞培養(yǎng)板上進(jìn)行培養(yǎng)。2）每個(gè)轉(zhuǎn)化子都要在不同的pH（6.0-7.0）下進(jìn)行培養(yǎng)，便于篩選。（保證除了pH值不同，其余所有的培養(yǎng)條件都相同）3）培養(yǎng)3-5天后，觀察藻液的顏色變化。4）篩選出在pH6.0生長(zhǎng)很弱而在pH7.0生長(zhǎng)正常的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行保存。第二章萊茵衣藻對(duì)酸的耐受性評(píng)價(jià)第一節(jié)相關(guān)材料1.1實(shí)驗(yàn)藥品及實(shí)驗(yàn)材料NH4Cl、MgSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、K2HPO4、KH2PO4、Tris、冰醋酸、瓊脂、ddH2O。藻株：萊茵衣藻野生型21gr細(xì)胞株系（由清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院潘俊敏教授惠贈(zèng)）。1.2實(shí)驗(yàn)儀器超凈工作臺(tái)、搖床、高壓蒸汽滅菌鍋、pH計(jì)、酒精燈、冰箱等第二節(jié)實(shí)驗(yàn)方法2.1TAP培養(yǎng)基的配制先配制以下三種母液，包括：TAPsalts、pHospHatesolution、Hutner’straceelements。1、TAPsalts組分用量（g）NH4Cl15.0MgSO4·7H2O4.0MgSO4·7H2O2.0加蒸餾水至1L。2、pHospHatesolution組分用量（g）K2HPO428.8KH2PO414.4加蒸餾水至100ml。Hutner’straceelements組分用量（g）EDTA，disodiumsalt50.0H3BO311.4ZnSO4·H2O22.0MnCl2.4H2O5.06CoCl2.6H2O1.61CuSO4.6H2O1.57(NH4)6Mo7O2.4H2O1.10FeSO4.7H2O4.99再將下面的溶液混合，配制成TAP培養(yǎng)基：2.42gTris25mlsolution#1(salts)0.375mlsolution#2(pHospHate)1.0mlsolution#3(traceelements)1.0mlglacialaceticacid用冰醋酸調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值，在固體培養(yǎng)基中每升需加入15gAgar，用高壓滅菌鍋121℃滅菌20min。液體培養(yǎng)基采用抽濾滅菌的方式進(jìn)行滅菌。2.2萊茵衣藻酸敏感突變體的活化將配制好的50mlTAP固體培養(yǎng)基分裝在1.5ml的EP管內(nèi)，將貯存在4度冰箱內(nèi)的萊茵衣藻酸敏感突變體取出，選取優(yōu)秀突變體菌株及野生型21gr接種在1.5mlEP管中，并將活化后的突變體及野生型菌株置于光照條件下生長(zhǎng)數(shù)日。2.3萊茵衣藻酸敏感性篩選2.3.1衣藻培養(yǎng)用冰醋酸將TAP液體培養(yǎng)基的pH值調(diào)到6.0和7.0，將衣藻突變體菌株接種到96孔板內(nèi)，并且提供一定的光照強(qiáng)度，在室溫條件下進(jìn)行培養(yǎng)。2.3.2衣藻的運(yùn)動(dòng)情況觀察在超凈工作臺(tái)內(nèi)，將血球計(jì)數(shù)板用酒精沖洗干凈，再用擦鏡紙擦拭，放在超凈臺(tái)內(nèi)吹干后，將蓋玻片蓋在血球計(jì)數(shù)板上，之后再用移液器吸取少量藻液，在蓋玻片的一側(cè)沿著邊緣緩慢加入到血球計(jì)數(shù)板內(nèi)，最后利用顯微鏡對(duì)該水封片進(jìn)行觀察，記錄并且對(duì)比酸性和正常pH條件下衣藻的運(yùn)動(dòng)情況。2.4觀察不同pH條件下，萊茵衣藻的生長(zhǎng)情況配制pH梯度為6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0的TAP固體培養(yǎng)基，利用2.2中活化后的菌株，在超凈臺(tái)內(nèi)，將其轉(zhuǎn)接到pH6.0~7.0的固體培養(yǎng)基內(nèi)，用封口膜封好后，置于一定的光照條件下，室溫內(nèi)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析第一節(jié)衣藻酸敏感突變體庫(kù)的建立電擊轉(zhuǎn)化時(shí)用KpnⅠ對(duì)pSI103進(jìn)行線性化，其中加入濃度為108/ml左右的萊茵衣藻藻液和10mg/L的巴龍霉素，以不加巴龍霉素作為正對(duì)照，以不加外源DNA為負(fù)對(duì)照，培養(yǎng)7天后發(fā)現(xiàn),第一種培養(yǎng)皿上長(zhǎng)出了許多的轉(zhuǎn)化子，沒(méi)加巴龍霉素的平板上長(zhǎng)出了許多衣藻，使平板整體呈綠色，沒(méi)加外源DNA的平板什么都沒(méi)有長(zhǎng)出來(lái)，呈白色。（圖1）21gr+pSI10321gr(-CK)TAP培養(yǎng)基，10ug/ml巴龍霉素圖1.萊茵衣藻的電擊轉(zhuǎn)化第二節(jié)衣藻運(yùn)動(dòng)情況觀察結(jié)果通過(guò)觀察對(duì)比在pH6.0和pH7.0兩個(gè)條件下衣藻的生長(zhǎng)情況，可知在pH6.0的液體培養(yǎng)基中，肉眼可見(jiàn)生長(zhǎng)出來(lái)的衣藻較pH7.0條件下明顯減少；在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)同一種萊茵衣藻突變體在pH6.0條件下培養(yǎng)后，與在pH7.0培養(yǎng)基中的相比，運(yùn)動(dòng)變得緩慢，而在同一個(gè)培養(yǎng)條件下的衣藻其野生型運(yùn)動(dòng)都要快于突變體。第三節(jié)不同pH條件下衣藻生長(zhǎng)情況的觀察結(jié)果通過(guò)對(duì)萊茵衣藻的表型觀察記錄，做出統(tǒng)計(jì)表（表1），對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，不同的突變體在不同pH條件下其生長(zhǎng)情況不同，即對(duì)酸的耐受性是不同的。這些突變體中大多數(shù)都是在pH6.0時(shí)表現(xiàn)出明顯敏感，與同樣環(huán)境中野生型相比差別很大；在pH6.2~7.0這個(gè)梯度內(nèi)，突變體菌株的長(zhǎng)勢(shì)逐漸遞增，不如pH6.0時(shí)敏感，與同樣條件下的野生型生長(zhǎng)狀況相比，相差不大。而野生型衣藻在pH6.0~7.0之間均表現(xiàn)出正常生長(zhǎng)，無(wú)明顯差別。表1萊茵衣藻突變體及野生型在不同pH條件下生長(zhǎng)情況統(tǒng)計(jì)pH6.0pH6.2pH6.4pH6.6pH6.8pH7.021gr++++++++++++++++++284+++++++++++++++7++++++++++++++++88--+++++++++++++++3-41++++++++++++++++12-44+++++++++++++++++78--+++++++++++++++181--+++++++++++++++5--++++++++++++++90新+++++++++++++++135--+++++++++++++++注：以野生型21gr的生長(zhǎng)情況為標(biāo)準(zhǔn)記為+++，長(zhǎng)勢(shì)與野生型相似記為+++，與野生型相比相差不多記為++，有明顯差別但仍然生長(zhǎng)記為+，不生長(zhǎng)記為--。第四章實(shí)驗(yàn)結(jié)論與討論通過(guò)本實(shí)驗(yàn)研究，電擊轉(zhuǎn)化獲得了5000個(gè)轉(zhuǎn)化子，再篩選出部分優(yōu)秀的萊茵衣藻酸敏感菌株，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。通過(guò)對(duì)比萊茵衣藻菌株在酸性和中性培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)情況得到的結(jié)論是，在酸性培養(yǎng)基中萊茵衣藻突變體生長(zhǎng)緩慢，甚至出現(xiàn)不生長(zhǎng)的狀況，而衣藻的野生型菌株在相同條件下生長(zhǎng)及運(yùn)動(dòng)均正常。在設(shè)置培養(yǎng)基的pH梯度后，我們發(fā)現(xiàn)在pH6.0時(shí)，大多數(shù)的突變體菌株表現(xiàn)出明顯的敏感性，與同樣環(huán)境中野生型的生長(zhǎng)情況相比差別很大；在pH6.2~7.0區(qū)間內(nèi)，衣藻突變體菌株生長(zhǎng)速率高于其在pH6.0時(shí)的生長(zhǎng)速率，與相同pH值下的野生型菌株的生長(zhǎng)速率相差不多。因此我們通過(guò)此次實(shí)驗(yàn)獲得了一些對(duì)酸敏感的萊茵衣藻突變體菌株，為進(jìn)一步研究水體酸化對(duì)水生植物生長(zhǎng)影響方面提供了很大幫助。致謝隨著畢業(yè)論文的完成，轉(zhuǎn)眼間四年緊張而又充實(shí)的大學(xué)生生活即將畫(huà)上句號(hào)。在這四年的學(xué)習(xí)期間，我得到了很多老師和同學(xué)的關(guān)懷和幫助。在學(xué)位論文即將完成之際，我要向所有期間給予我支持、幫助和鼓勵(lì)的人表示我最誠(chéng)摯的謝意。

首先，我要感謝我的指導(dǎo)老師李桂華老師對(duì)我的指導(dǎo)。從論文的選題、構(gòu)思、撰寫(xiě)到最終的定稿，李老師都給了我悉心的指導(dǎo)和熱情的幫助，使我的畢業(yè)論文能夠順利的完成。李老師對(duì)工作的認(rèn)真負(fù)責(zé)、對(duì)學(xué)術(shù)的鉆研精神和嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶W(xué)風(fēng)，都是值得我終生學(xué)習(xí)的。

其次，我要感謝植物科學(xué)學(xué)院610實(shí)驗(yàn)室的師兄師姐和同學(xué)們，和他們一起度過(guò)的幾個(gè)月的實(shí)驗(yàn)室時(shí)光很有意義，在這里他們讓我學(xué)到了許多實(shí)驗(yàn)室的知識(shí)，掌握了扎實(shí)的專(zhuān)業(yè)技能。

最后，感謝所有陪我一路走來(lái)的同學(xué)和朋友，有了他們的支持和陪伴，我才能在這里安心學(xué)習(xí)，順利完成學(xué)業(yè)。

畢業(yè)在即，在今后的工作和生活中，我會(huì)銘記師長(zhǎng)們的教誨，繼續(xù)不懈努力和追求，來(lái)報(bào)答所有支持和幫助過(guò)我的人!參考文獻(xiàn)[1]胡章立；李建成；程雪薇；萊茵衣藻線粒體遺傳系統(tǒng)及其外源基因表達(dá).深圳大學(xué)學(xué)報(bào)(理工版),2013年06期.[2]周峰；劉訓(xùn)財(cái)；厲以強(qiáng)；季榮；李梅；生態(tài)與農(nóng)村環(huán)境學(xué)報(bào),2013年01期.[3]李興涵；萊茵衣藻油脂代謝調(diào)控相關(guān)基因的功能研究.中國(guó)優(yōu)秀碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù),2014年.[4]楊大偉；范曉蕾；KindTobias；FiehnOliver；郭榮波；基于芯片的直接進(jìn)樣質(zhì)譜法和氣相色譜-質(zhì)譜測(cè)定萊茵衣藻中的極性脂類(lèi).化學(xué)學(xué)報(bào),2013年04期.[5]趙小紅；Na2S處理提高萊茵衣藻光合產(chǎn)氫的研究.中國(guó)優(yōu)秀碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù),2014年.[6]左照江;乙酸及和脅迫對(duì)萊茵衣藻的