1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。RNA的合成-第二節RNA的生物合成RNA的生物合成包括RNA轉錄（transcription）與RNA復制。除少數RNA病毒，以RNA復制的方式傳遞遺傳信息外，大部分生物中遺傳信息都是從DNA分子中以轉錄方式合成RNA而輸出的，即以DNA為模板，以四種核糖核苷酸為原料，在RNA聚合酶催化下合成RNA。轉錄是基因表達的第一步，是遺傳信息傳遞的重要環節。轉錄產物有：mRNA、rRNA、tRNA、小RNA。一、轉錄體系參與RNA合成的成分有多種，包括DNA模板、四種三磷酸核糖核苷（NTP）、RNA聚合酶、某

2、些蛋白質因子及必要的無機離子等，這些總稱為轉錄體系。（一）DNA模板轉錄以DNA為模板，根據堿基配對原則，按照DNA模板中核苷酸的排列順序合成互補的RNA分子。DNA分子中的A、G、C、T分別對應于合成RNA分子中的U、C、G、A。模板DNA的序列決定著轉錄RNA的序列，從而將DNA的遺傳信息傳給RNA。與DNA復制不同，轉錄具有不對稱性。即在一個包含多個基因的雙鏈DNA分子中（如稱為A鏈及B鏈），某個基因節段只以A鏈為模板進行轉錄，B鏈不轉錄，而在另一個基因節段可由B鏈為模板，A鏈不轉錄。在轉錄中，基因的DNA雙鏈中可以作模板的鏈稱為模板鏈，不作為模板的另一條DNA鏈稱為編碼鏈。轉錄的RNA

3、序列與DNA模板鏈序列是互補的，而與DNA中編碼鏈序列基本相同（U代替了T）。（二）底物轉錄所需的底物（原料）是四種三磷酸核糖核苷（NTP），即ATP、GTP、CTP、UTP。每聚合1分子核糖核苷酸需水解掉NTP的1個磷酸鍵以提供所需能量。（三）RNA聚合酶RNA聚合酶是依賴DNA的RNA聚合酶（DNAdependentRNApolymerase，DDRP）。RNA聚合酶在原核生物、真核生物、病毒及噬菌體中均普遍存在。1、原核生物RNA聚合酶以大腸桿菌（E.coli）為例，E.coli和其它原核細胞一樣，只有一種RNA聚合酶，合成各種RNA。一個E.coli細胞中約有7000個RNA聚合酶分子

4、，在任一時刻，大部分聚合酶（5000個左右）正在參與RNA的合成，具體數量依生長條件而定。E.coliRNA聚合酶全酶（holoenzyme）分子量460000Da，由五種、六個亞基組成，2、，另有兩個Zn2+。無亞基的酶叫核心酶，核心酶只能使已開始合成的RNA鏈延長，而不具備起始合成活性，加入亞基后，全酶才具有起始合成RNA的能力，因此，亞基稱為起始因子。不同的細菌、亞基分子量變化不大，但亞基分子量從44000Da92000Da。亞基的功能能使核心酶在DNA上滑動，讓核心酶與DNA啟動子更容易結合，增加停留時間，使聚合酶迅速找到啟動子并與之結合，亞基本身無催化活性，但不同的因子能識別不同的啟

5、動子，從而表達不同的基因。不同的原核生物，都具有相同的核心酶，但亞基有所差別，這決定了原核基因表達的選擇性。RNA聚合酶以完整的雙鏈DNA為模板，轉錄時DNA的雙鏈結構部分解開，轉錄后DNA仍然保持雙鏈的結構。核心酶覆蓋60bp的DNA區域，其中解鏈部分17bp左右，RNA-DNA雜合鏈約12bp。37時，原核RNA聚合酶的聚合速度可達50個核苷酸/秒。表10-3E.coliRNA聚合酶各亞基性質及功能亞基基因分子量亞基數功能rpoA400002酶的裝配及結合啟動子上游元件和活化因子rpoB1550001結合核苷酸底物，催化磷酸二酯鍵形成rpoC1600001與模板DNA結合rpoD32000

6、-920001識別啟動子，促進轉錄起始未知90001未知2、真核生物RNA聚合酶真核細胞中已發現三種RNA聚合酶，分別稱為RNA聚合酶I、II、III，RNA聚合酶I轉錄rRNA，RNA聚合酶II轉錄mRNA，RNA聚合酶III轉錄tRNA和其它小分子RNA。這三種RNA聚合酶分子量都在50萬左右，亞基數通常有8-14個。動物、植物、昆蟲等不同來源的細胞，RNA聚合酶II的活性都可被低濃度的-鵝膏蕈堿抑制，而RNA聚合酶I不受抑制。動物RNA聚合酶III受高濃度的-鵝膏蕈堿抑制，而酵母、昆蟲的RNA聚合酶III不受抑制。-鵝膏蕈堿是一種毒蕈（鬼筆鵝膏Amanitaphalloides）產生的八

7、肽化合物，對真核生物RNA聚合酶有較大毒性，但對原核生物RNA聚合酶只有微弱抑制作用。除了細胞核RNA聚合酶外，還分離到線粒體和葉綠體RNA聚合酶，它們的結構簡單，能轉錄所有種類的RNA，類似于細菌RNA聚合酶。3、噬菌體T3和T7編碼的RNA聚合酶僅為一條分子量11000Da的多肽鏈，這些聚合酶只識別噬菌體DNA的少數啟動子，并無選擇地與其作用，37時的聚合速度200堿基/秒。二、轉錄過程RNA的轉錄過程可分為起始、RNA鏈的延長及終止三個階段，轉錄起始前需要相關的轉錄因子共同作用。（一）原核生物基因轉錄的起始首先RNA聚合酶的因子辨認DNA的啟動子部位，并帶動RNA聚合酶的全酶與啟動子結合

8、，形成復合物。RNA聚合酶可以“擠”入DNA雙螺旋結構之內，起到解旋作用，并使DNA的局部結構松弛，解開約10幾個堿基對長的DNA雙鏈形成轉錄泡，暴露出DNA模板鏈。與復制不同的是，RNA聚合酶可以開始新RNA鏈合成，因此轉錄起始不需要引物。RNA聚合酶進入起始部位后，直接催化NTP，使其與模板鏈上相應的堿基配對（U-A，A-T，G-C），并結合到DNA模板鏈上，形成第一個磷酸二酯鍵。第一個核苷酸以GTP最常見，與第二個核苷酸結合后GTP仍保留5-端三個磷酸，形成RNA聚合酶全酶-DNA-pppGpN-OH-3復合物，稱為轉錄起始復合物。RNA鏈開始合成后，因子從復合物上脫落，核心酶進一步合成

9、RNA鏈。因子可以反復使用，它可與新的核心酶結合成RNA聚合酶的全酶，起始另一次轉錄過程。（二）RNA鏈的延長RNA鏈的延長反應由核心酶催化。核心酶沿模板DNA鏈向下游方向滑動，每滑動一個核苷酸的距離，則有一個核糖核苷酸按DNA模板鏈的堿基互補關系進入模板，即U-A、A-T、C-G，形成一個磷酸二酯鍵，如此不斷延長下去。與DNA復制一樣，RNA鏈的合成也是有方向性的，即從5端3端進行。DNA鏈在核心酶經過后，即恢復雙螺旋結構，新生成的RNA單鏈伸出DNA雙鏈之外。原核細胞與真核細胞的轉錄延長過程基本相似。圖10-13表示轉錄過程。（三）轉錄的終止圖10-13原核生物轉錄過程細菌和真核生物轉錄一

10、旦開始，通常都能繼續下去，直至轉錄完成而終止，DNA中有一段特殊序列，能提供轉錄停止信號，稱為終止子(terminatorT)，而協助RNA聚合酶識別終止子的蛋白質輔助因子稱為終止因子(terminationfactor)，有些終止子的作用可被特異的因子所阻止，使酶越過終止子繼續轉錄，稱為通讀，這類引起抗終止作用的蛋白質稱為抗終止因子(antiterminationfactor)。終止子位于已轉錄的序列中，DNA的終止子可被RNA聚合酶本身或其輔助因子識別。1原核生物中的兩類終止子（1）不依賴于因子的終止子這類終止子在DNA模板上靠近終止處有些特殊的堿基序列，即較密集的A-T配對區或G-C配對

11、區的回文序列，其轉錄產物3-端終止區能形成發夾結構，轉錄終點有46個寡聚U。這種發夾樣二級結構使RNA聚合酶不再向下游移動，自動脫離模板，轉錄終止。（2）依賴因子的終止子這類終止子必需依賴因子的協助才能終止轉錄，因子是一種分子量46000Da的蛋白，能識別并結合RNA產物3-端上游富含C的特異序列，發揮其ATP酶活性水解ATP釋出的能量，使核心酶構象改變停止轉錄。同時，因子還具有解旋酶活性，能使RNA-DNA雜交雙鏈螺旋解開，釋放核心酶、因子、RNA產物。釋放的核心酶可以與因子重新結合，形成RNA聚合酶全酶，參與另一次轉錄過程。圖10-14示原核生物終止子結構。圖10-14原核生物終止子結構有

12、關真核生物的終止機制知之甚少，其中，RNA聚合酶I轉錄出rRNA基因后，繼續向下游轉錄出超過1000個堿基，此處有一個18bp的終止序列，在輔助因子協助下終止轉錄。圖10-14終止子模型RNA聚合酶II的轉錄沒有明確終止信號，轉錄通過結構基因的結尾后，還要向下繼續轉錄幾千的堿基，沒有固定的終止點。RNA聚合酶III轉錄模板的下游有終止子，該終止子位于富含GC序列中的TTTT上，因此RNA聚合酶III催化的RNA前體3端有序列。轉錄過程是基因表達的中心環節，轉錄起始與終止的控制在基因表達的調控中起著重要作用，某些抗生素，如利福霉素、利鏈菌素能抑制細菌RNA聚合酶活性，因而抑制細菌RNA的合成。這

13、正是此類抗生素抑菌作用的機理。（四）轉錄的調控基因表達受到各個方面的調控，其中轉錄環節的調控是最重要的環節，尤其是原核生物，轉錄和翻譯幾乎同時進行，轉錄水平的調控就顯得更為重要。轉錄是在DNA模板上特殊位點開始的，該位點能被RNA聚合酶識別、結合并開始轉錄，這段必需的DNA序列稱為啟動子（promoter），又稱啟動基因。同時，RNA聚合酶在進行轉錄時，常需要一些輔助因子（蛋白質）參與作用，此類蛋白質統稱為轉錄因子。在DNA模板鏈上，從起始點逆轉錄方向的區域稱為上游，順轉錄方向的區域叫下游，轉錄起始點的堿基以+1表示，下游就是2、3、4n，上游以1、2、3、4n表示。1、原核生物的轉錄調控（1

14、）原核生物啟動子的結構與功能分析比較上百種原核生物啟動子序列，發現不同的啟動子都存在保守的共同序列，包括RNA聚合酶識別位點和結合位點，其中主要的有10序列（Pribnow框）和35序列（Sexfamabox，識別區域）。在轉錄起點上游大約10處，有一個6bp的保守序列TATAAT，稱Pribnow框。此段序列出現在4到13bp之間，每個位點的保守性在45%-100%。頻度：T89A89T50A65A65T100。Pribnow框中，頭兩個堿基TA和第6位最保守的T在結合RNA聚合酶時起十分重要的作用。目前認為，Pribnow框決定轉錄方向。酶在此部位與DNA結合形成穩定的復合物，Pribno

15、w框中DNA序列在轉錄方向上解開，形成開放型起始結構，它是RNA聚合酶牢固的結合位點，是啟動子的關鍵部位。在35位置有一個6bp的保守序列TTGACA，是RNA酶的識別區域，其中TTG十分保守，各堿基出現頻率如下：T85T83G81A61C69A52，。35序列是原核RNA聚合酶中的因子識別位點。因此，35序列對RNA聚合酶全酶有很高的親和性。35序列的核苷酸結構，在很大程度上決定了啟動子的強度，RNA聚合酶易識別強的啟動子。35序列提供RNA聚合酶識別信號，10序列有助于DNA局部雙鏈解開，啟動子結構的不對稱性決定了轉錄的方向，如圖10-14。轉錄起始點-35區，因子識別位點(Sexfama

16、box)-10區(Pribnowbox)1-30-5010-10-40-205335RNA聚合酶TTGACAAACTGTTATAATPuATATTAPy圖10-14E.coli啟動子模型（2）操縱子模型解釋了原核生物基因調控的機制法國分子生物學家Jacob和Monod對大腸桿菌（E.coli）酶產生的誘導和阻遏現象進行研究后提出了操縱子模型（operonstructuralmodel）來解釋轉錄調控，該研究發現，在葡萄糖和乳糖都存在的培養基中，大腸桿菌不能利用乳糖，只有乳糖單獨存在時才能利用乳糖。乳糖操縱子是大腸桿菌中控制半乳糖苷酶誘導合成的操縱子，包括調控元件P(啟動子)和O(操縱基因)，以

17、及結構基因lacZ(編碼半乳糖苷酶)、lacY(編碼通透酶)和lacA(編碼硫代半乳糖苷轉乙酰基酶)。如圖10-15所示圖10-15E.coli乳糖操縱子模型=1*GB3當培養基中沒有乳糖時，操縱子上游的調節基因i編碼的調控蛋白結合到操縱基因O上，阻止了RNA聚合酶不能往下游移動，導致結構基因lacZ、lacY、lacA不能轉錄表達代謝乳糖的酶。如圖10-16所示圖10-16調控蛋白阻遏結構基因轉錄=2*GB3當只有乳糖存在時，乳糖可與調節基因i編碼的調控蛋白結合，而使調控蛋白失效，不能與操縱基因結合，RNA聚合酶能往下游移動使結構基因結構基因lacZ、lacY、lacA轉錄，翻譯出代謝乳糖的

18、酶以代謝乳糖。如圖10-17所示圖10-17乳糖阻遏調控蛋白=3*GB3當葡萄糖和乳糖同時存在時，不能利用乳糖的原因是在乳糖操縱子的調控中，有降解物基因活化蛋白（CAP）產生，CAP首先與cAMP形成復合物，此復合物才能與啟動子相結合而促進結構基因轉錄，且游離的CAP不能與啟動子結合，必須在細胞內有足夠的cAMP時才行，但葡萄糖的降解產物能降低cAMP含量，所以影響CAP-cAMP復合物與啟動基因結合，抑制結構基因轉錄，此時即使有乳糖存在，但仍不能利用乳糖。2真核生物轉錄調控真核生物轉錄調控過程復雜，不組成操縱子來調控，大多數真核生物啟動子以正調控為主，依靠順式作用元件(cis-actinge

19、lement，指DNA上對基因表達在調節活性的某些特定的調控序列，其活性僅影響其自身處于同一DNA分子上的基因)和反式作用因子（trans-actingfactor，通過直接結合或間接作用于DNA、RNA等核酸分子，對基因表達調節作用的各類蛋白質因子）來協同調控的。（1）真核生物有三種RNA聚合酶對應三類啟動子，RNA聚合酶I結合的是I類啟動子，含I類啟動子的基因主要是rRNA，這類基因有上千個拷貝，人的rRNA基因的啟動子包括核心元件和上游調控元件，分別位于45至20，后者位于156至107，兩個原件都富含GC堿基對，兩個原件之間的距離很重要，過長或過短都會降低轉錄起始效率。=2*GB3由R

20、NA聚合酶II結合的啟動子叫II類啟動子，分別有TATA盒（Hogness盒），中心在25至30，長度7bp左右。堿基頻率：T82A97A85A63（T37）A83A50（T37）。此序列能被RNA聚合酶II識別，使DNA雙鏈解開，并決定轉錄的起點和方向。還有CAAT盒，中心在75處，9bp，共有序列GGT（G）CAATCT，能被RNA聚合酶識別并結合。還有GC盒，在CAAT盒上游，序列GGGCGG，與某些轉錄因子結合。如圖10-12所示-GCGC-CAAT-TATA轉錄起始TATA盒CAAT盒GC盒增強子順式作用元件作用位點結構基因圖10-12RNA聚合酶II啟動子序列=3*GB3由RNA聚

21、合酶III結合的啟動子叫III類啟動子，含有III類啟動子的基因包括5SrRNA、tRNA等基因。其中tRNA基因的啟動子包括A盒和B盒兩部分，分別位于10至20，50至60的區域。（2）增強子是指能使與它連鎖的基因轉錄頻率明顯增加的DNA序列。在SV40的轉錄單元上發現，位于轉錄起始點上游約200bp處的兩段72bp正向重復序列。增強子效應十分明顯，一般能使基因轉錄頻率增加10-200倍，并且增強效應與其位置和取向無關，不論增強子以什么方向排列（53或35），甚至和靶基因相距3kb，或在靶基因下游，均表現出增強效應；大多為重復序列，一般長約50bp，適合與某些蛋白因子結合。其內部常含有一個核

22、心序列：（G）TGGA/TA/TA/T（G），該序列是產生增強效應時所必需的；沒有基因專一性，可以在不同的基因組合上表現增強效應；（3）沉默子是某些基因含有的負性調節元件，當其結合特異蛋白因子時，對基因轉錄起阻遏作用。（4）反式作用因子是能直接或間接地識別或結合在各類順式作用元件上，參與調控靶基因轉錄的蛋白質，也稱為轉錄因子（transcriptionalfactor，TF）。如轉錄因子TFD能識別結合TATAbox；轉錄因子SP1識別結合GCbox；轉錄因子CTF1識別結合CAATbox。反式作用因子的類型分為基本轉錄因子（通用轉錄因子）和細胞特異性轉錄因子，前者又稱TATA盒結合蛋白，如T

23、F、TF和TF等。細胞特異性轉錄因子包括EF1因子，作用于紅細胞、Isl-I因子作用于胰島細胞、MyoDI因子作用骨骼肌細胞、NF-B因子作用于B淋巴細胞、DF3因子作用于乳腺癌細胞。此外還有可誘導的轉錄因子如高溫誘導的熱休克轉錄因子（HSTF）；抗原誘導的CD28反應元件結合蛋白；感染與炎癥誘導的激活蛋白2(AP-2)等。反式作用因子有兩個必需的結構域：DNA結合結構域和轉錄激活結構域，前者包括螺旋-轉角-螺旋（helix-turn-helix）；鋅指結構（zincfinger）；亮氨酸拉鏈（leucinezipper，ZIP）；螺旋-環-螺旋（helix-loop-helix，HLH）。三

24、、轉錄后的加工與修飾轉錄生成的RNA初級產物是RNA的前體，它們沒有生物學活性。通常還需要經過一系列加工修飾過程，才能最終成為具有功能的成熟RNA分子。細菌中RNA轉錄后加工相對較為簡單，由于不存在核膜，通常RNA轉錄尚未結束翻譯即已開始。真核細胞中幾乎所有轉錄的前體都要經過一系列酶的作用，進行加工修飾，才能成為具有生物功能的RNA。（一）mRNA的加工mRNA通過轉錄作用獲得DNA分子中儲存的遺傳信息，可以再通過翻譯作用將其信息傳到蛋白質分子中，它是遺傳信息傳遞的中介物，具有重要的生物學意義。真核細胞的mRNA前體是核內分子量較大而不均一的hnRNA，mRNA由hnRNA加工而成。加工過程包

25、括5-端和3-端的首尾修飾及剪接。15-端加帽mRNA的5-端帽子結構是在hnRNA轉錄后加工過程中形成的。轉錄產物第一個核苷酸常是5-三磷酸鳥苷（5-pppG），在細胞核內的磷酸酶作用下水解釋放出無機焦磷酸，然后，5-端與另一GTP反應生成三磷酸雙鳥苷，在甲基化酶作用下，第一或第二個鳥嘌呤堿基發生甲基化反應，形成帽子結構（5-m7GpppGp，或5-GpppmG）。該結構的功能可能是翻譯過程中起識別作用，并能穩定mRNA，延長半衰期。23-端加多聚腺苷酸尾mRNA分子的3-末端的多聚腺苷酸尾（polyAtail）也是在加工過程中加進的。在細胞核內，首先由特異核酸外切酶切去3-端多余的核苷酸，

26、再由多聚腺苷酸聚合酶催化，以ATP為底物，進行聚合反應形成多聚腺苷酸尾。polyA長度為20200個核苷酸，其長短與mRNA的壽命有關，隨壽命延長而縮短。polyA尾與維持mRNA穩定性、保持翻譯模板活性有關。3剪接hnRNA在加工成為成熟mRNA的過程中，約有5070的核苷酸鏈片段被剪切。真核細胞的基因通常是一種斷裂基因（interruptedgene），即由幾個編碼區被非編碼區序列相間隔并連續鑲嵌組成。在結構基因中，具有表達活性的編碼序列稱為外顯子（exon）；無表達活性、不能編碼相應氨基酸的序列稱為內含子（intron）。在轉錄過程中，外顯子和內含子均被轉錄到hnRNA中。在細胞核中，h

27、nRNA進行剪接，即切掉內含子部分，然后將各個外顯子部分再拼接起來（圖10-18）。圖10-18mRNA前體的剪接（二）tRNA的加工1剪切在真核細胞中，tRNA前體分子的5-端、3-端及反密碼環的部位由核糖核酸酶切去部分核苷酸鏈而形成tRNA。有些前體分子中還包含幾個成熟的tRNA分子，在加工過程中，通過核酸水解酶的作用而將它們分開。2加CCA-OH的3-端tRNA分子在轉錄后由核苷轉移酶催化，以CTP和ATP為供體，氨基酸臂上的3末端添加-CCA-OH結構，從而具有攜帶氨基酸的功能。3堿基修飾在tRNA的加工過程中，由修飾酶實現堿基的修飾。例如，堿基的甲基化反應產生甲基鳥嘌呤（mG）、甲基

28、腺嘌呤（mA），還原反應使尿嘧啶轉變成二氫尿嘧啶（DHU），脫氨基反應使腺嘌呤轉變為次黃嘌呤（I），堿基轉位反應產生假尿苷（）等。故成熟的tRNA分子中擁有多種稀有堿基。（三）rRNA的加工rRNA的轉錄和加工與核糖體的形成同時進行。真核細胞在轉錄過程中首先生成的是45S大分子rRNA前體，然后通過核酸酶作用，斷裂成28S、5.8S及18S等不同rRNA。這些rRNA與多種蛋白質結合形成核糖體。rRNA成熟過程中也包括堿基的修飾，堿基的修飾以甲基化為主。三類RNA通過鏈的剪切、拼接、末端添加核苷酸、堿基修飾等加工過程轉變為成熟的RNA，后者再參與蛋白質的生物合成等功能。本章小結DNA復制是指以親代DN