1、生化大實驗實驗報告 TOC o 1-5 h z 姓名學(xué)號專業(yè)班級實驗班級 單位指導(dǎo)老師實驗1多酚氧化酶（PPO）的分離提取一、實驗原理：多酚氧化酶（PPO）能夠通過分子氧氧化酚或多酚形成對應(yīng)的醍，它是植物組織廣泛存在 的一種含銅氧化酶，位于質(zhì)體、微體，可參與植物生長、分化、種皮透性及植物抗性的調(diào)節(jié)， 屬于末端氧化酶的一種。植物受到機械損傷和病菌侵染后，PPO催化酚與O2氧化形成為醍，使組織形成褐變，以 便損傷恢復(fù)，防止或減少感染，提高抗病能力。醍類物質(zhì)對微生物有毒害作用，所以受傷組 織一般這種酶的活性就會提高。另外，多酚氧化酶也可以與細(xì)胞其他底物氧化相偶聯(lián)，起到 末端氧化酶的作用。蛋白質(zhì)在不同

2、濃度的鹽溶液中的的溶解度不同通過向溶液中加入適量的固體硫酸銨來 調(diào)節(jié)粗提液的鹽濃度從而可以將PPO蛋白從體系中析出，且大分子蛋白質(zhì)不能通過透析膜。二、實驗?zāi)康模和ㄟ^本項實驗，學(xué)習(xí)和了解蛋白質(zhì)的提取、分離的基本原理和方法，掌握相關(guān)的儀器設(shè) 備的正確使用的方法，以及蛋白質(zhì)的提取分離的系統(tǒng)技術(shù)。三、材料與試劑：材料：馬鈴薯（兩小組共稱200g）試劑：0.03M磷酸緩沖液pH 6.0 （含0.02M蔬基乙醇，0.001M EDTA，5%甘油，1%的 聚乙烯吡咯烷酮）配制是配x10倍的濃縮液1000ml；固體硫酸銨；0.03M磷酸緩沖液pH 6.0（含 0.02M 蔬基乙醇，0.001M EDTA，0.

3、005M MgCl2）設(shè)備：試管與試管架；燒杯、玻璃棒；移液管、滴管等；試劑瓶；透析袋；過濾紗布； 植物組織勻漿機；pH計和pH試紙；高速冷凍離心機；四、操作步驟：兩小組共稱取200g 土豆削皮后切成小塊，加入300ml緩沖液A，兩者按1:1（W/V）比 例勻漿1min ；用兩層紗布將所得的漿液過濾；將勻漿濾液裝入200ml的離心管10000rpm離心5min ；上清液兩組平分每組150ml，加 36.45g硫酸銨固體攪拌均勻后10000rpm離心5min ；取上清液定容至150ml，加入30.75g硫酸銨固體攪拌均勻后10000rpm離心8min，倒 掉上清液得粗酶沉淀，用并加入10ml 0

4、.03M磷酸緩沖液B復(fù)溶沉淀3-5min ；將所得溶液倒入透析袋中，用0.02M的KCl溶液透析至無硫酸銨根離子。五、結(jié)果和分析：實驗所得的初酶液顏色為淺黃色，顏色淺，主要是實驗過程中特別是勻漿以前速度較快 酚類被氧化的少，從而最大程度的保留7PPO的活性；經(jīng)過一個夜晚的透析，得到了澄清的 略帶黃色的液體，這樣就為進一步的柱層析提供了優(yōu)良材料。六、討論與結(jié)論：本實驗在勻漿階段應(yīng)盡量快速，防止酚類充分暴露在空氣中被氧化；2實驗材料馬鈴薯在削皮前一定要清洗干凈；加入硫酸銨固體時一定要小心緩慢，同時伴有玻璃般的攪拌，在溶解蛋白的過程中避 免溶液局部鹽離子濃度過大，使蛋白變性，并注意用量的計算，第二步

5、加入的時候起點濃度 是40%而不是0，否則會加入過量，影響實驗的結(jié)果；透析時，提前檢查透析袋是否完整，避免透析時出現(xiàn)孔洞導(dǎo)致樣品丟失。實驗2胰酶分離提取及活性誘導(dǎo)一、實驗原理：胰酶是醫(yī)藥、食品、飼料等工業(yè)上重要的酶制劑，胰酶的分離提取是普通生化實驗的最 主要、最經(jīng)典的實驗。提取胰酶的經(jīng)典方法，多采用硫酸銨分級沉淀，胰酶在75%飽和硫酸銨中沉淀，其它雜 蛋白一般在10%硫酸銨飽和度下被沉淀除去。經(jīng)此多次提取，最后在pH 8.0硼酸緩沖液中 得到結(jié)晶。胰酶在pH 3.0時最為穩(wěn)定，可在低溫下儲存較長時間而不失活；低于此pH酶易變性； 高于pH 5. 0時，酶易自溶而失活。因此提取制備胰酶的全部操作

6、過程易在低pH和低溫下進 行。胰酶以無活性的酶原形式存在于動物的胰臟中。二、實驗?zāi)康模罕緦嶒灁M通過從豬胰臟中制備胰酶結(jié)晶實驗，掌握酶的制備、一般分離、提取、純化和 結(jié)晶的操作技術(shù)。同時為親和層析、免疫學(xué)實驗準(zhǔn)備樣品。三、材料與試劑：儀器：紫外光分光光度計、恒溫水浴、離心機、組織搗碎機、pH計、顯微鏡、秒表、 剪刀、鑲子、搪瓷盤、乳缽，大玻璃漏斗、抽濾瓶，塑料小桶、紗布、pH試紙，濾紙、玻 璃器皿等；材料：新鮮豬胰臟；試劑及溶液配制：pH 2.5乙酸酸化水、2.5M H2SO4溶液、2M NaOH溶液、5M NaOH溶液、 0.1M HCl 溶液、0.025M HC1 溶液、0.01M HCl

7、溶液、0.4M pH 9.0 硼酸緩沖液 Tris，硫酸 銨，0.8M pH 9.0硼酸緩沖液。四、操作步驟：取新鮮豬胰臟1個冰浴下剝除脂肪和結(jié)締組織，用絞肉機絞碎胰臟；加1-2倍體積已預(yù)冷卻的pH 2.5-3.0乙酸酸化水溶液提取（按1g組織相當(dāng)于1ml體積 算）；檢查提取液中pH，若高于pH 3. 0時應(yīng)及時用10%乙酸調(diào)節(jié)，使提取液維持在pH 2.5-3.0 之間，在冷室5C左右攪拌提取18-24h，4層紗布過濾，用50m1 pH 2.5乙酸酸化水抽提殘 渣一次（時間約為1-2h）合并濾液，用5M H.PO4溶液調(diào)正pH至2.5-3.0，過濾，離心30min， 取上清，量其總體積；鹽析加

8、固體粉狀硫酸銨33.9g，至40%飽和度；鹽析1h，12000rpm離心10min ；然后上清液加硫酸銨33.3 g，至75%飽和度鹽析1h，然后12000rpm離心10min ；沉淀溶于10ml pH 7.5，0.1M Tris，透析過夜，4C保存。五、結(jié)果和討論：經(jīng)過以上實驗步驟得到澄清的酶液。用新鮮的豬胰臟是因為新鮮的胰臟胰酶含量高，容易分離提取。提取過程中保持pH值2.5-3. 0之間，是因為胰酶在低pH值下沒有活性，不會催化其 他蛋白的水解從而降低酶的含量。加入硫酸銨固體時一定要小心緩慢，同時伴有玻璃棒的攪拌，在溶解蛋白的過程中避 免溶液局部鹽離子濃度過大，使蛋白沉淀變性，并注意用量

9、的計算。實驗3卵清蛋白的分離提取一、實驗原理：雞卵粘蛋白存在于雞蛋清中，對胰蛋白酶有強烈的抑制作用，高純度的雞卵粘蛋白抑制 胰蛋白酶的分子比為1：1。雞卵粘蛋白是糖蛋白，分子量28000，但糖成分上有差別。有四 種不同組分，等電點的圍為pH 3.9-4.5, 280nm的消光系數(shù)為A=4.13（1%，1cm）。雞卵粘蛋 白在中性或是酸性溶液中和高濃度的脲都是相當(dāng)穩(wěn)定的，而在堿性溶液中較不穩(wěn)定。由于雞卵粘蛋白對胰蛋白酶的強烈抑制作用，因此可以用雞卵粘蛋白做親和配基制備純 化胰酶的親和柱材。二、實驗?zāi)康模赫莆针u卵清蛋白的提取方法和操作步驟，為以后進行自己的實驗打下良好的基礎(chǔ)。三、材料與試劑：材料：

10、新鮮雞蛋2只；儀器：抽濾瓶500-1000ml、燒結(jié)漏斗、移液器、磁力攪拌器；試劑：10%TCA，5NHCl，5N NaOH，冷丙酮，胰蛋白酶液，BAEE-0.05M，pH 8.0 Tris-HCl 緩沖液，pH 8.0 Tris-HCl緩沖液。四、操作步驟：取兩只新鮮雞蛋，得蛋清50ml，置于燒杯中，外用溫水浴25-30C，在不斷攪拌條件 下，緩慢加入等體積的三氯乙酸-丙酮（1 : 2V/V），立即出現(xiàn)大量白色絮狀沉淀，加完后最 終pH約3.5,在繼續(xù)攪拌30min，然后在4笆放置過夜；次日進行離心，得黃綠色清液；邊攪拌邊加入4笆遇冷的丙酮200ml沉淀蛋白，在 4笆放置2h之后將上清也小心

11、倒入 瓶中回收，下部沉淀部分于10000rpm離心5min，收集沉淀；將沉淀溶于10ml無離子水中，對無離子水透析4h，換水兩次，在對碳酸鈉緩沖溶 液透析過夜，10000rpm離心10min，去除不溶物，取少量上清液；10000 rpm離心10 min，取上清液。五、結(jié)果和分析：經(jīng)過上面實驗得到了較為純凈的雞卵粘蛋白，呈白色粉末狀。在離心以后一定要弄清楚是收集沉淀還是上清液，否則實驗將會失敗。在實驗中要控制pH值，不能使其成堿性，否則粘蛋白會分解，影響粘蛋白的量。實驗4柱層析純化PPO一、實驗原理：柱層析技術(shù)是常用的純化酶、蛋白的手段。在普通生化操作中經(jīng)常通過離子交換層析和凝膠 層析聯(lián)用實現(xiàn)蛋

12、白質(zhì)的純化。PPO的基團能被離子交換樹脂所吸附從而可以把PPO從溶液中分離出來去掉雜蛋白。在 用與樹脂離子結(jié)合強度比PPO大的洗脫液洗脫就可以得到較為純凈的PPO蛋白。二、實驗?zāi)康模和ㄟ^離子交換層析和凝膠色譜層析分離純化PPO的操作，以期掌握柱層析的基本原理、運 用及操作技術(shù)，并了解凝膠色譜測定蛋白質(zhì)分子量的基本原理和操作方法。三、材料與試劑：材料：實驗一所得的PPO粗提液。試劑：0.02MTris-HCI 緩沖液pH 7.4 (含 0.001MEDTA)配制時配X10 倍濃縮液 1000m1 ；NaCl ；聚乙二醇。實驗器械與儀器設(shè)備：試管架、燒杯、玻璃棒、移液管、滴管等、試劑瓶、層析柱PH

13、計和pH試紙恒流泵、梯度混 合儀。四、操作步驟：DEAE-纖維素的處理及裝柱，按照樹脂材料的要求對進行處理，將處理好的材料裝入洗凈 的層析柱，柱材裝到離柱上端1.5-2cm時停止。平衡：柱材裝好后柱上端進液口接恒流泵，下端出液口連接蛋白檢測儀，用 0.02MTris-HCl緩沖液對柱材進行平衡，直到儀器的顯示數(shù)據(jù)不再變化為止。上樣：將粗提酶液上柱，用0.02M Tris-HCl緩沖液pH 7.4洗脫蛋白。洗脫：用含NaCl的0.02M Tris-HCl緩沖液進行梯度洗脫，同時用小試管接洗液，每管 接到試管的2/3處。共接收8管。五、結(jié)果和分析：經(jīng)過柱層析純化的PPO用1.5ml的離心管收集，每

14、管收集2/3體積。收集液無色。在上樣之前一定要平衡好柱子，否則首先洗脫下來的是緩沖液，影響洗脫效率。柱子要豎直，以免柱材料表面不水平，從而影響洗脫實驗5 :酶含量和活性測定一、實驗原理：蛋白質(zhì)和考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合后會顯示不同的顏色，測定其合適波長下的OD值 可以推算出蛋白的含量。PPO可將酚類物質(zhì)氧化成有色物質(zhì)，通過測一定波長的OD值便可以推算出PPO的含 量。二、實驗?zāi)康模赫莆彰傅鞍缀亢突钚詼y定的方法。三、材料與試劑：材料：經(jīng)硫酸銨沉淀獲得PPO粗酶液，DEAE-纖維素DE52分離的酶液和Sephadex G-200分 離純化的酶液樣品。儀器與器皿：分光光度計，分析天平，容量瓶，移液

15、管和試管、核酸蛋白檢測儀；GL-20C高速冷 凍離心機，酶標(biāo)板，酶標(biāo)儀等。試劑：考馬斯亮藍(lán)G-250蛋白試劑、蛋白標(biāo)準(zhǔn)液；DEAE-纖維素DE52 ；葡聚糖凝膠Sephadex G-200 ；蘭葡聚糖、葡聚糖-40、70、100等。硫酸銨沉淀組分，DE-52洗脫組分，鄰 苯二酚，0.2M磷酸氫二鈉-0.1M檸檬酸緩沖液pH 5.8，考馬氏亮藍(lán)G-250蛋白試劑， 蛋白標(biāo)準(zhǔn)液。四、操作步驟：測定酶活性和蛋白濃度，計算純化倍數(shù)。酶含量測定依次分別取洗脫下來的8管試液201加入到酶標(biāo)板的2-9孔，第一孔加入20幺1洗脫液， 第10、11孔加入20幺1粗酶及粗酶1。在在所有孔中加入100幺1考馬氏亮藍(lán)

16、G-250蛋白試 劑顯色10min，然后用酶標(biāo)儀測OD值。酶活性的測定依次分別取洗脫下來的8管試液201加入到酶標(biāo)板的2-9孔，第一孔加入20幺1洗脫液， 第10、11孔加入20幺1粗酶及粗酶1。再在所有孔中20幺1檸檬酸緩沖液，然后加入20幺1 鄰苯二酚試劑顯色10min，然后用酶標(biāo)儀測OD值。五、結(jié)果和分析1.凝膠色譜層析純化PPO :蛋白的含量、酶活、純化倍數(shù)的測定結(jié)果不同試管中蛋白的顯色后的OD值：樣品CK粗酶123456789含量00.60.030.060.510.620.310.220.110.080.09酶活00.7750.010.0560.7470.740.6840.5490.

17、3050.1550.042純化倍 數(shù)01.290.330.931.461.192.212.52.771.940.47從OD值的大小，可以得知粗酶的蛋白含量是最高的，粗酶1初步純化，其他幾個不同時間 段所接收的洗液第4號試管收集最集中，蛋白含量最高。從OD值的大小來看，第4管酶活 性最大，粗酶酶活大幅提升，最后純化的第4管就是PPO最集中的一管，且酶活最高。2.離子交換層析純化PPO :蛋白的含量、酶活、純化倍數(shù)的測定結(jié)果樣 品CK粗酶1234567891011含 量01.390.020.060.040.040.010.070.010.020.010.010.02活 性00.6940.0170.

18、0260.0270.0330.02100.070.0150.0330.0530.043純化00.590.850.430.680.822.1070.753.35.32.15-管=1令金-隊從上述結(jié)果看一看出，用離子交換層析純化PPO,PPO的含量和酶活都沒有什么太大的變化， 并且比起用凝膠色譜層析純化的酶含量和活性都要明顯降低，但是純化倍數(shù)卻比較高，因此 實驗總體來看不是很成功，可能是操作沒有嚴(yán)格執(zhí)行。六、結(jié)論與討論從上面結(jié)果可知，粗酶提純的過程是雜蛋白減少，酶活力提高的過程。從上面實驗數(shù)據(jù)可知，柱層析的純化效果一般。上樣時要控制好速度，不可使膠干了，反應(yīng)時加入酶標(biāo)板后要充分混合。上樣前一定要先

19、平衡層析柱，保證樣品在層析柱時所處的pH及離子強度環(huán)境一致減少 樣品的分解變性，上樣之后就要立即接收洗液。測定酶活時加入底物后要靜置一段時間讓底物充分反應(yīng)后再測，這樣測出來的結(jié)果才比較準(zhǔn)確。實驗6親和層析純化胰酶及酶含量和活性測定一、實驗原理：（1）利用生物分子和相對應(yīng)分子之間親和結(jié)合和解離性質(zhì)而建立起來的層析方法稱之為親 和層析。親和層析的原理就是酶和抑制劑可以發(fā)生特定的專一性的結(jié)合，利用這一特性可以 將酶和其它蛋白質(zhì)分離開來。（2）酶蛋白和考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合后會顯示不同的顏色，測定其適合波長條件下OD值可 以推算出酶蛋白的含量。（3）胰酶可以水解BAEE生成N-苯甲酰-L精氨酸這種在

20、253nm下有最大吸收峰的有色物質(zhì)， 可以根據(jù)所測BAEE被胰酶水解后的OD值變化來推算胰酶的活力。二、實驗?zāi)康模和ㄟ^將胰蛋白酶和抑制劑-雞卵粘蛋白與sephadex-G75偶聯(lián)及親和層析純化胰酶的操 作，來了解親和層析的基本原理，掌握親和柱層析和柱材活化偶聯(lián)及親和層析操作的基本過 程和技術(shù)。再通過胰酶的含量及活性測定加深對酶含量及活力測定的一般方法和步驟。三、材料與試劑：材料：雞卵粘蛋白，胰蛋白酶液。試劑：Sephade-G75，0.11M Tris-HCl pH 7.5，0.1N 甲酸鉀-0.5M KCl pH 2.5，考馬氏亮藍(lán) G-250，BAEE。儀器：抽濾瓶，層析柱，蛋白檢測儀，燒

21、結(jié)漏斗，移液器，磁力攪拌器，酶標(biāo)儀，酶標(biāo) 板。四、操作步驟：1.Sephadex-G75的活化及偶聯(lián)：（1）2.5g干重的葡聚糖凝膠Sephadex G-75，溶脹洗滌數(shù)次；（2）加入 0.05M NalO4溶液 50ml，30min ；蒸餾水洗滌數(shù)次，抽干備用；純化的雞卵粘蛋白35ml，加入活化葡聚糖凝膠；5%K2CO3調(diào)pH 7.5-9.0，緩慢攪拌3h，反應(yīng)過程隨時加入5% K2CO3 ；以保持pH穩(wěn)定；0.27g KBH4溶于20ml水，緩慢攪拌加入上述體系反應(yīng)5h，pH維持在6.5-7.5洗滌；胰蛋白酶的親和層析：裝柱，按照樹脂材料的要求進行處理，將處理好的材料裝入洗凈的層析柱，柱材

22、裝到 離柱上端1.5-2cm時停止；平衡：柱材裝好后柱上端進液口接恒流泵，下端出液口連接蛋白檢測儀，用0.5MKCl0.05M CaCl2緩沖液對柱材進行平衡，直到儀器的顯示數(shù)據(jù)不再變化為止；上樣：將胰蛋白酶液上柱，待蛋白檢測儀在280nm處達(dá)到峰值后停止上樣；洗脫：用含pH7.5的緩沖液進行洗脫，待蛋白檢測儀記錄的吸收值回到基線時，改用 0.1M的甲酸鉀0.5M KCl pH 2.5的洗脫液進行解吸附，收集洗脫下來的蛋白共9小試管， 每管接到試管的2/3處；測定酶活性和蛋白濃度：酶含量測定：依次分別取洗脫下來的9管試液200l加入到酶標(biāo)板的2-10孔，第1孔加入200l洗脫 液，第11孔加入

23、200幺l粗提液。在在所有孔中加入20幺l考馬氏亮藍(lán)G-250蛋白試劑顯色 10min，然后用酶標(biāo)儀測OD值。酶活性的測定：依次取洗脫的9管試液200l加入到酶標(biāo)板的2-10孔，第1孔加入200l洗脫液，第11 孔加入200l粗提液。再在所有孔中加入20l BAEE，顯色10min，然后用酶標(biāo)儀測OD 值。五、結(jié)果與分析：蛋白含量的測定結(jié)果不同試管中蛋白的顯色后的OD值：樣 品粗酶123456789101112含 量0.1330.0160.0320.0540.0620.0350.0610.0330.160.1630.1790.1310.095從上面表格結(jié)果及下圖可以得知，酶蛋白含量的變化趨勢是

24、先高后低，而第10管的酶蛋白 含量是最高的；粗酶的含量的OD值是0.133，明顯比第10管低，可見親和層析對酶有濃縮 作用。六、結(jié)論與討論：從以上數(shù)據(jù)及圖表看，純化的效果較好。這可能是因為洗脫的時間夠長，洗脫液的離子 濃度夠大，能將蛋白質(zhì)洗脫下來。在上樣品時可以多上一些，若柱子裝不下，可以將下端出液口打開，放出部分液體，待到 檢測儀的讀數(shù)有大的變化時收集洗液。層析柱一定要平衡好后才能使用，否則實驗結(jié)果會很不準(zhǔn)確。檢測儀使用前一定要調(diào)零，還要使用正確的檔位。測OD值時每個子實驗的所有數(shù)據(jù)都要在同一參比下一次性完成，這樣的結(jié)果才會準(zhǔn)確。實驗7 SDS測定蛋白質(zhì)分子量及蛋白質(zhì)純度鑒定一、實驗原理：蛋

25、白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時，它的遷移取決于它的電荷量及分子量大小和形狀等 因素。在聚丙烯酰胺凝膠中加入SDS后能使蛋白質(zhì)帶恒定量的負(fù)電荷，從而它的移動速度僅 取決于分子量的大小，而與所帶電荷無關(guān)。二、實驗?zāi)康模和ㄟ^實驗，學(xué)習(xí)和掌握SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測蛋白純度和分子量的方法。三、材料與試劑：材料：胰酶粗提液；試劑與儀器：丙烯酰胺母液；SDS溶液，過硫酸銨溶液，TEMED，電極緩沖液，樣品緩沖 液，染色液，脫色液，標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白，電泳儀，垂直電泳槽。四、操作步驟：凝膠制備：用兩塊電泳玻璃板制成垂直板槽，垂直放置。將配制好的分離膠溶液倒入， 滴加無離子水，待膠凝聚后，倒出無離子水，用吸水紙

26、吸干，倒入濃縮膠，再插入梳子。上樣：分別取樣品若干于離心管中，按1/1-1/5比例加入5倍樣品緩沖液，在沸水浴中 加熱3-5min，取出待用。用微量注射器分別吸取不超過301不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品和 實驗樣品注入樣品槽。點樣結(jié)束后，調(diào)節(jié)電泳儀電流穩(wěn)定不變，當(dāng)溴酚藍(lán)遷移到離分離膠 底1-2cm時即可停止電泳。染色：電泳完畢后，取出凝膠板，浸入染色液中，在37C溫箱中保溫過夜。倒掉染色液， 用脫色液脫色，第二天換一次脫色液，24h后，即可看到清晰的條帶。五、結(jié)果與分析：脫色后的凝膠塊拍照所得照片如圖所示：六、結(jié)論與討論：上圖中為各組的？?0蛋白和胰酶蛋白；照片中明顯的條帶幾乎集中在同一水平線上，可

27、見實驗的效果還是比較好的。制膠時應(yīng)注意不要留有氣泡，影響實驗的精確性。加入無離子水時應(yīng)該在膠的一側(cè)加入，不宜從一邊到另一邊緩慢加入，保證膠面的平整。根據(jù)分子量大小，推算出目標(biāo)蛋白的位置Marker條帶可以很方便確定每條條帶的分子量， 從而對應(yīng)找出目標(biāo)蛋白的分子量。實驗 8 Western-blotting一、實驗原理：Western blotting技術(shù)是用來檢測蛋白質(zhì)的特定的、靈敏的方法。主要由蛋白質(zhì)的 SDS、電轉(zhuǎn)及雜交幾部分組成。Western印跡法檢測蛋白的敏感性約為1-5ng，0.75mm 厚的SDS板的一個孔可以上總蛋白量為100g，所以只要被檢測蛋白不低于總蛋白量的 萬分之一，即

28、可被檢測出來。如果所分析的樣品為未知時，應(yīng)同時作陽性對照。雜交技術(shù)主要有NC模的封閉，靶蛋白與第一抗體的反應(yīng)，結(jié)合靶蛋白的一抗與二抗的反應(yīng)， 顯色等幾部分構(gòu)成 該技術(shù)的原理及過程主要為轉(zhuǎn)移到NC膜上的蛋白帶結(jié)合膜的可結(jié)合位點， 用其他蛋白作為封閉液將其他未結(jié)合位點封閉，靶蛋白與第一抗體反應(yīng)，將其他蛋白從膜上 洗脫出去，結(jié)合靶蛋白的一抗與二抗反應(yīng)洗脫，而后顯色檢測蛋白的存在。二、實驗?zāi)康模簩W(xué)習(xí)和掌握western-blotting的一般方法和步驟。三、材料與試劑：材料：待檢測的胰蛋白；儀器：電轉(zhuǎn)移槽，電泳儀，塑料封口機，搖床；試劑：轉(zhuǎn)移緩沖液：電極緩沖液加20%甲醇；封閉液：1%(W/V)脫脂奶

29、粉，溶于TBST中；TBST : 150mM NaCl，50mM Tris-HCl (pH 7.5)0.01% antiform A，0.02%疊氮鈉 第二抗體稀釋液：1%(W/V)脫脂奶粉，溶于TBST中0.5% Tween 20堿性磷酸酶酶顯色液四、操作步驟：1.SDS電泳見實驗11 ；2.電轉(zhuǎn)：剪6塊3mm濾紙和一塊NC膜；將剪好的濾紙和NC膜在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡3-5min ；按下列過程安裝轉(zhuǎn)移裝置，將塑料支架平放在含轉(zhuǎn)移液的托盤中，在塑料支架上放一塊 海綿；將三塊3mm的濾紙對齊放在海綿上，然后依次將NC膜、凝膠及另3塊濾紙和海綿放上；用塑料支架夾盡上述各層，放入電轉(zhuǎn)移槽，NC膜一側(cè)向

30、正極，凝膠一面向負(fù)極；接通電源電壓40V，電流0.17-0.2A，轉(zhuǎn)移1.5-6小時；轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取出塑料架，依次揭掉各層，用鉛筆在膜上沿作好記號，切下其中一個孔 所對應(yīng)的膜的一半，用氨基黑或考馬氏亮蘭染色，檢查效果；將其他的膜放在一干凈的3mm的濾紙上，室溫干燥30-60min ；NC膜的封閉，將經(jīng)過電轉(zhuǎn)移并干燥的NC膜放于一平皿中，加入封閉液室溫下輕輕蕩漾 2-3h ；將第一抗體用封閉液稀釋，稀釋度由預(yù)實驗確定；將B中封閉好的NC膜放入塑料袋中，加入一抗，加入量為0.1ml/cm2 NC膜，趕走氣泡， 封口機封口，4度下輕輕震蕩2h；洗膜，反應(yīng)結(jié)束打開塑料袋棄掉廢液，用PBS洗三次每次10

31、min ；將二抗稀釋，稀釋度為1 : 200-1： 2000。將NC膜放入塑料袋中，加入二抗，加入量為 0.1ml/cm2 NC膜，趕走氣泡，封口機封口，室溫下輕輕震蕩1h ；剪開塑料袋取出NC膜，在150mM NaCl，50mM Tris-HCl中洗脫1-5次，每次10min ；將膜放入顯色液中，室溫下輕輕搖動；將條帶出現(xiàn)后，立刻用水洗膜。然后用TE終止；電轉(zhuǎn)條帶五、結(jié)果與討論：電轉(zhuǎn)條帶電轉(zhuǎn)圖經(jīng)過以上的實驗操作，NC膜經(jīng)過顯色出現(xiàn)的條帶可以看見，做的效果還可以。在加入一抗前一定要先封閉，不然一抗會結(jié)合膜的結(jié)合位點，造成假陽性。加入二抗前一定要洗脫徹底，否則會造成假陽性。如果顯色結(jié)果不太明顯，

32、原因可能是在轉(zhuǎn)膜的時候未能將蛋白大量的轉(zhuǎn)移到膜上，也可能 是抗體的量太少，結(jié)合的量有限，顯色后不是很明顯，還有可能是顯色劑的量太少或是顯 色條件不適合。實驗9染色體DNA的提取一、實驗原理：DNA是遺傳信息的載體，是最重要的生物信息分子，是分子生物學(xué)研究的主要對象，因 此DNA的提取也應(yīng)是分子生物學(xué)實驗技術(shù)中最重要、最基本的操作。本實驗通過裂解液裂解 細(xì)胞(植物樣品由液氮下研磨以粉碎組織)，有機溶劑反復(fù)抽提，使DNA進入水相與蛋白成分 分開，在RNase作用下，降解RNA以提純DNA。二、實驗?zāi)康模和ㄟ^實驗學(xué)習(xí)和掌握提取植物染色體DNA的原理和方法。三、材料與試劑：材料：培養(yǎng)菌體；儀器：超凈工

33、作臺、培養(yǎng)箱、搖床、高速冷凍離心機、超級恒溫器或恒溫水浴、臺式離心機、取液器一套、低溫冰箱或冰柜、冷凍真空干燥器、電泳儀、水平電泳槽、紫 外觀測儀；試劑：細(xì)胞裂解液(100mM Tris-HCl，5mM EDTA，500mM NaCl，1.25% SDS，pH 7.5)，飽和酚，氯仿/異戊醇，酚/氯仿/異戊醇，異丙醇，70%無水乙醇，3MNaAC，RNase， 50 xTAE緩沖液，電泳載樣緩沖液。四、操作步驟：培養(yǎng)菌體10ml裂解液，1/10體積酚65C，20-30min，加等體積的氯仿，輕搖日離心(12000-15000rpm)，15min上清液加等體積的氯仿，輕搖，離心(12000-15

34、000rpm)，15min取上清(如界面不清，則在此之后可用氯仿反復(fù)抽提多次)加0.6體積冷異丙醇(-20C)或2體積冷無水乙醇(-20C)0.1體積3M乙酸鈉(pH 5.2)室溫 10min，離心(12000-15000rpm)，10min沉淀70%乙醇洗一次，無水乙醇，離心(12000-15000rpm)，10min真空干燥復(fù)溶于2ml TE(或水)加 RNase 搖勻，65C 或 37C,10-30min等體積酚，酚/氯仿，氯仿各一次，離心(參數(shù)同上)取上清加異丙醇或無水乙醇，3M乙酸鈉(pH 5.2)，離心(參數(shù)同上)Y沉淀70%乙醇洗滌(方法同上)沉淀真空干燥，復(fù)溶于0.5-1.0m

35、l的TE或水中，分裝成小體積，4C或-20C保存。五、結(jié)果與分析：實驗結(jié)果如上圖所示，條帶彌散，可能是模板降解，沒有條帶可能是點樣沒點上等實驗操作 不過關(guān)造成的，在今后實驗中應(yīng)盡量避免。實驗10質(zhì)粒DNA的提取與純化一、實驗原理：細(xì)菌質(zhì)粒多為一些雙鏈環(huán)狀的DNA分子，其大小圍從1Kb-200以上Kb不等，它是獨立 于細(xì)菌染色體外進行復(fù)制和遺傳的輔助性遺傳單位，而且它還是進行分子生物學(xué)實驗操作， 進行遺傳工程改良物種等工作時的最主要的DNA載體。質(zhì)粒DNA的提取根據(jù)目的的不同，可 以有不同的方法，但基本步驟多為三步：第一，細(xì)菌培養(yǎng)和質(zhì)粒的擴增；第二，細(xì)菌菌體的 裂解；第三，質(zhì)粒DNA的純化。菌體

36、裂解的方法主要有沸煮法，SDS法，堿解法，Triton- 溶菌酶法等。質(zhì)粒DNA純化的方法主要有梯度離心法、柱層析法等。二、實驗?zāi)康模赫莆諌A變性抽提質(zhì)粒DNA法的一般步驟和操作方法，熟悉質(zhì)粒DNA的純化方法和步驟。三、材料與試劑：材料：大腸桿菌；試劑：Solution I : 50mM 葡萄糖25mM Tris-HCl (pH 8.0)10mM EDTA (pH 8.0)高壓滅菌，4C保存Solution II：0.2M NaOH，1% SDS，現(xiàn)配現(xiàn)用；Solution III : 5M KAC，60ml，11.5 冰乙酸，28.5 水，4C保存；3M NaAC ； pH 5.2高壓滅菌；4

37、C保存；氨芐青霉素；50mg/ml ；溶菌酶；酚/氯仿/異戊醇(25/24/1)；異丙醇；LB培養(yǎng)基；TE緩沖液；電泳試劑；四、操作步驟：2ml/20ml培養(yǎng)菌體37C 200rpm過夜離心，4C，5000rpm，10min1 F沉淀(菌體細(xì)胞)加入預(yù)冷的100婦Solution I加入200婦SolutionII，冰浴中5min取上清12V 乙醇，0.3V 3M NaAC，-20C，30min離心(12000g)，10min取沉淀-凍干干燥-再懸浮于50l TE緩沖液五、結(jié)果與分析：通過以上的步驟得到了較為純凈的質(zhì)粒DNA，為后續(xù)的實驗準(zhǔn)備了材料。提取質(zhì)粒DNA的電泳結(jié)果如上圖所示，最下面最

38、亮的一條條帶為超螺旋質(zhì)粒DNA，結(jié)果表明，質(zhì)粒DNA的提取較純。從點樣孔到主帶間沒有明顯背景，說明蛋白質(zhì)去除較干凈。六、結(jié)論與討論：通過以上的步驟得到了較為純凈的質(zhì)粒DNA，為后續(xù)的實驗準(zhǔn)備了材料。試劑中所用葡萄糖有增加粘度，降低剪切率，減少DNA的降解。試劑中所用EDTA有抑制DNase的作用，還能降低離子濃度，而高濃度離子對溶菌酶有抑 制作用。試劑中所用NaOH能使DNA變性，KAC能使DNA復(fù)性，并有助于蛋白等其它大分子成分沉 淀。不用酚/氯仿抽提；B，LB培養(yǎng)基殘留；C，提取中在溶液II中時間過長，導(dǎo)致共價閉 合環(huán)狀DNA不可逆變性，則可能影響酶切培養(yǎng)菌。實驗11酶切技術(shù)一、實驗原理：

39、限制性切酶是一類能識別雙鏈DNA分子中特異核苷酸序列的DNA水解酶，這類酶的發(fā)現(xiàn) 和應(yīng)用促進了以。重組為基礎(chǔ)的生物工程技術(shù)的迅猛發(fā)展 該類酶是體外剪切基因片段的 重要工具。二、實驗?zāi)康模罕緦嶒炛饕ㄟ^EcoR I，Hind III兩種限制性切酶對ADNA，質(zhì)粒DNA和染色體DNA的單 酶切或雙酶切的操作來學(xué)習(xí)和掌握亞克隆這項技術(shù)。三、材料與試劑：材料:DNA；試劑與設(shè)備：EcoR I及緩沖液，Hind III及緩沖液，2DNA 0.532g/婦，TAE緩沖液， 離心機，恒溫水浴，取液器，電泳儀，電泳槽，紫外觀測儀。四、操作步驟：I.EcoR I、Hind III單酶切、部分酶切及雙酶切：取2支

40、干凈、滅菌新Eppendof管，分別按下表加入以下試劑：處理A （婦）B（婦）滅菌水813Buffer22模板EcoR I8幺1質(zhì)粒31 ADNAEcoR I11Hind III11總體積202037C保溫1-2小時，保溫結(jié)束后，加入0.5M（pH 7.2）EDTA（使終濃度達(dá)到10Mm）。加入6l 電泳加樣緩沖液電泳。五、結(jié)果與分析：下圖為實驗的電泳條帶圖。六、結(jié)論與討論：1. ADNA、質(zhì)粒DNA、染色體DNA的EcoR I和Hind III雙酶切的條帶有的出來了，有的沒 出來，這可能是因為實驗操作不過關(guān)造成的。出來的條帶，酶切效果還不錯。實驗12 DNA片段的連接技術(shù)一、實驗原理：DNA

41、酶切片段的連接是兩DNA片段相鄰的5-磷酸和3-羥基間可由連接酶催化形成磷 酸二酯鍵，這個連接反應(yīng)在體外一般都有大腸桿菌DNA連接酶和T4 DNA連接酶催化，但是 在分子生物學(xué)實驗中主要采用T4 DNA連接酶，因該酶在正常條件下，即能完成連接反應(yīng)。二、實驗?zāi)康模罕緦嶒灁M通過T4連接酶對酶切片段的連接操作，使學(xué)員掌握這一 DNA片段的連接技術(shù)。三、材料與試劑：試劑：0 xT4 DNA連接酶緩沖液，ADNA，酚/氯仿，酚，TE緩沖液，電泳緩沖液，3MNaAc ；儀器：離心機，恒溫設(shè)備，真空干燥機，取液器。四、操作步驟：取干凈滅菌的離心管，按下表加入試劑：試劑體積（婦）T4DNA連接酶緩沖液1ADNA5質(zhì)