1、 噬菌體治療中的免疫問題探討 王冉 張莉莉 何濤 龐茂達 周艷Summary：隨著抗生素耐藥性的快速增長，噬菌體治療被日益重視和關注，越來越多的科學家和醫生開始嘗試用噬菌體治療超級細菌感染。越來越多的噬菌體用于控制動物和人的細菌感染，但對在噬菌體治療中，噬菌體本身就是免疫原性微生物，作為外源物質進入人或動物機體后，免疫系統是如何反應的仍不清楚，本文擬對噬菌體治療中涉及的免疫問題進行探討，進一步闡明噬菌體治療過程中，噬菌體與免疫系統發生的生理作用、與吞噬細胞之間的互作、噬菌體引起的體液免疫和細胞免疫反應、中和抗體對噬菌體的清除及對噬菌體治療成效的影響。Key：噬菌體治療;吞噬細胞;體液免疫;細胞

2、免疫;免疫調節： S182;S852.4文獻標志碼： A：1002-1302（2019）16-0001-05噬菌體是一類細菌病毒的總稱，廣泛存在于自然界土壤、水、空氣、動物和人體的各個器官，數量是生物圈中細菌的約100倍，調控著生物圈中細菌群體的數量。因其能天然裂解細菌，被稱為細菌的天敵，被作為天然殺菌藥物進行開發，并發明了噬菌體療法，即用噬菌體治療動物或人的細菌感染，又稱噬菌體治療。噬菌體自發現以來就被證明在控制動物及人體細菌感染以及食品中細菌污染方面發揮了積極作用。2017年美國用噬菌體成功治愈了一位病人超級耐藥菌綠膿桿菌感染，美國FDA在2006年批準李斯特噬菌體混合物用于禽肉和芝士防止

3、細菌污染。但在噬菌體治療過程中噬菌體與動物和人的免疫系統如何作用一直不清楚。噬菌體治療主要發生在動物和人體，動物和人體經過長期進化，都有一套完善的自我保護功能的免疫系統，噬菌體作為外源物質進入機體后，會啟動機體免疫防護功能1-2。研究噬菌體與免疫系統以及免疫細胞的相互作用對合理設計噬菌體治療有重要意義。本文介紹噬菌體治療過程中與機體免疫系統的相互作用，同時，還討論這些相互作用對噬菌體治療的影響。1噬菌體治療過程與機體免疫系統的生理作用1.1噬菌體參與機體的過程噬菌體治療是將噬菌體作為一種藥物用于機體，以對抗細菌的感染。噬菌體治療的過程涉及與機體接觸如噬菌體給藥、體內吸收、分布、生物轉化（或稱代

4、謝）、衰亡及排泄的過程，這里的機體包括正常組織、正常菌群和致病細菌。噬菌體與機體接觸依賴于噬菌體給藥，給藥途徑包括口服、吸入、靜脈注射、肌肉注射、外用（涂抹）、局部給藥等。除局部給藥外，其他幾種給藥方式，噬菌體都可以進入到血液循環系統，被認為是系統給藥或全身給藥方式。噬菌體進入機體后，通過循環系統運輸、滲透、易位等途徑由循環系統運輸到其他組織或從某一組織運輸到另一組織，到達靶部位，在不同器官分布。噬菌體很容易通過腸道屏障和黏膜屏障被吸收，并在體內發生生物轉化（自我復制和衰亡）。噬菌體在機體內與各類物質和細胞發生相互作用，或增加或減少或衰亡，都稱為噬菌體在體內的代謝，也包括細菌或機體免疫系統作用

5、于噬菌體引起的噬菌體衰亡1。血液中噬菌體數量的減少也可能是滲透的結果，滲透是指噬菌體運動至局部感染組織或靶細菌上，它與血液中噬菌體的數量相關。網狀內皮系統（主要位于脾和肝）可以識別噬菌體上的蛋白從而將其從循環系統中清除。通過將噬菌體上的蛋白突變，可以使其不被網狀內皮系統識別，而這種突變體很容易通過選擇和富集在體循環中存時較長的噬菌體得到。這種噬菌體應用的優勢就是可以延長體內峰濃度的時間。1.2噬菌體與機體免疫系統的生理作用噬菌體生活在它們的獵物生活的地方（細菌存在的地方），它們構成了哺乳動物生理微生物群的一部分。在人體腸道中，雙鏈DNA和單鏈DNA噬菌體感染硬桿菌、類桿菌、變形桿菌和放線菌，而

6、RNA噬菌體被認為是與食物一起攝入的，并且只是短暫存在3-5。噬菌體可以黏附在不同動物的黏膜表面，減少這些界面的微生物定殖和病理學，同時提供非宿主源性免疫層6。有研究表明，裂解噬菌體可調節微生物群的組成，并支持其多樣性。噬菌體與宿主固有免疫細胞和上皮細胞的相互作用、細胞因子和噬菌體中和抗體可能反過來控制噬菌體組成4。噬菌體進入機體，經過機體處理并由抗原遞呈細胞（APCs）呈現給T細胞，啟動噬菌體中和抗體的產生并產生持久的記憶反應。因此，了解噬菌體如何繞過上皮屏障到達通常無菌的淋巴器官非常重要。研究發現，嚙齒類動物接受噬菌體不同給藥途徑（如口服、鼻內和靜脈注射）后，首先在血液中發現噬菌體，并在腎

7、臟、脾臟、肝臟和胸腺中積聚7。親代給藥的噬菌體快速分布到脾臟和其他器官，在這些器官中，噬菌體可存活超4 d8。口服給藥后，在血液和尿液樣本中檢測到噬菌體8。噬菌體穿透黏膜屏障的機制尚不清楚。目前有幾種假設：（1）噬菌體顆粒通過上皮細胞的轉錄;（2）噬菌體隱藏在細菌內通過特洛伊木馬機制繞過上皮屏障;（3）通過腸樹突細胞直接攝取管腔內容物;（4）易位，噬菌體通過受損的上皮屏障進入8-9。最后一種似乎最具說服力，有研究發現，在健康動物血液和組織中，腸道屏障完好，很難看到噬菌體易位和噬菌體血癥現象。但大劑量使用噬菌體或抗生素可能導致易感細菌死亡、連續釋放內毒素，引發炎癥，最終導致腸屏障受損。目前，負責

8、易位的受體尚不清楚7-9，需要更多地研究噬菌體黏附黏蛋白對于上皮易位的意義。2噬菌體-吞噬細胞之間的相互作用吞噬細胞的活性是免疫反應的基本功能之一。研究噬菌體與主要吞噬細胞群的相互作用，發現噬菌體不僅能直接殺菌，還可通過激活吞噬細胞來消除體內細菌。先天性免疫細胞的主要功能是識別和清除外來物質，并在適當和必要時對其進行適應性免疫反應。中性粒細胞和粒細胞是先天免疫的重要組成部分，是抵抗細菌和病毒侵入組織的前線防御。20世紀60年代，人們已經認識到白細胞不僅能夠以時間、濃度和溫度依賴的方式結合噬菌體，而且能夠內化并最終消除噬菌體。特異性受體是否參與噬菌體內吞作用尚不清楚，但B3整合素對T4噬菌體p2

9、6衣殼蛋白中賴氨酸-甘氨酸-天冬氨酸基序的識別可能與吞噬細胞中的1整合素有關。這個過程顯示促進噬菌體進入巨噬細胞和巨噬細胞活化的不同細胞機制。巨噬細胞激活會產生一系列殺微生物效應物和免疫調節細胞因子，它們協同作戰以消除入侵菌并影響免疫反應過程10。吞噬細胞參加了器官（特別是肝臟）中噬菌體的快速清除，肝臟中的噬菌體滴度迅速下降，常駐肝的吞噬細胞鼠Kupffer細胞是清除噬菌體的主要細胞。脾臟中脾巨噬細胞也參與噬菌體的清除，但清除速度比Kupffer細胞慢80%，所以脾臟中常有較高滴度的噬菌體11。其實，噬菌體被清除過程也是抗體呈現和啟動主動免疫反應的先決條件。因此，可以考慮在噬菌體治療中進行改進

10、，如選擇具有天然抗清除能力的噬菌體，或設計重組噬菌體來減少被清除，或可以避免或延遲噬菌體特異性適應性免疫反應的誘導，并延長具有免疫能力的噬菌體在體內的停留時間。2.1噬菌體對吞噬細胞吞噬功能的影響DHerelle第一個報告了噬菌體對吞噬功能的影響。他研究了志賀氏噬菌體對豚鼠“白細胞”吞噬志賀氏菌的作用。細菌、噬菌體和白細胞共培養10 min后，細胞的吞噬指數比對照組（無噬菌體的細菌培養細胞）顯著增加。同時發現，細菌對噬菌體的抗性發展與其對吞噬作用的抗性發展有關。DHerelle認為，噬菌體能顯著促進對細菌的吞噬作用，這種作用由噬菌體制劑中的可溶性因子介導3。但KanToch等發現T2噬菌體能降

11、低馬白細胞吞噬不同物種細菌的能力，包括金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和結核分枝桿菌，且這種作用被發現是劑量依賴性的噬菌體12;但發現，T5噬菌體不影響豚鼠粒細胞對大腸桿菌的吞噬作用。吸附在細菌上的噬菌體被吞噬細胞吞噬后仍可能保持生物活性。噬菌體治療加速了中性粒細胞的轉化，表現為未成熟形式粒細胞的數量增加，同時成熟細胞的數量減少。2.2噬菌體對吞噬細胞呼吸爆發的影響呼吸爆發是微生物吞噬過程中活性氧（ROS）快速增加的現象。一方面，呼吸爆發是先天免疫的重要組成部分，使吞噬細胞能夠消滅微生物。另一方面，ROS的過量產生可能導致細胞內氧化應激的誘導。病原菌和病毒均可在感染過程中誘導宿主細胞氧化應激13。因此

12、，研究噬菌體對ROS產生的影響對于驗證噬菌體治療的安全性至關重要。第一個評估噬菌體對ROS生成影響的研究表明，純化T4噬菌體制劑在體外單核細胞和中性粒細胞中均能誘導非常弱的呼吸爆發14。此外，噬菌體在與細菌預培養時以劑量依賴的方式減少大腸桿菌誘導的呼吸爆發，當噬菌體滴度較高（1091010 PFU/mL）時效果顯著。也有研究表明，噬菌體制劑均未在體外誘導單核細胞或中性粒細胞中產生明顯的呼吸爆發。2.3噬菌體對吞噬細胞其他功能的影響噬菌體對吞噬細胞遷移、細胞內細菌殺滅和Toll樣受體（TLRs）表達的影響研究發現，大多數噬菌體制劑在體外對人粒細胞和單核細胞的遷移沒有影響15-16。此外，噬菌體制

13、劑不影響這些細胞對細胞內細菌的殺滅。Toll樣受體是吞噬細胞受體中最重要的一類，參與先天免疫反應，包括炎癥反應16-17。TLR介導的單核細胞或巨噬細胞被致病菌和病毒激活，導致促炎細胞因子、ROS和一氧化氮的產生增加。TLR4和TLR2受體的天然配體是LPS。研究表明，純化制備T4沒有影響TLR2和TLR4的表達，但T4溶菌產物略微增加CD14和TLR4的表達。這些發現對噬菌體治療很重要，因為它們表明噬菌體制劑不太可能在TLR依賴的機制中發揮促炎活性。3噬菌體引發的適應性免疫反應噬菌體作為一個具有免疫原性的微生物，可以引發適應性免疫，最早的證據可追溯到噬菌體（如X174和T4樣噬菌體）主動免疫

14、的研究18。腸桿菌噬菌體X174。X174含有1個小的圓形單鏈DNA基因組，病毒顆粒對革蘭氏陰性病原體外膜上的脂多糖有特異性。專家用X17419-20免疫豚鼠和兔子的試驗中，發現啟動和增強了體液免疫反應，發現了噬菌體特異性短壽命抗體IgM（19 s）和記憶反應（IgG/7 s）的存在和較長的半衰期。這種噬菌體誘導產生中和抗體反應呈劑量依賴性。T2和T4樣噬菌體。T2和T4噬菌體有雙鏈DNA基因組和溶解腸道細菌功能。T2噬菌體的抗體：在大鼠和兔血清中發現抗T2-IgM和IgG與噬菌體頭部和尾部的結合。81%的受試人血清中檢測到抗T4樣噬菌體抗體。對幾種噬菌體頭部蛋白進行免疫組化，發現有中和活性。

15、小鼠體內試驗發現，免疫誘導產生的高效價抗體對T4具有中和活性。大量文獻表明，熱滅活的噬菌體失去了它們的免疫刺激能力，而紫外線照射保持了活噬菌體制劑引起的免疫原性（如噬菌體誘導的抗體反應）21。巨噬細胞與T2噬菌體共培養過程中，一種RNase敏感物質能夠刺激抗體合成。噬菌體衍生的RNA能誘導產生干擾素22，噬菌體衍生的RNA可以直接促進B細胞的活化和噬菌體中和抗體的合成。噬菌體刺激誘導B細胞反應需要的成分有23-24：（1）免疫原性噬菌體蛋白，通過BCR實現特異性識別;（2）激活B細胞共刺激TLR的配體（例如核酸），例如源自（活的）PHA的RNA，GES（危險信號）;（3）APC介導的輔助T細胞

16、活化。從理論上講，可以通過預先選擇免疫刺激性低的噬菌體來避免適應性免疫應答，而提高噬菌體治療效果。3.1噬菌體引起的體液免疫抗病毒抗體是抗病毒免疫應答的主要組成部分之一。在致病病毒入侵時，這些抗體表現出4種活性：病毒中和、抗體依賴性細胞毒性、抗體依賴性細胞介導的病毒抑制和吞噬作用25-26。在大多數噬菌體免疫研究中檢測到的抗體是中和抗體。噬菌體治療中，中和抗體通過結合噬菌體尾部來抑制細菌感染27。但要說明的是，噬菌體與抗體結合并不意味著噬菌體的失活。抗噬菌體的中和抗體被認為是影響噬菌體治療效果的最重要因素之一。有研究發現，這些中和抗體可能會降低噬菌體的治療效果。首先，未免疫的人和動物的血清實際

17、上具有低水平的噬菌體抗體（所謂的“天然抗體”）。即在噬菌體給藥前，某些個體的血清中就存在噬菌體中和抗體，這是因為我們周圍的環境、食品和正常微生物群中都存在大量的噬菌體，人類和動物對噬菌體抗原的持續自然“免疫”。第二，對動物進行噬菌體系統性給藥后，會產生高效價中和抗體。第三，在缺乏B細胞的小鼠中，噬菌體從小鼠血液中清除的速度比野生型小鼠要慢一些28。這些數據表明，中和抗體確實會大大降低噬菌體治療的效果，但噬菌體引起的體液免疫反應的強度因噬菌體類型而異;一些噬菌體是非常弱的免疫原，需要反復注射，并輔以佐劑以誘導才檢測到抗體滴度。對噬菌體的抗體反應似乎也依賴于患者最初的反應，可分為“反應”組和“無反

18、應”組29。研究噬菌體產生的抗體時，應考慮到噬菌體顆粒本身刺激產生中和抗體，噬菌體制劑中存在的細菌細胞的某些組分如脂多糖（LPS）也會刺激產生中和抗體。因此，在設計（解釋）噬菌體中和抗體的研究和噬菌體治療時，需要考慮噬菌體制劑中脂多糖污染的情況。3.2噬菌體引起的細胞免疫噬菌體治療給藥也會引起某種形式的細胞免疫。有關噬菌體引起的細胞免疫數據與噬菌體引起的體液免疫相比是很少的。有一篇報告明確指出，給藥噬菌體可以在體外和體內引起實質性細胞反應。這項研究中，Langbeheim等研究了豚鼠對MS-2噬菌體和噬菌體外殼蛋白結合物的反應27。動物被抗原致敏，體內致敏通過皮內注射試驗抗原進行評價，導致局部

19、紅斑和硬結。通過測量淋巴結細胞對試驗抗原的增殖反應來確定體外細胞致敏。所有動物體內對注射的噬菌體都有強烈的反應。整個噬菌體顆粒比結合物誘導的敏化更強。用噬菌體致敏的動物淋巴細胞對病毒有強烈的反應，但對結合物沒有反應。也有人發現，T細胞在體內對噬菌體的滅活作用不明顯。T細胞在病毒感染反應中起著重要作用，病毒特異性CD8+T細胞和CD4+ T細胞都參與了在這種感染過程中觸發的適應性免疫28。4噬菌體蛋白引起的免疫反應噬菌體治療引起的免疫反應相當復雜，因為大多數噬菌體的結構非常復雜，有許多不同的外殼蛋白暴露在外，以進行相互作用。因此，噬菌體產生的免疫反應一般是衣殼蛋白多組分活性的結果。通過將這種作用

20、分解為特定的蛋白質，我們可以獲得一種處理抗噬菌體免疫的敏感工具29。噬菌體最引人注目的作用是它們會誘導產生抗體。在噬菌體研究早期階段，噬菌體蛋白的抗原性和抗體誘導作用是表征進化相關性的工具。這一觀點被稱為血清學交叉反應，因為這些反應的強度反映了噬菌體之間的相關性，通常隨著物種間進化距離的增加而減少。噬菌體衣殼蛋白與抗血清的相互作用反映了噬菌體之間的同源性和相似性30。現在我們知道噬菌體基因組的同源性通常積累在特定的保守區域（甚至是一個基因的部分），而其他區域是高度可變的。同樣，噬菌體衣殼上抗原的排列也不均勻，也就是說，噬菌體之間潛在的相似性可能只發生在特定的部位29-31。一些衣殼成分對噬菌體

21、具有抗原特異性，而另一些則與不同種類的噬菌體共享。特定噬菌體基因產生的抗體也是識別噬菌體基因功能的主要工具之一。結構蛋白可以通過特定抗體定位在衣殼上，從而提供有關病毒顆粒排列的準確信息32。噬菌體展示的多肽間的互作研究發現，噬菌體表面肽的性質與先天免疫系統反應之間存在依賴。天然抗體，即哺乳動物血清中存在的抗體，可以識別噬菌體并啟動補體激活。然而，有羧基末端賴氨酸或精氨酸殘基的衣殼，可通過結合大鼠體內的C反應蛋白來保護噬菌體免受補體介導的失活33。噬菌體清除機制涉及網狀內皮系統的過濾，這通常被認為是非免疫哺乳動物清除噬菌體的主要途徑。衣殼蛋白上主要基因的單一突變（G突變為A）導致賴氨酸取代谷氨酰

22、胺，這影響了該噬菌體在小鼠體內被清除的速度。這表明，噬菌體抗原結構中這種細微差異能夠調節噬菌體與免疫系統的相互作用，對于其在治療中的潛在用途具有重要性。對細菌或生物膜的黏附可能減緩噬菌體被清除的速度。生物信息學研究表明，Ig樣結構域在噬菌體基因組中非常常見，這意味著一些衣殼蛋白在其他噬菌體菌株中也有類似的黏附調節作用。受體靶向性，即化學修飾，也影響噬菌體在體內的清除時間。Molenaar等發現半乳糖或琥珀酸基團與噬菌體外殼蛋白的結合大大縮短噬菌體的血漿半衰期30。值得注意的是，通過將單甲氧基聚乙二醇（MPEG）與蛋白質結合對噬菌體進行化學修飾，降低了噬菌體的免疫原性;聚乙二醇化噬菌體會導致其半

23、衰期顯著增加34。這表明，這種方法可能有助于提高噬菌體的治療效果。5噬菌體的中和抗體對噬菌體的清除在大腸桿菌和銅綠假單胞菌耐藥菌的菌血癥小鼠模型中，給藥各噬菌體109 PFU后的第10天檢測到噬菌體中和抗體IgG水平35-36。在30 d和40 d后，IgG水平分別達到最大值。也有報道，使用相似劑量（1010 PFU）噬菌體，只有在3次重復的噬菌體注射后才能被檢測到噬菌體中和抗體IgM和IgG37。用免疫缺陷小鼠和野生型小鼠研究噬菌體中和抗體清除噬菌體情況38-40，結果發現，野生型小鼠給藥1 h內噬菌體開始被清除，而免疫缺陷小鼠和B細胞缺陷小鼠的噬菌體滴度持續存在，未發現被清除。體內研究發現

24、，噬菌體中和抗體能清除腸道和血液循環中的噬菌體。抗體濃度高的患者中，噬菌體在4 d內被完全清除36，而在抗體滴度很低的患者中，噬菌體保持可檢測狀態長達7周。說明，噬菌體中和抗體具有清除體內噬菌體的能力。6噬菌體中和抗體與噬菌體治療效果之間的關系噬菌體中和抗體會導致噬菌體治療失敗。研究大腸桿菌特異性單鏈DNA噬菌體M13發現，噬菌體中和抗體清除噬菌體與結合抗原導致的細菌細胞滲透的機械障礙有關。最近一項對20例金黃色葡萄球菌感染患者的研究中發現，噬菌體中和抗體IgM有顯著的誘導作用41-42。許多研究41-43表明，噬菌體特異性抗體的存在會干擾治療效果。這在慢性感染中尤其相關，在慢性感染中，用同一

25、噬菌體反復治療可增強體液免疫反應。相反，噬菌體特異性免疫球蛋白的誘導似乎與急性感染的治療無關，因為噬菌體的抗菌作用在抗體形成之前就已生效。在開始治療前，仍然推薦先對患者血清進行預篩選以確定是否存在抗噬抗體是明智的。但這種延遲可能與急性治療不相容。最近的一份報告中提出了一種可能的解決方案，即將噬菌體包裝成脂質體不僅能促進細胞吸收到巨噬細胞中，而且避免了噬菌體中和抗體的結合和中和44。在這里，通過生物技術去除編碼免疫原性蛋白的噬菌體基因可能是一種非常有趣的替代產品，以維持或挽救噬菌體的效力。這種方法需要對噬菌體進行廣泛的鑒定，以全面鑒定潛在的免疫原性噬菌體蛋白，考慮到目前應用的方法，也很難實現。當

26、最終基因工程裂解噬菌體應用于患者時，又可能提出更多的監管問題。7結語綜上所述，絕大多數數據表明，高滴度噬菌體治療應用會刺激宿主免疫系統發生免疫反應，部分研究發現了劑量和時間依賴的免疫效應45。此外，系統性抗噬菌體的免疫反應需要與治療持續時間和管理途徑相結合來評估。到目前為止，還沒有在患者或動物模型中得到系統的解決。因此，在今后需要重點關注3個主要領域是：（1）通過模式識別受體的免疫識別主要通過在感染部位招募噬菌體來幫助解決感染。噬菌體介導的天然免疫細胞活化主要是基于對噬菌體衍生的DNA和RNA的識別。因此，特定的模式識別受體結合和免疫激活的程度將因噬菌體類型、噬菌體劑量和核酸合成活性而不同。（

27、2）噬菌體的免疫原性促進了噬菌體中和抗體的形成，這種抗體會阻礙治療成功，并隨著反復用藥而增加。盡管核酸傳感的模式識別受體驅動了中和抗體的生成，產生的中和抗體直接指向噬菌體上的免疫原性蛋白。在選擇治療用噬菌體時應考慮到：抗體的誘導是高度可變的，且噬菌體具有免疫原性。盡管存在挑戰，噬菌體基因工程消除免疫原性蛋白的表達可能是一種不錯的方法，以避免由于噬菌體特異性免疫球蛋白的存在而導致治療無效。目前，避免模式識別受體介導的免疫效應將減少噬菌體中和抗體的產生。可以通過使用自增強噬菌體或改進的劑量范圍研究來實現。（3）噬菌體特異性IgG或IgA可以限制噬菌體的增殖速度。高抗體水平和FC介導的巨噬細胞吞噬噬

28、菌體和抗體混合物加速了機體中噬菌體的清除46。尚不清楚哪些噬菌體特異性因子對這種清除機制有影響。因此，有必要進行更深入的研究，以闡明由于缺乏免疫控制而導致的噬菌體持續存在是否有利于在體內選擇抗噬菌體的菌株。Reference：1BarrJ J. A bacteriophages journey through the human bodyJ. Immunol Rev，2017，279：106-122.2Delmastro P，Meola A，Monaci P，et al. Immunogenicity of filamentous phage displaying peptide minoto

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