1、流式細胞術的原理及應用無錫二院檢驗科流式細胞術的基本概念流式細胞術(flow cytometry, FCM)是以流式細胞儀為檢測手段，能夠快速、精確的對單個細胞或顆粒的物理和化學特性（如大小、內部結構、DNA、RNA、蛋白質、抗原等）進行多參數定量分析和分選的技術。流 式 細 胞 術 的 特 點（1）流式細胞術最大的特點是能在保持細胞及細胞器的結構及功能不被破壞的狀態下，從分子水平上獲取多種信號對細胞進行定量分析或純化分選。（2）測量快速、大量、準確、靈敏、定量流式細胞儀的檢測范圍細胞結構細胞大小細胞顆粒度DNA含量與細胞周期RNA含量蛋白質含量細胞功能 細胞表面/胞漿/核的 特異性抗原 細胞

2、活性 細胞內/外的細胞因子 激素結合位點 細胞受體 鈣離子濃度 線粒體膜電位 一、流式細胞儀的工作原理采用激光作為激發光源，保證其具有更好的單色性與激發效率；利用熒光染料與單克隆抗體技術結合的標記技術，保證檢測的靈敏度和特異性；用計算機系統對流動的單細胞懸液中單個細胞的多個參數信號進行數據處理分析，保證了檢測速度與統計分析精確性。 1.流式細胞儀的基本結構（1） 液流系統（2） 光學系統（3） 數據處理系統（1）液 流 系 統 單細胞懸液 大多數儀器檢測范圍是在50-300 m 大小。將細胞懸液注射進入鞘液中這一過程,稱為流體動力學聚焦液 流 系 統 示 意 圖（2）光 學 系 統 由激光光源

3、、分色反光鏡、光束成形器、透鏡組、濾片和光電倍增管組成。FlowTipLaserSS and FLDetectorFS Detector流 式 細 胞 儀 與 顯 微 鏡 的 區 別區別流式細胞儀光學顯微鏡光源激光自然光、燈光對象細胞、生物粒子細胞、組織等承載工具鞘液及流動室載玻片檢測信號光學信號形態及染色放大方式PMT、放大電路目鏡物鏡、光學放大統計計算機人工結果多參數，高通量綜合分析簡單，單參數二、散 射 光 的 測 量 細胞在液柱中與激光束相交時向周圍360立體角方向散射的光線信號，它的強弱與細胞的大小、形狀、胞內顆粒折射等有關，主要分為前向散射光和側向散射光。前 向 散 射 光（FS）

4、 前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射細胞時，光以相對軸較小角度(0.510)向前方散射的訊號用于檢測細胞等粒子的表面屬性，信號強弱與細胞體積大小成正比。 通常在FCM應用中，選取FS作閾值，來排除樣品中的各種碎片及鞘液中的小顆粒，以避免對被測細胞的干擾。前 向 散 射 光 示 意 圖FALS SensorLaser前向散射光側 向 散 射 光（SS） 側向散射光（side scatter, SS）：激光束照射細胞時，光以90角散射的訊號，用于檢測細胞內部結構屬性。側 向 散 射 光 示 意 圖FALS Sensor90LS SensorLaser側向散射光 光 散

5、 射 測 量 的 用 途 測得的FS與SS信號通過計算機處理，可得到FS-SS圖，由此可僅用散射光信號對未染色的活細胞進行分析或分選。 此為血細胞分類的基本原理，但不能分析表面分子。光散射測量最有效用途：從非均一群體中鑒別出某些亞群 三、熒 光 的 測 量熒光信號由被檢細胞上標記的特異性熒光染料受激發后產生，發射的熒光波長與激發光波長不同。每種熒光染料會產生特定波長的熒光和顏色，通過波長選擇通透性濾片，可將不同波長的散射光和熒光信號區分開，送入不同的光電倍增管。選擇不同的單抗及染料就可同時測定一個細胞上的多個不同特征。熒 光 染 料 的 特 性激發波長(EXCITING)發射波長(EMISSI

6、ON)熒 光 信 號 的 檢 測使用熒光標記的單克隆抗體染色，做多色分析熒光信號的強弱，反映了細胞抗原的表達含量熒 光 補 償5 Color Single Laser (488nm)FITC/PE/ECD/PC5/PC7四、細 胞 分 選 原 理 通過流式細胞儀進行細胞分選主要是在對具有某種特征的細胞需進一步培養和研究時進行的。細 胞 分 選 示 意 圖細胞懸液形成液流柱流動室振動液流斷裂成液滴空白液滴含細胞的液滴棄去偏轉落入收集器壓電晶體產生機械振動不充電充電五、數 據 的 顯 示 與 分 析參數：FS,SS,FL數據顯示方式 （單參數直方圖 、雙參數散點圖 、二維等高圖 、假三維等高圖 、

7、三參數散點圖 ）設門分析技術（一）參 數 說 明FS：反映顆粒的大小SS：反映顆粒的內部結構復雜程度FL：反映顆粒被染上的熒光數量多少以及熒光種類（二）數 據 顯 示 方 式直分析方圖單參數直方圖雙參數直方圖:點圖 二維等高圖 假三維等高圖三參數直方圖多參數分析1.單 參 數 直 方 圖 由一維參數(散射光或熒光)與顆粒計數(COUNT)構成，反映同樣散射光或熒光強度的顆粒數量的多少。單 參 數 直 方 圖細胞相對數量信道(channel )2.雙 參 數 直 方 圖雙參數直方圖：縱軸和橫軸分別代表被測量細胞的兩個測量參數，根據這兩個參數就可以確定細胞在圖上的表達位置。雙參數信號通常采用對數信

8、號，最常用的是點密圖，在圖中，每個點代表一個細胞，點圖利用顆粒密度反映同樣散射光或熒光強度的顆粒數量的多少。雙 參 數 直 方 圖 點 圖綠色熒光強度紅色熒光強度（三）設 門 分 析 技 術 1.Gate設置：指根據該圖的細胞群分布選定其中想要分析的特定細胞群。根據門的形狀又分為了線性門、矩形門、圓形門、多邊形門、任意形狀門和十字門。A 淋巴細胞B 單核細胞C 中性粒細胞A、B、C均為任意門線性門 2. 區閾（Region設置）: 如十字門分析時，由四個區閾構成，即G=D1+D2+D3+D4。 D1：CD4+/CD3-D2：CD4+/CD3+D3：CD4- /CD3-D4：CD4- /CD3+

9、（1）淋巴細胞亞群檢測： CD3,CD4,CD8,CD16+56,CD19 免疫功能的變化監測，AIDS（2）HLA-B27:強直性脊柱炎 （3） 白血病免疫分型：白血病的分類（4） 貧血的鑒定：PNH（CD55,CD59）,血小板抗體 (5) . 六、流式細胞術的臨床應用七、流 式 細 胞 儀 的 科 研 應 用細胞周期的分析干細胞研究癌癥病人的多藥耐藥性細胞動力學功能研究環境微生物分析流式細胞術與分子生物學研究流式細胞術在免疫檢驗中的應用DNA 細 胞 周 期 分 析Scell divisionG1(DNAsynthesis)G2M(mitosis)PI染色檢測細胞周期 Protocol

10、離心收集細胞，棄上清，用PBS洗細胞兩次。加入預冷的70%乙醇，于40C固定過夜，或-200C長期固定。細胞染色：離心收集細胞，用1mlPBS洗細胞一次，加入500ulPBS（含50ug/ml溴化乙錠（PI），100ug/mlRNase A,0.2% Triton X-100)40C避光孵育30分鐘。流式細胞儀檢測：一般細胞計數2-3萬個。結果用軟件Modfit分析。 細 胞 凋 亡 的 檢 測細胞形態及細胞膜通透性的變化(Hoechest 33342和碘化丙啶（propidium iodide，PI）Caspases激活(Caspase-3 ) 線粒體跨膜電位降低 (Rhodamine123）膜磷脂酰絲氨酸外化(Annexin V-FITC/PI)Ca2+ 濃度升高 (Fluo-3）DNA斷裂及含量的變化 (TUNEL 和 PI） Annexin-V 和 PI 雙 染 protocol 細胞用冷PBS洗滌二次并在恰當的染色緩沖液（binding buffer）中以1 x 106 細胞/mL的濃度重懸吸取100ul的細胞(1 x 105)至試管中。加進適量的熒光標記的annexin-V試劑和PI。混勻后避光室溫下孵育15分鐘。（必須在室溫下進行）孵育后加進400ul染色緩沖液，立即上流式細胞儀分析。 Annex