1、PCR（DNA聚合酶鏈反應）聚合酶鏈反應體外擴增DNA已經成為應用最廣泛的一種生物技術。最初采用Klenow酶來擴增DNA，但每次加熱變性DNA都會使酶失活，需要重新添加DNA聚合酶，知道用耐熱的TaqDNA聚合酶代替后，這項技術才成熟，從而得到各方面的應用。該技術基本步驟是：設計一對引物以便有效擴增所需的DNA序列，并盡量減少可能產生的非特異產物優化反應體系，以便獲得最好的擴增效果。該反應體系包括適量模板（1ng-0.001ng），引物（-100pmol/100l），四種dNTP（200mol/L），TaqDNA聚合酶（2U/100l），和適量鎂離子選擇三個穩定進行熱循環。這三個溫度為：變性

2、：94攝氏度，45-60s；退火：（根據引物與模板的Tm值來定，一般為兩引物中較低的Tm值減2），1mim；延伸：72攝氏度，1分鐘，開始時熱變性5-10min，熱循環25-30個周期，最后延伸10min擴增完成后取出一定量反應產物，檢測擴增結果。最普通的檢測方法是進行凝膠電泳，用溴化錠染色，在紫外光下檢查結果PCR技術十分靈敏，少數幾個模板分子即可檢查出來，其擴增效率非常高，通常可擴增十的六次方倍。產量公式如下：Y=產量 x=擴增效率 n=循環次數該技術可擴增任意DNA片段，只要設計出片段的兩端引物。DNA正鏈5端的引物叫做正向引物、右向引物、上游引物、有義鏈引物及Watson引物，簡稱5引

3、物。與正鏈3端互補的引物叫做反向引物、左向引物、下游引物、反義鏈引物及Crick引物，簡稱3引物。PCR的最適條件首先是要設計好引物，設計引物的主要原則有引物長度要大于16個核苷酸，一般為20-24個核苷酸，因為4的十六次方大于哺乳動物單倍體基因組，故16個以上的核苷酸引物可防止隨即結合引物與靶序列間的Tm值不應過低（一般不低于55攝氏度）。小于三十個核苷酸的引物按公式Tm=（G+C）4+（A+T）2來計算變性溫度。引物不應該有發夾結構，即不能有4bp以上的回文序列兩引物間不應有大于4bp以上的互補序列和同源序列，在3端不應該有任何互補堿基。實驗證明，兩引物3端如果有兩個互補堿基，經PCR可產

4、生顯著的引物二聚體。引物中堿基的分布盡可能均勻，G+C含量應接近百分之五十。PCR的應用：遺傳病和某些疑難病的診斷以及孕婦的產前檢查病原體的檢測。某些惡性疾病用一般微生物學、生化和免疫學技術無法查出病原體時，可用PCR來檢測法醫和刑偵鑒定。PCR可靈敏檢測出親屬間的親緣關系，并對生物殘留的痕量樣品進行鑒定。因此，對刑偵極為有用癌細胞的檢查基因探針的制備基因組測序、染色體巡視cDNA庫的構建基因突變的分析和定位誘變DNA重組基因的分離和克隆一個學生在進行PCR實驗時，預測可能出現的情況：（1）不小心一個引物忘記加入到反應體系中（2）在初始樣品中只有一個拷貝，其中一條模板鏈斷裂（3）退火溫度設為4

5、5攝氏度（4）熱蓋溫度設定為95攝氏度（5）一個引物能與初始DNA的多個位點互補。變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現假陰性；退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。蓋子的高溫主要是為了防止試管內水蒸氣的形成，減少反應體系的損失。較好的 HYPERLINK /s?wd=PCR%E4%BB%AA&tn=44039180_cpr&fenlei=mv6quAkxTZn0IZRqIHckPjm4nH00T1Y1mv7hPAN-mWPbP16snjD30ZwV5Hcvrjm3rH6sPfKWUMw85HfYn

6、jn4nH6sgvPsT6KdThsqpZwYTjCEQLGCpyw9Uz4Bmy-bIi4WUvYETgN-TLwGUv3EPjbzPH0vrjDs t /question/_blank PCR儀反應金屬槽可以達到的溫度在-498之間，而PCR反應進行階段，溫度循環控制更多處于Taq酶活性最適溫度72與DNA解鏈溫度94之間。在這個溫度區間內，反應液中的水分很容易蒸發掉，結果造成反應體系的不穩定，甚至反應體系中水分全部蒸發掉。這也是前人做PCR反應加入礦物油進行液封的原因。熱蓋溫度105，超過水的沸點，避免高溫產生的水蒸氣凝結在PCR管蓋上，可以防止水分蒸發后對PCR反應體系造成較大影響。是PCR反應成功的保證PCR反應中，（1）檢