1、蛋白質(zhì)定量測定技術(shù)第1頁，共24頁。本章內(nèi)容總蛋白質(zhì)測定的基本原理與方法白蛋白的測定球蛋白的測定第2頁，共24頁。臨床檢驗中測定蛋白質(zhì)的幾種情況測定血清總蛋白蛋白質(zhì)電泳以獲取各類蛋白質(zhì)所占比例測定個別蛋白質(zhì)第3頁，共24頁。蛋白質(zhì)測定的基礎(chǔ)重復的肽鍵結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)中所含的酪氨酸和色氨酸殘基對酚試劑反應(yīng)或紫外吸收與色素的結(jié)合能力沉淀后的濁度或光折射改變（上述原理不但適合于總蛋白質(zhì)的測定，也可用于分離出來的蛋白質(zhì)組分的測定）第4頁，共24頁。凱氏定氮法假設(shè)：純蛋白質(zhì)，含氮量為16操作步驟： 高溫,濃酸 OH-蛋白質(zhì)（N）NH4NH3硼酸吸收用酸堿滴定或納氏試劑測定氮含量按6.25g蛋白質(zhì)/1g氮計算蛋

2、白質(zhì)含量第5頁，共24頁。雙縮脲法（Biuret）臨床上首先推薦的蛋白質(zhì)定量方法,操作簡便快速，不同蛋白質(zhì)之間差異小。蛋白質(zhì)中的肽鍵（CONH）在堿性溶液中能與銅離子作用產(chǎn)生紫紅色絡(luò)合物。此反應(yīng)同兩個尿素分子縮合后生成的雙縮脲在堿性溶液中與銅離子作用形成紫紅色的反應(yīng)形似，故稱為“雙縮脲反應(yīng)”至少含有兩個CONH基團才能反應(yīng)，故二肽與氨基酸上述現(xiàn)象第6頁，共24頁。酚試劑法（Lowry法）蛋白質(zhì)中肽鍵（烯醇化肽鍵）與Cu2絡(luò)合，釋放電子。電子使酚試劑（磷鎢酸和磷鉬酸）還原蛋白質(zhì)中酪氨酸、色氨酸以及半胱氨酸、組氨酸能使磷鎢酸和磷鉬酸同時失去氧原子而還原磷鎢酸和磷鉬酸還原后生成藍色混合酸。本法靈敏，

3、受多種還原性物質(zhì)干擾，不同蛋白質(zhì)之間差異大第7頁，共24頁。BCA法BCA: Bicinchoninic acid，二喹啉甲酸與Lowry法相似，靈敏度相近，但BCA在堿性條件下更穩(wěn)定在堿性條件下與Cu2+絡(luò)合，同時將其轉(zhuǎn)變?yōu)镃u，后者能與BCA反應(yīng)形成強的紫色，在562nm測定可反映蛋白質(zhì)的濃度呈色的深淺除與蛋白質(zhì)濃度相關(guān)外，還與反應(yīng)溫度有關(guān)，樣品中葡萄糖與蔗糖會干擾反應(yīng)第8頁，共24頁。紫外分光光度法（I）（Ultraviolet absorption spectrophotometry）蛋白質(zhì)中的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸殘基含有共軛雙鍵，在280nm處有吸收峰蛋白質(zhì)中肽鍵在220nm左右

4、存在光吸收生物樣品中常混有核酸，其最大吸收峰在260nm，因此需進行校正本法靈敏，樣本可回收再利用，但不同蛋白質(zhì)之間差異大，且游離酪氨酸、色氨酸、尿酸和膽紅素等也存在紫外光吸收第9頁，共24頁。紫外分光光度法（II）Lowrykaleker公式 蛋白質(zhì)濃度(mg/m)=1.45A280-0.74A260WarburgChristian公式 蛋白質(zhì)濃度(mg/m)=1.55A280-0.76A260Waddell公式 蛋白質(zhì)濃度(mg/m)=144 （A215-A225）第10頁，共24頁。染料結(jié)合法（I）（dye conjugation）酸性環(huán)境中蛋白質(zhì)分子可解離出帶有正電荷的-NH3+基團，

5、它可與陰離子的染料產(chǎn)生顏色反應(yīng)，與同樣處理的標準溶液比較即可求得樣品中蛋白質(zhì)的含量染料有CBBG-250、麗春紅S、鄰苯三酚紅鉬酸鈉、銀、膠體金等第11頁，共24頁。染料結(jié)合法（II）血清總蛋白測定最常用的染料是考馬斯亮藍G-250（CBBG-250），即Bradford法在酸性條件下，CBBG-250與蛋白質(zhì)結(jié)合后由棕紅色變?yōu)樗{色，最大光吸收從465nm移至595nm本法簡便快速，重復性好，靈敏度高，但特異性不高，MW大于3000的多肽也參與反應(yīng)，強堿和去垢劑會影響呈色，白、球蛋白呈色強度不同第12頁，共24頁。幾種方法的比較方法 靈敏度 化學干擾 不同蛋白質(zhì)間差異 快速性與復雜性雙縮脲 1

6、00 g 中等 小 快速簡易 酚試劑 1 g 嚴重 大 較復雜CBBG-250 1 g 大 快速簡單紫外分光光度法 10 g 較嚴重 大 快速簡單第13頁，共24頁。比濁法（turbidity method）某些強酸（三氯醋酸、磺基水楊酸等）能與生物堿結(jié)合而沉淀，稱為生物堿試劑。它們也能與蛋白質(zhì)結(jié)合產(chǎn)生沉淀在酸性溶液中蛋白質(zhì)帶有正電荷，可與帶負電荷的生物堿試劑結(jié)合形成細微沉淀，經(jīng)測定懸浮液的濁度，與同樣處理的蛋白質(zhì)標準品比較，即可求得樣品中蛋白質(zhì)的含量此法操作簡便，試劑易得，但濁度強弱受多種因素影響第14頁，共24頁。折光測定法（ratio of refraction）溶解在溶液中的固體可以增

7、加溶液的光折射，通過測定血清的折射指數(shù)可以計算出總固體的含量由于每升正常血清中含有約16g非蛋白固體，它們對折射指數(shù)的影響必須進行校正折射率1.3353蛋白質(zhì)濃度（g/dl） 0.00191此法準確性較差，且白、球蛋白的折射率不同第15頁，共24頁。OPA熒光法OPA：o-phthalaldehyde ,o-苯二醛在巰基乙醇存在條件下，OPA與主胺發(fā)生反應(yīng)生成一種具有強烈藍色熒光的物質(zhì)，其最大激發(fā)波長為340nm，發(fā)射波長為455nm。本法靈敏度高，線性范圍廣第16頁，共24頁。白蛋白測定白蛋白是血清中含量最多的蛋白質(zhì)將白、球蛋白分離后測定：鹽析法不分離白、球蛋白直接測定：染料結(jié)合法第17頁，

8、共24頁。鹽析（salt precipitation）是一種將蛋白質(zhì)從溶液中沉淀的方法將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液，破壞蛋白質(zhì)在水溶液中的穩(wěn)定性因素而沉淀沉淀球蛋白后，用前述總蛋白測定方法測定白蛋白含量第18頁，共24頁。染料結(jié)合法測定白蛋白含量白蛋白能通過離子鍵或疏水鍵結(jié)合低分子物質(zhì)（包括生理性代謝物和外源性物質(zhì)）能力強，故可不分離白、球蛋白直接測定藥物（青霉素等）、膽色素等能與染料競爭結(jié)合白蛋白，故可干擾測定結(jié)果靈敏度高，操作簡便，重復性好染料多用溴甲酚綠（BCG）、溴甲酚紫（BCP）第19頁，共24頁。BCG法測定白蛋白BCG: bromcresol green,一種陰離子染料,全稱:3,3,5,5-四溴-間-甲酚磺酞在pH4.2及非離子去垢劑Brij-35存在條件下，BCG可與白蛋白緊密結(jié)合形成綠色復合物，于628nm處有強的光吸收BCG與白蛋白的復合物會發(fā)生部分沉淀，且BCG的特異性較差，能與球蛋白反應(yīng)，但呈色強度較弱，同時反應(yīng)速度較慢第20頁，共24頁。BCP法測定白蛋白化學結(jié)構(gòu)與BCG相似在Ph5.2及brij-35存在條件下，可與白蛋白形成紫色復合物，于603nm處有光吸收BCP與白蛋白的反應(yīng)是即時完全反應(yīng)，不受時間變化的影響，呈色穩(wěn)定1h以上BCP與白蛋白反應(yīng)特異性高，與血清非蛋白成分反應(yīng)微弱，干擾小第21頁，共24頁。球蛋白測定臨床檢驗中多用