1、酵母雙雜交學院：醫藥學院專業：微生物與生化藥學學號：21140811040姓名：崔小清酵母雙雜交系統 Yeast Two-hybrid System 酵母雙雜交系統是在1989年由StanleyFields和k-kyu Song首次提出并初步建立的在釀酒酵母體內分析蛋白質與蛋白質相互作用的系統。 自建立已有153年的歷史，已經逐步發展成一個較完善的分析蛋白質與蛋白質相互作用的系統，并基于原初 的基本原理衍生了一系列類似的系統：酵母單雜交系統、反向雙雜交系統、三雜交系統，還有人預測，將來還可能出現四雜交系統。報告基因的多樣化，發展了雙報告基因系統，可靠性增大，敏感性增強。 在生物體發育的不同階段

2、，細胞分裂、分化的不同時期，都離不開蛋白質間的相互作用，自酵母雙雜交系統創建以來，已經成為研究蛋白質相互作用的重要手段，并揭示了大量未知蛋白質之間的相互作用。 相關知識： 在結構基因的上游、下游或內部有一些調控成分，并依靠特定的蛋白因子結合與否調控基因的轉錄。1、順式作用元件：存在于基因旁側序列中能影響基因表達的序列。包括啟動子、增強子、調控序列和可誘導元件等，作用是參與基因表達的調控。2、反式作用因子（轉錄因子）：能直接或間接地識別或結合在各類順式作用元件核心序列上，參與調控靶基因轉錄效率的蛋白質。3、報告基因：是一種編碼可被檢測的蛋白質或酶的基因。基本原理真核生長轉錄因子含有兩個結構上可以

3、分開的、功能上也相互獨立的結構域組成的結構域：轉錄激活結構域(AD)(activation domain) DNA結合結構域(BD)(DNA binding domain) 轉錄激活因子 BD：識別DNA上特定序列，轉錄激活域定位調控 基因的上游。 AD：與轉錄復合體其他成分作用，從而啟動所調節基因的轉錄。 兩個結構域分開時仍具有功能，但不能激活轉錄，只有他們以適當 途徑在空間上較為接近時，才能具有轉錄因子活性，激活報告基因的表達。（可為不同轉錄因子的BD和AD） 酵母雙雜交系統利用雜交基因通過激活報告基因的表達，探測蛋白-蛋白的相互作用。酵母雙雜交原理示意圖XRNAPolymeraseDBD

4、Reporter genePreyBaitADYExpressionUAS2. 拆開 DomainDNA binding domainActive domain上游激活序列（UAS）轉錄機GAL4效應基因結合用重組DNA技術把GAL4的兩個Domain分開，就喪失了激活效應基因的能力。不能轉錄3. 重組Domain用重組DNA技術把這兩個Domain分別與兩個不同的多肽連接。Active domain蛋白A蛋白BDNA binding domain在體內，蛋白A與蛋白B是否能結合。通過效應基因是否被激活來檢查：4. 觀察報告基因表達上游激活序列（UAS）轉錄機GAL4效應基因蛋白ADNA bi

5、nding domain轉錄激活domain蛋白B激活轉錄GAL4的DB domain與AD Domain也能靠近，所以能啟動效應基因的轉錄。轉錄表達（2）如果蛋白A與蛋白B能相互結合實驗步驟一、構建雙雜交體系的宿主菌 刪除基因組中的內源野生型GAL4基因，使酵母菌只能利用載體表達的GAL4蛋白。二、構建報告基因（reporter gene） GAL4的效應基因是his3。 GAL4激活組氨酸合成酶的表達，使酵母菌能生長在組氨酸缺乏培養基上。三、構建雙雜交體系的穿梭質粒 1. 穿梭質粒（shuttle plasmid）：既能在大腸桿菌中復制，又能在酵母菌中復制和表達的質粒。 2. 雙雜交體系需

6、要兩種穿梭質粒： 分別攜帶已知的靶蛋白基因和攜帶未知基因序列。（1）BD-plasmid 靶基因(蛋白A基因)按正確的讀碼結構和取向克隆在GAL4的BD之后。 篩選標志：TRP（2）AD-plasmid 蛋白B基因按正確閱讀框 克隆到GAL4的AD片斷 之后。 篩選標志：LEU2 3. 兩種重組質粒共同轉化酵母菌（HF7c）4. 篩選觀察 雙載體轉化能合成亮氨酸和色氨酸，Trp-Leu-菌體存活。Trp-Leu-3. 兩種重組質粒共同轉化酵母菌（HF7c）4. 篩選觀察 篩選蛋白A和蛋白B能相互作用的雙載體轉化子。Trp-Leu-His-注意事項1、蛋白間的相互作用較弱，應選擇高敏感的菌株或多

7、拷貝載體。2、融合蛋白的表達對細胞有毒性，應選擇敏感性較低的菌株或拷貝數低的載體3、某些誘餌蛋白具有自身激活性質。雙雜交前刪除該部分，但應避免刪除相互作用的結構域4、避免細菌污染。 尤其在以YPDA培養時，酵母培養物易于受細菌污染。可以通過培養物氣味、生長速度和培養物沉降系數簡易鑒別。細菌污染時，培養物帶有臭味，而酵母培養物略有酒香味。細菌生長速度遠較酵母為快，一旦發現OD600增長過快，應考慮細菌污染。5、要使用獨立的稱量藥勺稱取不同培養基組分，防止交叉污染，以免營養篩選效果不佳。6、控制好各步驟中菌體的OD值，轉接大瓶后才能較快生長。7、酵母培養不能使用尖底容器。酵母比重較大，在震蕩培養過

8、程中，易于沉積于培養容器底部，因而尖底管不適合用于酵母培養。如1.5mlEP管，15ml離心管等。盡量使用2ml圓底EP管，50ml離心管等。 FAM172A蛋白的生理功能之一是參與細胞生長的調控, 與糖尿病大血管病變的發生有關。篩選人胎腦 cDNA 文庫中與FAM172A 蛋白相互作用的蛋白，為深入研究新發現的蛋白質 FAM172A，生物學功能及在疾病中的作用奠定基礎。 FAM172A基因的過表達改變了細胞周期的分布，促使細胞從 G1期加速向 S期過渡，最終促進了HEK293 細 胞 的 增 殖，抑 制 了 細 胞 凋 亡，因 此， FAM172A基因可以通過抑制細胞凋亡，增加細胞增殖而促進

9、細胞的生長。 構建 p GB-FAM172A誘餌質粒，轉化酵母菌株 Y190。人胎腦 cDNA 轉化誘餌酵母菌，于營養缺陷型培養基（SD/-Leu/-Trp/-His）上生長，從中篩選到 35個單克隆進行 - 半乳糖苷酶克隆轉移濾紙實驗，對藍色克隆者進行質粒抽提，轉入大腸桿菌 DH/OB，進行抗性篩選，從中提取質粒，一對一與誘餌質粒 p GB-FAM172A共轉酵母細胞 Y190 ，進行驗證鑒定，提取質粒 DNA, 進行測序并進行 BLAST 比對分析。結果成功構建 p GB-FAM172A質粒，經嚴格篩選，共有10個陽性克隆，分別進行測序、序列比對，成功篩選出6個與 FAM172A，存在相互

10、作用的蛋白: RTCD1、 MOCS2、A2M、KCNIP1、BTBD2和TOX2。具體事例應用酵母雙雜交篩選與 FAM172A相互作用蛋白的研究1、材料酵母菌株 Y190，人胎腦 cDNA文庫（載體是PACT2），E.coli DH/OB，酵母表達載體p GB-VectorB，PDC315-FAM172A質粒。2、主要試劑和試劑盒營養缺陷培養基（Leu-/Trp-、 Leu-/Trp- /His-），X-gal，Sfi 限制性內切酶，T4DNA連接酶， 鮭魚精 DNA， 高保真Pfu DNA 聚合酶，DNA膠回收試劑盒，PCR產物回收試劑盒3、實驗步驟（1）誘餌質粒構建：擴增質粒：PDC31

11、5-FAM172A質料為模板，Sfi 酶切獲取誘餌基因片段連接： T4DNA連接酶與p GB-Vector連接重組載體鑒定: 重組載體轉化E.coli DH/OB ，涂布于Kan平板過夜挑取 單克隆搖菌過夜培養，提取質粒，用質粒作模板 PCR 擴增，產物瓊脂糖凝膠電泳，并經酶切及測序鑒定，確定 FAM172A讀碼框序列是否正確。（2）轉化酵母菌株Y190采用 PEG 轉化法將誘餌質粒 p GB-FAM172A轉入酵母菌株 Y190，同時設質粒 p GB為陰性對照，質粒 PCL1 為陽性對照，檢測誘餌蛋白對 LacZ報告基因是否存在轉錄激活作用，若轉化了誘餌質粒的酵母菌落表達 -半乳糖苷酶，則可

12、使底物 X-gal 變藍，說明存在自激活，否則說明無自激活。（3）酵母雙雜交篩選人胎腦 cDNA 文庫，人胎腦 cDNA文庫轉化誘餌酵母菌及初步篩選: 菌液，分別涂布于培養基（A：Leu-/Trp-、B: Leu-/Trp- /His-），A平板上的克隆進行計數，根據稀釋度計算轉庫效率（轉庫效率只有達到 1X107-1X108cfu/gDNA以上才能進行文庫的篩選，以保證不會丟失陽性克隆半乳糖苷酶克隆轉移濾紙實驗進一步篩選: 從B: Leu-/Trp- /His-平板上挑取 35 個單克隆進行 -半乳糖苷酶克隆轉移濾紙實驗，變藍色的為陽性克隆。參考文獻：1、張 蓉 李梅芳 李連喜等. 應用酵母

13、雙雜交篩選與 AM172A相互作用蛋白的研究 J . 醫學研究雜志中華醫學雜志. 2014 . 43(4):37-41.結果： 本研究應用酵母雙雜交系統篩選人胎腦 cDNA文庫，檢測與 FAM172A蛋白相互作用的蛋白，對 10個陽性克隆相應的質粒進行測序后，通過 BLAST在 GenBank數據庫中對應 6個不同的基因，編碼6種已知的蛋白質： RTCD1、 MOCS2、A2M、KCNIP1、BTBD2和TOX2，根據GenBank數據庫及相關文獻獲得了它們的功能信息。其中 A2M與糖尿病血管病變密切相關，也進一步提示 FAM172A參與了糖尿病大血管病變的發病。（4）陽性雜交克隆的質粒抽提及一對一驗證: 對上述篩選的陽性克隆進行質粒抽提，再次進行抗性篩選和質粒抽提后，一對一與誘餌質粒 p GB-FAM172A共轉酵母細胞 Y190 驗證，再次陽性者抽提質粒進行測序生物信息學分析: 利用 NCBI 對測序所得到的序列進行 BLAST 比對分析。優點1、靈敏度高：在真核模式生物酵母中進行的，對蛋白質之間微弱的、瞬間的作用也能通過報告基因的表達產物敏感地檢測得到。2、高效：轉化方法簡單，轉化效率高，能