1、 從分子到細胞，我們如何去思考？DNA的重組 DNA Recombination1.DNA是什么？2.我們這里談的DNA重組是什么？3.如果我的實驗需要重組DNA，我需要什么試劑？4.如何提高重組的效率和成功率？DNA是什么？ 有個小問題，如果我要表達一個蛋白質或者多肽，這一段基因是DNA嗎？或是RNA?還是別的什么東西？DNA重組的到底是什么？A.重組的DNA如何獲取?a.變出來行不行？b.買一個基因行不行？c.如果是克隆出來的，那怎么克??？DNA重組是大家實驗中的“最笨的機械運動嗎？A.顯然不是。B.DNA重組與數學，計算機，人的求知欲有沒有關系？基因-gene重組DNA技術相關概念（一）

2、DNA克隆 克隆（clone） 來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。 獲取同一拷貝的過程稱為克隆化（cloning）,即無性繁殖。技術水平： 分子克?。╩olecular clone） 即DNA克隆 細胞克隆 個體克?。▌游锘蛑参铮﹥惹泻怂崦竷惹泻怂崦?，維持細菌遺傳性狀的穩定。限制性內切核酸酶或DNA結合蛋白所特異識別、結合的DNA位點的核苷酸序列，呈二元旋轉對稱，通常將這種特殊的結構順序稱為回文結構（palindrome）。 識別序列可以是四核苷酸、六核苷酸或八核苷酸；產生的切口可以是粘性末端、平頭或鈍性末端、配伍末端。 。(三)目的基因 目的基因：用來擴增作研究或生產某一種蛋白質的基因。就

3、是在重組DNA時，人們感興趣的基因或DNA序列，又稱目的DNA(target DNA)。 類型： cDNA(complementary DNA)：指經反轉錄合成的、與RNA互補的單鏈DNA，經聚合可合成雙鏈cDNA。 基因組DNA(genetic DNA)：指代表一個細胞或生物體整套遺傳信息(染色體及線粒體)的所有DNA序列。感受態細胞：指具備接受外源DNA能力的宿主細胞六）克隆基因的表達表達體系的建立表達載體的構建受體細胞的建立表達產物的分離純化、原核表達體系、真核表達體系體外細胞培養物的生長類型 按生長方式:2型 粘附型細胞:附著在某一固相支持物表面才能生長的細胞。 懸浮型細胞:不必附著于

4、固相支持物表面，而在懸浮狀態下即可生長的細胞。 絕大多數有機體細胞屬粘附型細胞，只有少數細胞類型如某些腫瘤細胞和白細胞可在懸浮狀態下生長。 貼附(粘附)型細胞 粘附:是大多數有機體細胞在體內 生存和生長發育的基本存在方式含義 兩方面結果 基于粘附特性，使細胞與細胞之間相互結合形成組織， 有機體的絕大多數細胞必須 粘附于一固相表面 才能生存和生長。培養時：這些細胞被放到體外環境中以后,同樣需要粘附于某一固相表面才能生存和生長，因而屬于粘附型細胞。粘附(錨定或錨著)依賴型(性)細胞：唯有粘附于固相表面才能生存的細胞 類型 細胞在體內、外的粘附方式：存在差異 體內：粘附是全方位 外形具有復雜的立體特

5、征 體外：多數情況，細胞只有一個附著平面 外形一般與體內時明顯不同 按照培養細胞粘附生長時的主要形態，可分為幾大類型 分類 根據形態大致的不同，主要2類： 上皮細胞型 成纖維細胞型 其它，不定型上皮細胞型 名稱：僅形態上似體內，實際上不完全等于-來源：來源于外胚層，內胚層細胞 如：皮膚及其衍生物 消化道，乳腺，肺泡 上皮性腫瘤形態：類似體內的上皮細胞 扁平，不規則多角形，中有圓形核 生長特點 易相連成片 相靠緊密相連成薄層 鋪石狀 生長時呈膜狀移動 很少脫離細胞群而單個活動 體外培養細胞類型（1）上皮細胞型成纖維細胞型 名稱：凡在培養中形態與成纖維細胞類似的來源：由中胚層間充質組織起源的組織

6、如：真正的成纖維細胞 心肌，平滑肌，成骨細胞，血管內皮形態：似體內成纖維細胞的形態 胞體梭形或不規則三角形 胞質向外伸出23個長短不等的突起 中有卵圓形核生長特點 排列成放射狀，漩渦狀 并不緊靠連成片， 細胞細胞接觸易斷開而 單獨行動 游離的單獨的成纖維樣細胞， 常有幾個伸長的細胞突起體外培養細胞類型（2）成纖維細胞型貼附生長型-類型1. 與體內同名的細胞不完全相同 如：形態相似的成纖維細胞，可不同來源 自同一動物不同組織的成纖維樣細胞相似但 發展趨向不同2. 培養細胞的形態不穩定 條件改變，細胞形態可有變化 培養細胞形態不穩定血清 Hela 高血清 低血清 成纖維細胞樣 上皮樣細胞 pH Hela 太酸或太堿 標準pH 成纖維細胞樣 上皮樣細胞 細胞密度 3T3 低密度 高密度 成纖維細胞樣 上皮樣細胞 生長狀態改變 懸浮或貼附 懸浮 貼附 圓形 成纖維或上皮樣 轉化與否 未轉化 轉化后 成纖維樣 可成上皮樣 懸浮生長型概念 培養時不貼附于底物而呈懸浮狀態生長 或以機械方法使保持懸浮狀態下生長來源 自血，脾或骨髓， 尤