1、微生實驗報告姓名：王晶暉專業年級：2011級生物技術學號：040312011032實驗四酵母菌的形態觀察及細胞死活的鑒別，微生物細胞大小的測定一、實驗目的1觀察酵母菌的形態及出芽生殖方式，學習區分酵母菌死活細胞的實驗方法；掌握酵母菌的一般形態特征及其與細菌的區別。2了解目鏡測微尺和鏡臺測微尺的構造及使用原理，掌握測定微生物細胞大小的方法.3了解血球計數板的構造和使用方法,學會用血球計數板對酵母細胞進行計數。二、實驗原理美藍是一種無毒性的染料，它的氧化型呈藍色，還原型無色。用美藍對酵母的活細胞進行染色時，由于細胞的新陳代謝作用，細胞內具有較強的還原能力，能使美藍由藍色的氧化型變為無色的還原型。因

2、此，具有還原能力的酵母細胞是無色的，而死細胞或代謝作用微弱的衰老細胞則呈藍色或淡藍色。微生物細胞的大小是微生物重要的形態特征之一，由于菌體微小，只能在顯微鏡下測量。用于測量微主物細胞大小的工具有目鏡測微尺和鏡臺測微尺。目鏡測微尺是一塊圓形玻片，在玻片中央把5mm長度刻成50等分，或把10mm長度刻成100等分。測量時，將其放在接目鏡中的隔板上（此處正好與物鏡放大的中間物像重疊）用于測量經顯微鏡放大后的細胞物象。由于不同目鏡、物鏡組合的放大倍數不相同，目鏡測微尺每格實際表示的長度也不一樣，因此目鏡測微尺測量微生物大小時須先用置于鏡臺上的鏡臺測微尺校正，以求出在一定放大倍數下，目鏡測微尺每小格所代

3、表的相對長度。鏡臺測微尺是中央部分刻有精確等分線的專用載玻片，一般將lmm等分為100格，每格長10um，每格長（0.01mm）,是專門用來校正目鏡測微尺的。校正時，將鏡臺測微尺放在載物臺上，由于鏡臺測微尺與細胞標本是處于同一位置，都要經過物鏡和目鏡的兩次放大成像進入視野，即鏡臺測微尺隨著顯微鏡總放大倍數的放大而放大，因此從鏡臺測微尺上得到的讀數就是細胞的真實大小，所以用鏡臺測微尺的已知長度在一定放大倍數下校正目鏡測微尺，即可求出目鏡測微尺每格所代表的實際長度，然后移去鏡臺測微尺，換上待測標本片，用校正好的目鏡測微尺在同樣放大倍數下測量微生物細胞大小。利用血球計數板在顯微鏡下直接計數，是一種常

4、用的微生物計數方法。此法的優點是直觀、快速。將經過適當稀釋的菌懸液（或孢子懸液）放在血球計數板載玻片與蓋玻片之間的計數室中，在顯微鏡下進行計數。由于計數室的容積是一定的（0.Imm2）,所以可以根據在顯微鏡下觀察到的微生物數目來換算成單位體積內的微生物總數目。由于此法計得的是活菌體和死菌體的總和，故又稱為總菌計數法。血球計數板，通常是一塊特制的載玻片，其上由四條槽構成三個平臺。中間的平臺又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺上各刻有一個方格網，每個方格網共分九個大方格，中間的大方格即為計數室，微生物的計數就在計數室中進行。計數室的刻度一般有兩種規格，一種是一個大方格分成16個中方格，而每個中方格又

5、分成25個小方格；另一種是一個大方格分成25個中方格，而每個中方格又分成16個小方格。但無論是哪種規格的計數板，每一個大方格中的小方格數都是相同的，即16X25=400小方格。每一個大方格邊長為1mm,則每一大方格的面積為1mm2,蓋上蓋玻片后，載玻片與蓋玻片之間的高度為0.1mm,所以計數室的容積為0.1mm3o在計數時，通常數五個中方格的總菌數，然后求得每個中方格的平均值，再乘上16或25,就得出一個大方格中的總菌數，然后再換算成1ml菌液中的總菌數。下面以一個大方格有25個中方格的計數板為例進行計算:設五個中方格中總菌數為A,菌液稀釋倍數為B，那么，一個大方格中的總菌數因1ml=1cm3

6、=1000mm3,故lml菌液中的總菌數X25X10X1000XB同理，如果是16個中方格的計數板，設五個中方格的總菌數為A則A加1菌液中總菌數=isxioioooB三、實驗儀器1、顯微鏡2、血球計數板3、目鏡測微尺4、鏡臺測微尺5、蓋玻片6、吸水紙7、計數器8、移液器9、擦鏡紙四、實驗試劑1、菌種：培養48h的酵母菌2、染色液和試劑：0.05%、0.1%呂氏堿性美藍五、實驗步驟1、目微尺的校正：把Olympus目鏡的下部羅圈旋下，將目鏡測微尺的刻度朝下輕輕地裝入目鏡的隔板上,把鏡臺測微尺置于載物臺上，刻度朝上。先用低倍鏡觀察，對準焦距，視野中看清鏡臺測微尺的刻度后，轉動目鏡，使目鏡測微尺與鏡

7、臺測微尺的刻度平行，移動推動器，使兩尺重疊,再使兩尺的“0”刻度完全重合，定位后，仔細尋找兩尺第二個完全重合的刻度，計數兩重合刻度之間目鏡測微尺的格數和鏡臺測微尺的格數。因為鏡臺測微尺的刻度每格長10um，所以由下列公式可以算出目鏡測微尺每格所代表的實際長度。用同法分別校正在低倍鏡下和高倍鏡下目鏡測微尺每小格所代表的長度。目鏡測撤尺每格長度（pm）兩重合線間鏡臺測微尺的格數X10_兩重合線間目鏡測微尺的格數2、酵母菌形態觀察及死活細胞鑒別1）制片：在一個載玻片上分別滴0.05%、0.1%呂氏堿性美藍各1滴，無菌操作取酵母菌，在染液中分別混勻，蓋上蓋玻片，靜置5分鐘。2）鏡檢：在顯微鏡高倍鏡下觀

8、察酵母菌的形態及出芽生殖方式。3）計數死活細胞：死細胞為染為蘭色的細胞，活細胞為無色細胞，分別計數，并隔5-15分鐘檢測一下死活細胞數，比較其死活細胞的比例變化。3細胞大小的測定：移去鏡臺測微尺，換上酵母菌染色片，先在低倍鏡下找到目的物，然后在高倍鏡下用目鏡測徽尺來測量酵母菌菌體的長，寬各占幾格（不足一格的部分估計到小數點后一位數）。測出的格數乘上目鏡測微尺每格的校正值，即等于該菌的長和寬。一般測量菌體的大小要在同一個標本片上測定1020個菌體，才能代表該菌的大小。待測微生物需用培養至對數生長期的菌體進行測定。六、實驗結果1、繪圖說明酵母菌形態及出芽方式2、為什么目鏡測微尺使用前必須校正？答：

9、因為不同的物鏡、目鏡以及顯微鏡本身會產生放大倍數的差異，因此要校準顯微測微尺,以便使結果精確。3、目鏡測微尺校正結果物鏡目鏡測微尺格數鏡臺測微尺格數目鏡測微尺校正值(um)10X2510440X4820.424、酵母菌大小測定記錄123456789101112131415平均值長44554.554.54.5555.5555.575寬3444.53.543.53.5444.54454.54測得酵母菌寬約4.15um,長約5.22um5、顯微鏡直接計數法實驗結果每個中方格菌數AB平均數12345第一室3228352437156100780000000第二室343238303617010085000

10、0000室平均菌數為815000000七、思考題1、為什么目測尺使用前必須校正？答：因為不同的物鏡、目鏡以及顯微鏡本身會產生放大倍數的差異，因此要校準顯微測微尺，以便使結果精確。2、呂氏堿性美藍染色液濃度和作用時間的不同，對酵母菌死活細胞數量有何影響？答：呂氏堿性美藍染色液濃度過高或作用時間過長會造成細胞脫水死亡并滲透染液，造成更多的死細胞，影響實驗結果；呂氏堿性美藍染色液濃度過低或作用時間過短會使死細胞染不上顏色，不利于觀察。3、你認為在顯微鏡下，細菌、放線菌、酵母菌、霉菌的主要區別是什么？答：細菌為很多圓球狀或小桿狀,放線菌像亂線團,霉菌為很多亂粗枝,酵母是較細菌明顯大一點的橢圓球狀4、根據你的體會，說