1、第十六章抗生素類藥物的分析藥物分析教研室1Contents概 述1-內酰胺類2氨基糖苷類3四環素類4高分子雜質檢查52第一節 概述在低微濃度下即可對某些生物（病原微生物）的生命活動有特異抑制作用的化學物質的總稱抗生素（antibiotics）定義3來源生物合成（發酵） 化學合成或半合成特點化學純度較低-同系物、異構體及降解物多活性組分易發生變異-微生物菌株或者發酵條件的改變都會導致產品質量發生變化穩定性差-活性中心往往是活潑基團，不穩定4按化學結構和性質分類-內酰胺類（-lactam）含有-內酰胺類結構的抗生素，如青霉素、頭孢菌素、碳青霉素烯類等等；四環素類：含有四并苯的木考核，如四環素、土霉

2、素、金霉素等；氨基糖苷類：結構中含有氨基糖苷和氨基環醇，如鏈霉素、慶大霉素等大環內酯類：含有大環內酯作為配糖體，如紅霉素，螺旋霉素等；多肽類：抗菌肽，萬古霉素、多粘菌素B等；抗腫瘤類：絲裂霉素、平陽霉素等；其他類抗生素藥物的分類5按照生物來源分類細菌產生的抗生素 如多粘菌素和桿菌肽。真菌產生的抗生素 如青霉素及頭孢菌素，現在多用其半合成產物。放線菌產生的抗生素 放線菌是生產抗生素的主要來源。其中鏈霉菌和小單孢菌產生的抗生素最多。常見的抗生素包括鏈霉素、卡那霉素、四環素、紅霉素、兩性霉素B等。6抗菌藥物的作用機制 根據對病原菌的作用靶位，將抗生素的作用機制分為四類抑制細菌細胞壁合成影響胞漿膜通透

3、性（多粘菌素）抑制蛋白質合成（大環內酯類、氨基糖甙類）抑制核酸代謝：葉酸代謝；核酸合成（喹諾酮、磺胺類）7抗菌藥物的主要作用部位喹諾酮類林可霉素類氨基糖苷類酮康唑環絲氨酸利福平紅霉素制霉菌素桿菌肽甲氧芐胺嘧啶四環素類兩性霉素B萬古霉素磺胺藥氯霉素多粘菌素類-內酰胺類核酸合成細胞蛋白合成細胞膜滲透性細胞壁8耐藥分類(一)固有耐藥（intrinsic resistance）固有耐藥性指細菌對某些抗菌藥物的天然不敏感。固有耐藥性細菌稱為天然耐藥性細菌，其耐藥基因來自親代，由細菌染色體基因決定而代代相傳的耐藥性，存在于其染色體上，具有種屬特異性。如腸道桿菌對青霉素的耐藥，固有耐藥性始終如一并可預測。（

4、二）獲得耐藥（acquired resistance）在原先對藥物敏感的細菌群體中出現了對抗菌藥物的耐藥性，這是獲得耐藥性與固有耐藥性的重要區別。細菌的耐藥機制9細菌的耐藥機制產生鈍化酶使抗菌藥物失效藥物作用靶位的結構和數量改變抗菌藥不易與細菌結合主動外排機制藥物被泵出菌體外10產品穩定性差分子結構大多不穩定，降解后療效下降、失效或增加毒副作用發酵過程不易控制易受污染生產工藝復雜發酵液中雜質 無機鹽、脂肪、各種蛋白質、各種降解產物、色素、熱原、毒性物質 抗生素質量的復雜性 11抗生素質量分析生物學法、物理化學法 鑒別：理化方法(主要方法)、微生物法官能團的顯色反應，如：-內酰胺環的羥肟酸鐵反應

5、；鏈霉素的麥芽酚反應、坂口反應；光譜法：紅外光譜及紫外吸收光譜的鑒別。色譜法：HPLC和TLC法，采用標準品對照品對照法；生物學法：比較抑菌能力，現已少用。抗生素質量分析12 檢查：影響產品穩定性的檢查項目：結晶性、酸堿度、水分或者干燥失重等控制有機和無機雜質的項目：溶液澄清度與顏色、有關物質、殘留溶劑、熾灼殘渣、重金屬等；與臨床安全性有關的檢查項目：異常毒性、熱源或細菌內毒素、降壓物質、無菌等13 效價：每毫升或每毫克中含有某種抗生素的有效成分的多少。由單位（u）或微克（g）表示。 各種抗生素的效價基準是人們為了生產科研方便而規定的。 1mg青霉素鈉定為1670單位；1mg慶大霉素定為590

6、單位。 相應的鹽可以通過分子量與標準鹽類進行換算。抗生素活性表示方法14含量/效價測定： 微生物法：與臨床療效吻合,靈敏度高，結果直觀，適用范圍廣；但操作復雜費時，誤差大 理化方法：準確度與專屬性較高, 且操作簡便；但與臨床療效有偏差15第二節 內酰胺類6-aminopenicillanic acid簡稱6-APA青霉素類7-aminocephalosporanic acid,簡稱7-ACA頭孢菌素類氫化噻唑環氫化噻嗪環16第二節 內酰胺類 青霉素(芐青霉素) (penicillins)氨芐西林阿莫西林17第二節 內酰胺類頭孢氨芐頭孢拉定頭孢羥氨芐頭孢噻吩鈉18第二節 內酰胺類一、結構與性質1

7、.酸性（羧基） pKa 2.5-2.8，酸性較強。堿金屬鹽水溶性好，有機堿鹽難溶于水。2.手性C （旋光性）19第二節 內酰胺類3.UV青霉素類：苯環取代基頭孢菌素類：母核有共軛結構260nm204. 內酰胺環(四元環張力+酰胺鍵 ) 第二節 內酰胺類干燥條件較穩定，溶液不穩定某些氧化劑、金屬離子、溫度21第二節 內酰胺類二、鑒別試驗(一)色譜法HPLC (tR)TLC (Rf)(二)光譜法IR UVNMR22第二節 內酰胺類23第二節 內酰胺類(三)呈色反應1）羥肟酸鐵反應內酰胺環內酰胺類NH2OHHClNaOH羥肟酸 Fe3+ H+顯色（紅、棕、褐）2）類似肽鍵（-CONH-）a.茚三酮反

8、應-氨基 24第二節 內酰胺類b.雙縮脲反應內酰胺類 堿性酒石酸銅紫色25第二節 內酰胺類3）其他呈色反應（偶合）青霉素鉀和青霉素鈉呈紅棕色(四)各種鹽的反應焰色反應K+、Na+26第二節 內酰胺類(聚合物、有關物質、異構體等)1.聚合物頭孢他啶中聚合物測定分子排阻色譜凝膠色譜分子篩機制 主成分自身對照法 面積歸一化法 限量法 自身對照外標法 萄聚糖凝膠立體網狀結構圖三、雜質檢查27第二節 內酰胺類2.有關物質與異構體頭孢呋辛酯中有關物質和異構體的檢查 取本品適量，精密稱定，加流動相制成約含0.25mg/ml的溶液，作為供試品溶液；精密量取適量，加流動相制成2.5 g/ml的溶液，作為對照溶液

9、。取對照溶液20l注入液相色譜儀，調節儀器靈敏度，使主成分峰高約為記錄儀滿量程的10%，再取供試品溶液和對照品溶液各20l，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主峰保留時間的3.5倍，供試品溶液如顯雜質峰，量取各雜質峰面積的和，其中E異構體峰面積不得大于對照溶液主峰面積之和(1.0%)，3-異構體峰面積不得大于1.5倍(1.5%)，其余單個雜質峰面積的和不得大于3倍(3.0%)。(供試品溶液中任何小于對照品溶液主峰面積之和0.05倍的峰可忽略不計)28青霉素鈉(鉀)的吸光度檢查：本品加水制成每1mL含有1.80mg的溶液，照UV-Vis法，在280nm波長處測定吸光度，不得大于0.10；在264n

10、m波長處有最大吸收，吸光度應為0.80-0.88.該法264nm處吸收值用來控制青霉素鈉(鉀)的含量，280nm處吸收值用來控制雜質的含量。3.UV第二節 內酰胺類29第二節 內酰胺類4.有機溶劑：用GC法或者HPLC法5.結晶性第一法(偏光顯微鏡法)第二法(X射線粉末衍射法)30四、含量測定 碘量法 汞量法 酸堿滴定法 羥肟酸比色法 HPLC法第二節 內酰胺類31阿莫西林克拉維酸鉀片色譜條件與系統適用性試驗 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以磷酸鹽緩沖液(取磷酸二氫鈉7.8g，加水900 ml溶解，用磷酸或10mol/L氫氧化鈉溶液調節pH值至4.40.1，加水稀釋至1000ml)-甲醇(9

11、5:5)為流動相；流速為0.7ml/min；檢測波長為220nm。阿莫西林峰與克拉維酸峰的分離度應大于3.5 測定法 取本品10片，置1000ml量瓶中，加水適量，振搖使溶解，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取10ml，置50ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液10l注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取阿莫西林對照品與克拉維酸對照品各適量，加水溶解，制成每1ml中含阿莫西林0.5mg和克拉維酸0.25mg的混合溶液，同法測定。按外標法以峰面積分別計算供試品中C16H19N3O5S和C8H9NO5的含量。第二節 內酰胺類32第三節 氨基糖苷類 堿性環己多元醇+氨基糖苷鏈霉素(Streptom

12、ycin)33巴龍霉素(paromomycin)D-葡萄糖胺脫氧鏈霉胺巴龍胺D核糖巴龍霉糖巴龍二糖胺第三節 氨基糖苷類34慶大霉素(Gentamycin)35一、結構與性質1）溶解度（氨基、羥基）：水溶性2）堿性（氨基）：臨床應用其硫酸鹽；溶于水，但不溶于有機溶劑；3）旋光性（糖）：多個手性碳4）穩定性（苷）：強酸、堿條件均可水解；臨床使用時對pH值有很高的要求；5）紫外吸收光譜第三節 氨基糖苷類361.茚三酮反應羥基胺類,-氨基酸二、鑒別反應第三節 氨基糖苷類372. Molisch 試驗 五碳糖或六碳糖結構紅紫色羥甲基糠醛(含六碳糖結構氨基糖苷類酸性水解產物)a.-萘酚b.萘酮藍紫色第三節

13、 氨基糖苷類383. N-甲基葡萄糖胺反應（Elson-Morgan反應）乙酰丙酮OH-吡咯衍生物對二甲氨基苯甲醛H+紅色第三節 氨基糖苷類394.麥芽酚反應鏈霉糖特有反應H+第三節 氨基糖苷類40紫紅麥芽酚415.坂口反應鏈霉胍特有反應（或-萘酚）42坂口反應麥芽酚反應N-甲基葡萄糖胺反應第三節 氨基糖苷類436.硫酸鹽反應7.色譜法：TLC和HPLC法8.光譜法：IR、UV第三節 氨基糖苷類44三、雜質檢查1.鏈霉素中鏈霉素B（甘露糖鏈霉素）的檢查來源：發酵中產生方法：TLC中的對照品法2.硫酸奈替米星中西索米星的檢查(TLC)3.慶大霉素C組分的測定第三節 氨基糖苷類45四、含量測定微生

14、物檢定法平行反應，檢測同等量下供試品和對照品對微生物的抑制作用；管碟法：利用抗生素在瓊脂培養基內的擴散作用，比較標準品和供試品對菌群產生的抑菌圈大小；濁度法：通過抗生素在液體培養基中對細菌生長的抑制作用，通過測定培養后細菌濁度值的大小，比較標準品和供試品抑菌程度，測定供試品效價；-該法優點：靈敏度高、量少、直觀；與臨床要求一直；使用范圍廣；是效價測定的最基本方法；目前分子結構復雜、多組分抗生素，首選該法測效價。-該法缺陷：操作步驟多，時間長，誤差大。第三節 氨基糖苷類46HPLC法有紫外吸收紫外、熒光檢測器無紫外吸收衍生化； 電化學檢測器或蒸發光散射法第三節 氨基糖苷類47第四節 四環素類AB

15、CD123456789101112四個并苯或萘并萘48一、結構與性質1）兩性： -OH酸性 N(CH3)2堿性 Ca2+、Mg2+生成不溶性鹽；Fe3+形成紅色配合物； Al3+形成黃色配合物 ；pH3 7.5 多價陽離子與酚二酮熒光 與酸、堿均可成鹽； 臨床多用鹽酸鹽； 強酸或強堿中溶解度 2）旋光性3）與金屬離子絡合(酚羥基、烯醇基)第四節 四環素類494）UV和熒光 鹽酸土霉素 經酸或堿降解，呈綠色熒光，加熱轉為藍色； 鹽酸金霉素 經堿降解，呈藍色熒光；鹽酸四環素 經堿降解，呈黃色熒光。可區別不同四環素類抗生素50弱酸性（pH2-6） A環C-4異構化 差向四環素酸性（pH 2） C環脫

16、水 脫水四環素堿性 C環開環，形成內酯 異四環素5）不穩定性A.差向異構化藍色熒光淡黃黑第四節 四環素類51AApH2.06.0（氫鍵，土霉素、多西環素不易差向異構化）第四節 四環素類52B.酸性脫水降解max = 445nmmax = 435nmDDDCBBCBC第四節 四環素類53C.堿性脫水降解OH-第四節 四環素類54二、鑒別試驗1、HPLC2、TLC (正相分配薄層色譜)薄層板中加入EDTA克服痕量金屬造成的拖尾現象3、IR4、UV：最大吸收波長和制定濃度下的吸光度；5、顯色法濃硫酸三氯化鐵第四節 四環素類5556三、雜質檢查1.有關物質HPLC2.雜質吸光度UV淡黃色黑色脫水四環素 橙紅色差向脫水四環素 磚紅色第四節 四環素類57第五節 高分子雜質的檢查高分子雜質：藥物中分子量大于藥物本身的雜質的總稱，10005000Da。與過敏反應有關。生產過程貯存過程使用不當高分子雜質內源性(藥物自身聚合物 )外源性(蛋白、多肽、多糖及其與藥物的結合物 )發酵過程控制重點來源581.基本結構青霉素族多肽（青霉素噻唑多肽）聚合物母核參于反應側鏈參于反應頭孢菌素族與母核有關的N型聚合反應側鏈參與反應的L