1、Alport綜合征：從基礎到臨床Alport綜合征遺傳性腎臟疾病臨床表現: 血尿、感音神經性耳聾、聽力減退、眼部異常進行性腎功能衰竭預后差大多數為 X連鎖顯性遺傳（XLAS），由編碼IV型膠原5 鏈的COL4A5基因突變所致主要問題 診斷 花費少 更有效 創傷小分子生物學發病機制Alport綜合征Alport綜合征:從基礎到臨床診斷通過皮膚穿刺進行臨床診斷通過mRNA分析進行基因診斷機制 COL4A5基因突變后mRNA的表達量IV型膠原5 鏈甘氨酸替代的影響Alport綜合征:從基礎到臨床通過皮膚穿刺進行臨床診斷通過mRNA分析進行基因診斷COL4A5基因突變后mRNA的表達量IV型膠原5鏈甘

2、氨酸替代的影響Alport綜合征:從基礎到臨床通過皮膚穿刺檢測進行臨床診斷通過mRNA分析進行基因診斷COL4A5基因突變后mRNA的表達量 IV膠原5鏈甘氨酸替代的影響臨床診斷腎穿電鏡-“金標準” GBM:增厚、變薄以及致密層的分裂年齡太小的患兒不能耐受既使在電鏡下GBM也有不典型變化: 薄基底膜病的變化(年齡偏小的兒童和女性) 缺陷皮穿 方便 創傷小 31mm皮膚穿刺和5(IV)鏈染色診斷方法免疫熒光抗-5 (IV)鏈單克隆抗體正常:陽性XLAS男性：陰性XLAS女性:間斷陽性丁潔，等：中華兒科雜志，35: 177, 1997 Ding Jie, et al: Chin Med J, 11

3、0: 584, 1997Alport綜合征的臨床診斷皮膚穿刺 抗IV膠原5鏈的單克隆抗體免疫熒光染色 皮膚基底膜 (EBM) 陰性: 男性XLAS 間斷陽性: 女性XLAS 連續陽性: 正常人 個別XLAS 常染色體隱性患者（ARAS）EBM熒光染色 正常人XLAS男性XLAS女性ARAS1（IV）5（IV）腎穿組織熒光染色 正常人XLAS男性 ARAS1（IV）3（IV） 4（IV） 5（IV）皮膚穿刺 -IV型膠原5鏈免疫熒光染色診斷: 89家系, 199患者診斷率:96% Chin J Pediatr 1997; Pediatr Nephrol 2002Alport綜合征的臨床診斷 證實

4、COL4A5 基因突變:917GA 鏡下血尿 偶有蛋白尿 Chin J Practic Pediatr 2003大多數:van der環, 36% (5/14) Kidney Int 1999 2(4%): EBM 5 (IV) 正常皮膚穿刺 -IV型膠原5鏈免疫熒光染色 年齡最小的1例: 1歲 第1例: 常染色體隱性 Chin J Pediatr 1999 血尿2年 無家族史 父母非近親婚配 199例AS中2例為ARASAlport綜合征臨床診斷Alport綜合征:從基礎到臨床通過皮膚穿刺進行臨床診斷通過mRNA分析進行基因診斷COL4A5基因突變后mRNA的表達量IV型膠原5鏈甘氨酸替代的

5、影響Alport綜合征:從基礎到臨床通過皮膚穿刺進行臨床診斷通過mRNA分析進行基因診斷COL4A5基因突變后mRNA的表達量IV型膠原5鏈甘氨酸替代的影響基因診斷明確的遺傳性疾病遺傳方式: X連銷顯性遺傳、常染色體隱性遺傳和常染色體顯性遺傳基因診斷 遺傳咨詢 產前診斷 了解發病機制基因診斷基因組DNA分析: PCR-SSCP: 檢測率 5079% Hum Mutat 1999; Am J Kidney Dis 2001PCR-直接測序: 檢測率85% J Am Soc Nephrol 1998 COL4A5 基因大小: 250kb 基因結構: 51外顯子 無 “熱點突變”花費高 (51外顯子

6、)已報道的檢測率不高(不超過85%)2/3免疫熒光1/3皮膚成纖維細胞培養RNA提取新技術- 5(IV)鏈mRNA分析RT-PCR 5個相互重疊的片段皮膚穿刺方便創傷小31mm RT-PCR 電泳: 大的缺失/插入直接測序: 小的/點突變 通過基因組DNA證實新技術: 5(IV)鏈mRNA分析檢測率: 90.3%3/28 (10.7%) 小的插入或缺失 12/28 (42.8%) 錯義突變2/28 (7.1%) 無義突變4/28 (14.4%) 單體型7/28 (25.0%) 剪切突變 基因診斷 4/28 (14.3%) 典型的剪切位點 3/28 (10.7%) 不典型或隱藏的剪切位點Kidn

7、ey Inter, 67(4):1268-1274, 2005 不典型或隱藏的剪切位點:10% g.668-12GA- skipping E9 g.1036+5GT- skipping E14 g.1625+56_1625+57insC- partially skipping E21基因診斷被忽視或被認為是基因組DNA內含子的多態性基因診斷通過5(IV)鏈mRNA分析檢測COL4A5基因突變 簡單、創傷小 (1個皮膚樣本) hair-root (鑒定24個突變) Hum Genet 2002 更經濟 (費用僅為基因組DNA分析的1/61/7) 基因診斷通過5(IV)鏈mRNA分析檢測COL4A

8、5基因突變:可信、一致每一個突變均在DNA水平進一步得到證實 Kidney Inter, 67(4):1268-1274, 2005 成纖維細胞沒有可變剪切體其他組織 腎臟: 有41A和41B外顯子 Kidney Int 1993 白細胞: 無41A和41B外顯子 Pediatr Nephrol 2001 90.3% (28/31) XLAS患者突變檢測 19 新突變Chin J Pediatr 1999; Pediatr Nephrol 2002; Chin J Nephrol 2003 基因診斷 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 3

9、5 37 39 41 43 45 47 49 51 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 COL4A5 基因53Alport綜合征:從基礎到臨床通過皮膚穿刺進行臨床診斷通過mRNA分析進行基因診斷COL4A5基因突變后mRNA的表達量IV型膠原5鏈甘氨酸替代的影響Alport綜合征:從基礎到臨床通過皮膚穿刺進行臨床診斷通過mRNA分析進行基因診斷COL4A5基因突變后mRNA的表達量IV型膠原5鏈甘氨酸替代的影響突變mRNA的表達量XLAS女性患者臨床表現不一 大多數女性: 鏡下血尿 無或輕

10、微蛋白尿 腎功能正常8-15% 腎功能衰竭（CRF） NDT 1990; Am J Kidney Dis 200140歲出現終末期腎衰（ESRD）: 大約12%60歲出現終末期腎衰: 大約30-40% J Am Soc Nephrol 2000日本報道: EBM中5(IV)表達陰性率和疾病的程度相關 J Am Soc Nephrol 1998突變mRNA的表達量XLAS 女性患者臨床表現不一 家族之間腎臟疾病的嚴重程度明顯不同推測X染色體隨機或非隨機失活所致?突變mRNA的表達量X連鎖女性臨床資料 PatentGross hematuriaMicroscopic hematuriaDegree

11、 of proteinuria Renal insufficiencyEBM 5 (IV) stainingLL Yes + + No MosaicLY No + + No MosaicSL No + -+ No MosaicWS Yes + - No MosaicZF No + + Yes MosaicZY No + + No Mosaic 方法成纖維細胞培養RNA提取RT-PCRPAGE光密度比值分析突變mRNA的表達量Normal band Mutant band突變mRNA的表達量PatientTimes of PCRRange of OD of normal fragmentRang

12、e of OD of abnormal fragmentRatio of mutant mRNA/total mRNALL8637010556, even no normal fragment38907544500.85LY8no normal fragment4715309401SL861742410211505290, even no abnormal fragment0.19WS4150002945811925208000.42ZF44601175956118352130.67ZY420952453565520227700.25光密度比值分析 突變mRNA的表達量蛋白尿和mRNA表達量的

13、關系突變mRNA的表達量結論:突變COL4A5 基因的mRNA表達量和 XLAS 女性患者的表型相關 XLAS女性患者突變COL4A5 基因的mRNA表達量多者表型更嚴重Alport綜合征:從基礎到臨床通過皮膚穿刺進行臨床診斷通過mRNA分析進行基因診斷COL4A5基因突變后mRNA的表達量IV型膠原5鏈甘氨酸替代的影響Alport綜合征:從基礎到臨床通過皮膚穿刺進行臨床診斷通過mRNA分析進行基因診斷COL4A5基因突變后mRNA的表達量IV型膠原5鏈甘氨酸替代的影響甘氨酸替代 發病機制假說: 突變的COL45A基因編碼異常的5(IV) 鏈: 易降解 不能和其他的(IV)鏈形成復雜的網狀結構

14、Medicine 1999 進一步的實驗發現: 突變5(IV)連幾乎不能和其他(IV)鏈形成三螺旋結構 或者:形成的三螺旋結構中含有突變的5(IV)鏈: 很少一部分 Kidney Int 2003甘氨酸替代35NC11430 aa 5(IV)鏈中2530%的甘氨酸 大約3040%突變涉及甘氨酸殘基的替代 J Am Soc Nephrol 2000NH2229 aa（interrupted Gly-X-Y repeats） COOHNC1甘氨酸替代同一位點的甘氨酸被不同氨基酸替代 不同位點的甘氨酸被同一氨基酸替代 青少年型 AS 成人型 AS甘氨酸替代兩例甘氨酸替代患者Glycine - SerineGlycine - Valine 方法質粒構建 pET-28a蛋白表達 E.Coli蛋白鑒定 immunoblot + mass spectrometry 圓二色普檢測 甘氨酸替代 甘氨酸替代Blue: normal圓二色普檢測green- G1030S (Adult-type) black- G1015V (Juvenile-type)甘氨酸替代 重組蛋白的二級結構組成（%） 研究對象 -螺旋