1、實驗教學教案首頁本次實驗項目：肝臟谷丙轉氨酶活力測定本次實驗課時：驗證性4學時教學要求： 1掌握實驗原理，了解轉氨酶的性質及臨床意義 2. 掌握谷丙轉氨酶活力的測定方法重 點：實驗原理、轉氨酶的轉氨基作用。 教學手段及教具：課堂講授，學生實驗操作。講授內容及時間分配：課堂講授1相關知識 0.1 學時2實驗目的 0.1 學時3實驗原理 0.3 學時4實驗操作 0.2 學時實驗教學肝臟谷丙轉氨酶活力測定實驗的操作技術 3 學時參考資料生物化學實驗肝臟谷丙轉氨酶活力測定（驗證性）相關知識酶的提純基本操作程序及基本原則酶的活力單位（IU）的定義及酶活力的測定（酶的定量測定）測定酶活力一般經如下幾個步驟

2、選擇適宜的一定濃度的底物。確定酶促反應的條件。優化條件將一定量的酶液和底物溶液混合，確定反應時間（因要測定酶促反應初速度） 。反應到一定時間后取出反應液終止反應。測定產物的生成量。計算酶活力、酶的比活力。酶的比活力表示酶純度的指標每單位酶蛋白所含的活力單位數。對固體酶：比活力活力單位/mg酶蛋白 對液體酶：比活力活力單位/ml酶液比活力越大，酶的活力越大，含酶量或有活性的酶量越多。總活力、純化倍數和回收率酶活力測定方法不同酶選用不同的方法氨基酸轉氨基作用、聯合脫氨基作用谷丙轉氨酶及臨床意義: 查肝功為什么要抽血化驗轉氨酶指數呢？谷丙轉氨酶（ALT）和谷草轉氨酶（AST，GOT）是人體內糖和蛋白

3、質互相轉變所需的酶，人再生體內分布廣泛。ALT的分布以肝中最高，主要存在于肝細胞漿中，AST存在于肝細胞漿和線粒體內。其次是腎、心、骨骼肌、脾等。AST的分布則以心肌最高，其次為肝、骨骼肌、腎臟等。谷丙轉氨酶為細胞內酶，血清中活性很低，各組織器官中以心和肝的活性最高。當某種原因使細胞膜通過性，轉氨酶可大量釋放入血液，血清中轉氨酶活性。抽血化驗若轉氨酶比正常水平偏高則有可能肝組織受損破裂，肝細胞的轉氨酶進入血液。（結合乙肝抗原等指標進一步確定是什么原因引起的）常作為疾病診斷、觀察療效和預后的指標： 急性肝炎：S-GPT、S-GOT 心肌梗塞：S-GOT一、實驗目的了解轉氨酶的性質及臨床意義掌握谷

4、丙轉氨酶活力的測定方法二、實驗原理聯合脫氨基作用是大多數氨基酸的主要代謝方式，通過轉氨基作用與谷氨酸氧化脫氨基作用偶聯而完成。丙氨酸及酮戊二酸為谷丙轉氨酶的作用底物，利用內源性（肝細胞已有的）磷酸吡哆醛作輔酶，在一定條件下及時間作用后測定所生成的丙酮酸的量來確定酶活力。丙酮酸能與2,4二硝基苯肼結合，生成丙酸2,4二硝基苯腙，后者在堿性溶液中呈現棕色，其吸收光譜的峰為439530nm，可用于測定丙酮酸的含量。酮戊二酸也能與2,4二硝基苯肼結合，生成相應的苯腙，但后者在堿性溶液中吸收光譜為與丙酸2,4二硝基苯腙的吸光度有差別，在520nm波長比色時，丙酮酸2,4二硝基苯腙吸光度高出3倍。在520

5、nm處吸光度增加的程度與反應體系中丙酮酸與酮戊二酸的摩爾比基本上呈線性關系，故可以測定谷丙轉氨酶的活力。谷丙轉氨酶（簡稱 HYPERLINK /view/10817.htm t _blank GPT、 HYPERLINK /view/65582.htm t _blank ALT,在血清中的正常值是5(0)40U/L以內）催化反應：丙氨酸 + -酮戊二酸丙酮酸 谷氨酸丙氨酸丙氨酸GTP丙酮酸CH3CH3三、實驗器材、試劑、材料(一)材料新鮮豬肝臟（二）器材722型分光光度計、剪刀、吸管、玻璃均漿器（三）試劑標準丙酮酸溶液（ml相當于500ug）；準確稱取純化丙酮酸鈉62.5mg，溶于100ml

6、0.5mol/LH2SO4中，臨用前配制。谷丙轉氨酶底物；稱取L-丙氨酸0.90g及-酮戊二酸29.2mg，先溶于pH7.4 0.1mol/L磷酸緩沖液中，然后用mol/LNaOH調至pH7.4，再用pH7.4 0.1mol/L磷酸緩沖液稀釋至100ml，貯藏于冰箱內，可保存一周。0.1mol/L磷酸緩沖液（pH7.4）；稱取13.97g K2HPO4和2.69g KH2PO4溶于1000ml蒸餾水中。0.02%2,4二硝基苯肼；稱取2,4二硝基苯肼20mg溶于少量mol/L HCl中，加熱溶解后，用mol/L HCl稀釋到100ml。0.4mol/LNaOH溶液 生理鹽水四、實驗操作步聚準備

7、工作：打開水浴鍋恒溫37度；722E型分光光度計通電預熱。1.肝勻漿制備（每四組做1份，共用）將雞肝臟用生理鹽水沖洗，濾紙吸干，稱取肝臟0.25g，剪成小塊，置于玻璃勻漿管內（或小研砵中），加入2.25ml預冷的pH7.40.1%mol/L磷酸緩沖液，制成10%肝勻漿。吸取肝勻漿0.1ml于另一試管中，加入預冷的0.1mol/L磷酸緩沖液（pH7.4）4.9ml搖勻，為稀釋肝勻漿（稀釋50倍）。2. 谷丙轉氨酶活力測定（每組做1份）取試管4支按下表加液測定管標準管對照管空白管谷丙轉氨酶底物/ml0.50.5-混勻后，37稀釋肝勻漿/ml0.1-0.1-標準丙酮酸-0.1-水-0.1混勻后，372,4二硝基苯肼/ml0.5谷丙轉氨酶底物/ml-0.50.5混勻后，370.4mol/LNaOH5.05.05.05.0靜止10分鐘A520谷丙轉氨酶活力單位：規定酶在37五、實驗結果與討論1. 谷丙轉氨酶活力計算基礎：規定酶在372. 測定管對照管的吸光度值，與標準管相比算出其相當于丙酮酸含量。3. 根據公式計算：（注意稀釋倍數，理解公式）每毫升稀釋肝勻漿谷丙轉氨酶活力單位：每克肝臟谷丙氨酶的活力單位。4計算出比活力比活力活力單位/ml酶液六、注意事項分析（列表）各管與計算實驗結果（OD值）相關的物質成分。