1、高級微生物實驗指導(dǎo)一、目標(biāo)微生物的分離與鑒定在無菌條件下取樣品10 g加入100 mL無菌生理鹽水，用均質(zhì)機將組織破碎均勻。經(jīng)充 分震蕩做成1:10的均勻稀釋液。用1 mL的滅菌吸管吸取1:10稀釋液，注入9 mL滅菌生理 鹽水的試管內(nèi)，震蕩試管混勻，按上述操作依次進行10倍遞增稀釋，選擇3個適宜的稀釋 度，每個稀釋度做2個平行，用滅菌涂布棒均勻涂布于冷卻的細菌分離培養(yǎng)基(NA)和真 菌分離培養(yǎng)基(PDA)表面，分別將細菌培養(yǎng)基和真菌培養(yǎng)基于30C和28C下恒溫培養(yǎng)2-4d。 待菌長出后，挑取不同形態(tài)菌落，純化，挑取單菌落于PDA斜面上，培養(yǎng)并保存。二、細菌與霉菌總DNA的提取(CTAB法)1

2、、菌株DNA的提取通用試劑CTAB 抽提液：2%CTAB，1.4M NaCl， 20mM EDTA， 100mM Tris-HCl， pH8.0；0-疏基乙醇PVP (聚乙烯毗咯烷酮)石英砂Tris平衡酚氯仿：異戊醇(24:1)異丙醇75%乙醇無水乙醇2、菌株DNA的提取步驟將已純化的菌種，接種于相應(yīng)的分離培養(yǎng)基平板上，28C培養(yǎng)2d-4d。用滅菌藥勺或解剖刀從培養(yǎng)皿中刮取足量菌絲至1.5ml離心管中。加少量PVP、滅菌海砂和65C水浴預(yù)熱的200gl CTAB抽提液，用玻璃棒研磨至勻漿;加入400ul預(yù)熱CTAB抽提液，顛倒混勻后于65C水浴1h；期間輕柔顛倒混勻2-3次。冷卻至室溫后，12

3、000rpm離心10min，上清液移至另一離心管中；加入1/2體積(約300ul)的Tris平衡酚及1/2體積(約300ul)的氯仿：異戊醇(24:1)， 顛倒混勻。12000rpm離心10min，取上清液至另一離心管中；重復(fù)(5) - (7)步2-3次，直到兩相界面處無明顯雜質(zhì)；加入等體積氯仿：異戊醇(24:1)，輕輕顛倒混勻；12000rpm離心10min，取上清液至另一離心管中；向上清液中加入0.6倍體積的異丙醇，-20C放置15min；12000rpm離心10min，棄去上清液，加入70%乙醇500ul以懸浮沉淀；也可250ul 70% 乙醇分兩次懸浮沉淀；12000rpm離心5min

4、，棄上清，室溫干燥；加 50ul 無菌水或 TE 緩沖液(10mM Tris-HCl, 1M EDTA, pH8.0)重新溶解沉淀，-20C 儲存?zhèn)溆茫蝗?-5ul DNA樣品在1%的瓊脂糖凝膠中電泳，紫外下檢測提取的真菌基因組DNA。3、總DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測實驗試劑：50XTAE 為電泳緩沖液、瓊脂糖、DNA Marker、6xLoading Buffer、DNA 染料 goldwiew。注：50XTAE 電泳緩沖液(242gTris, 57.1ml 冰醋酸，100ml 0.5mol/L EDT (pH8.0), 加 雙蒸水至1000ml，用冰醋酸調(diào)節(jié)至pH8.0)，使用時將上述溶緩沖

5、液稀釋50倍，使?jié)舛葹?1XTAE。實驗儀器：北京六一電泳儀、微波爐、0.510ul移液槍、凝膠成像儀實驗步驟：制膠：稱取0.12g的瓊脂糖加10ml的電泳緩沖液，在微波爐里加熱至沸騰，冷卻至 5060C加入1ul的goldwiew混勻，之后倒入插好梳子的制膠器中。上樣：將制好的瓊脂糖凝膠放入已加有電泳緩沖液的電泳槽中，吸取PCR產(chǎn)物5ul 與1ul的6xLoading Buffer混勻，之后將混勻液加入膠孔中。電泳：電泳電壓80v,待藍帶下移至2/3處時停止電泳，將凝膠拿出放在凝膠成像儀 中觀察拍照。注：MARK 為入-Hind IIDAN Marker三、16S rRNA或18S rRNA

6、 PCR擴增與鑒定1、通用引物真菌ITS-rDNA基因通用引物：ITS1： 5-CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A-3ITS4： 5-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3細菌與放線菌16S rRAN基因通用引物：27F: 5- AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG -31492R: 5- GGT TAC CTT GTT ACG ACT T -32、以總 DNA 為模板的 16S rRNA 或 18S rRNA PCR霉菌的擴增：反應(yīng)體系：選用25此 反應(yīng)體系。其中模板DNA 1 pL，ITS1 (10 pmol-L-1) 1 pL，

7、ITS4 (10 pmol-L-1) 1 pL，Master Mix 12.5 pL，補充 ddH 至 25 pL。PCR反應(yīng)條件：94C變性5 min;94 C變性50 s,58C退火50 s,72C延伸60s,循 環(huán)30次； 最后72C延伸10min。細菌的擴增：反應(yīng)體系：同上反應(yīng)條件：細菌的PCR擴增條件:98 C2 min98 C10 sec、55 C15 sec 40個循環(huán)68 C90 sec10C10 min3、菌落 16S rRNA 或 18S rRNA PCR實驗準(zhǔn)備：新鮮菌落、無菌牙簽、0.510ul移液槍、冰盒、PCR管PCR儀細菌PCR擴增體系：2xMightyAmp Buffer Ver.2MightyAmp DNA Polymerase (1.25UL)Eubac27F (10 pmolL)Eubac1492R (10 pmolL)模板ddH2O10gL0.5gL0.5gL0.5gL微量菌體8.5 gL總體系20gL細菌的