1、細胞增殖及調控 如果時光倒流25年，在座的各位還只不過是父母身體里的一個細胞；他們相遇融合為一個細胞，經過不斷地細胞增殖及其對這個過程的精密調控，才長成了今天這樣你。 在今后漫長的人生中，你們身體里的大多數細胞還要繼續增殖并受到調控，如果這個過程發生了異常，健康就會受到威脅HeLa cell in culture幾個概念細胞增殖（cell proliferation）是細胞生命活動的重要特征，包括細胞生長和細胞分裂的過程。細胞生長（cell growth）細胞分裂（cell division）細胞增殖的生物學意義生物繁育的基礎 細胞補充創傷修復第一節細胞周期一、細胞周期概述二、細胞周期各時相的

2、動態變化 前期（prophase）早中期（prometaphase）中期（ metaphase ）后期（ anaphase ）末期（ telophase ）胞質分裂（ cytokinesis ）細胞周期G1期（Gap1 phase）S 期 （S phase）G2期（Gap2 phase）interphaseM phase間期分裂期一、細胞周期概述interphaseprometaphaseprophasemetaphaseanaphasetelophasecytokinesis單向性：G1 S G2 M，不能逆行階段性：各時相的細胞形態和代謝特點都有明顯差異。細胞周期特點不同生物的細胞tC存在

3、很大差異不同組織的細胞TC也有差異tStG2tM 相對恒定變化小G1期持續時間差異大，tG1決定細胞周期的長短。細胞周期時間（tC）從增殖的角度來看，所有真核細胞可分為周期細胞（連續分裂細胞）靜止期細胞（休眠細胞、G0期細胞）終末分化細胞（不分裂細胞）細胞分類指在細胞周期中連續運轉的細胞（細胞增殖） 如小腸絨毛上皮隱窩細胞 表皮基底層細胞 骨髓造血細胞周期細胞(cycling cell)暫時脫離細胞周期，不進行增殖，但在適當刺激下可重新進入細胞周期的細胞 肝脾細胞、淋巴細胞、成纖維細胞靜止期細胞(quiescent cell, G0)指終端分化的細胞，發生不可逆地脫離細胞周期，喪失分裂能力，但

4、保持生理機能活動的細胞 神經元、肌肉細胞、紅細胞終末分化細胞細胞同步化 （synchronization of cells）指在生理過程中自然發生的或經人為處理造成的使細胞處于同一細胞周期時相的方法。 自然同步化與人工同步化 人工同步化選擇同步化誘導同步化有絲分裂選擇法細胞沉降分離法 DNA合成阻斷法有絲分裂中期阻斷法適用于單層培養的細胞利用M期細胞呈圓球狀隆起，與培養皿的附著力減弱的特點振蕩、收集、保存在4、多次重復優點：細胞不受藥物傷害，同步化程度高缺點：分離出來的M期細胞數量較少有絲分裂選擇法(mitotic shake-off)有絲分裂選擇法HeLa cell in culture屬于

5、細胞沉降分離法，適用于任何懸浮培養的細胞處于細胞周期不同時相的細胞體積不同優點：同時獲得大量不同周期時相的同步化細胞，分離效率高，對細胞活性影響小缺點：需專門的裝備、價格貴活細胞離心淘洗法選用DNA合成抑制劑，可逆地抑制DNA合成TdR（胸腺嘧啶核苷）雙阻斷法該方法適用于（tG1+tG2+tM）tS細胞優點：適用于任何培養體系，同步化程度高， 可使所有的細胞同步化缺點：細胞可能出現非均衡生長的問題DNA合成阻斷法第一次阻斷：加入過量的TdR， S期細胞停止運轉，其他期細胞最后停止在G1-S交界處第二次阻斷：移去TdR，釋放時間大于tS時，再次加入過量TdR，細胞群體阻斷在G1-S交界處，再經釋

6、放獲得S期細胞TdR雙阻斷法( double thymidine block)TdR雙阻斷法重點，理解藥物阻斷法有絲分裂中期阻斷法利用某些藥物（ 秋水仙素,Taxol, nocodazole）抑制微管的聚合，抑制有絲分裂器的形成，從而把細胞阻斷在有絲分裂中期優點：操作簡便、同步化效率較高缺點：阻斷的可逆性差Hela, Noc: 100ng/m, 16h二、細胞周期各時相的動態變化 有絲分裂完成到DNA合成之前tG1變化最大，控制著連續分裂細胞的增殖率是細胞生長和DNA合成準備時期中心體分離，為進行中心體復制作準備G1/S檢驗點（限制點，Restriction point）G1 期與DNA合成起

7、始與進行有關的酶與細胞從G1期到S期的轉換有關的蛋白質G1期合成的蛋白質細胞周期蛋白( cyclin D, E等)從DNA合成開始到DNA合成結束的全過程主要生化事件S 期DNA復制組蛋白和非組蛋白合成核小體組裝中心體復制DNA復制檢測點（S phase checkpoint)真核細胞DNA復制特點DNA復制多個復制起點復制起點成簇活化DNA復制不同步GC含量較高的DNA序列在早S期復制AT含量較高的DNA序列在晚S期復制常染色質先復制異染色質在晚S期復制組蛋白與DNA的合成是一種聯動關系在細胞S期存在一個反饋機制，調節游離組蛋白水平，保證組蛋白形成的數量與DNA量相適應。組蛋白合成DNA復制

8、完成到有絲分裂開始前的時期細胞核內DNA含量已增加一倍，由G1期的2n變成了4n活躍的RNA和蛋白質的合成，為M期的分裂作準備。G2 期加速合成微管蛋白，為M期紡錘體微管的組裝提供原料成熟促進因子（MPF）形成已復制的中心體在G2期逐漸長大，并開始向細胞兩極分離G2/M檢驗點G2 期細胞分裂開始到分裂成兩個子細胞的過程染色質高度螺旋化，遺傳物質均等分配，形成2個子細胞RNA合成停止，蛋白質合成減少細胞呈球形紡錘體組裝檢驗點(spindle assembly checkpoint)M 期第二節細胞分裂無絲分裂（amitosis）：是細胞的直接分裂方式;減數分裂（meiosis）：在生殖細胞的成熟

9、過程中進行;有絲分裂（mitosis）：在體細胞中進行，將其遺傳物質載體平均分配到兩個子細胞中.有絲分裂有絲分裂過程人為劃分為前期（prophase）早中期（prometaphase）中期（metaphase）后期（anaphase）末期（telophase） 胞質分裂（cytokinesis）有絲分裂器（mitotic apparatus）紡錘體（spindle）中心粒中心粒周圍物質星體（aster）中心體（centrosome）星體微管動粒微管極微管Microtubule: a/b-tubulin heterodimerChristiane Wiese, and Yixian Zheng,

10、 JCB, 2006Microtubule NucleationK-fiberInterpolar microtubuleAstral microtubuleSpindle Microtubules:Key components of mitotic spindle中心體周期（centrosome cycle） 中心體經過一系列發育過程達到成熟并具有微管組織中心（MTOC）的作用 ；指在間期中中心體的復制至有絲分裂開始時兩個新的中心體分離的過程。中心體周期 Centrosome 染色質凝集開始組裝有絲分裂裝置核仁解體前期（prophase）核被膜崩解核纖層解聚紡錘體進一步裝配紡錘體微管與染色體

11、接觸、結合動粒微管牽拉染色體劇烈地旋轉、振蕩，往返于兩極之間早中期（prometaphase）染色體排列到赤道面上染色體最大程度凝集形成完整的有絲分裂器中期（metaphase）姊妹染色單體相互分離并移向兩極后期A：染色單體向兩極運動后期B：紡錘體兩極移動分開后期（anaphase）Anaphase AAnaphase B子染色體到達兩極動粒微管消失 染色體開始解螺旋核膜碎片重組成完整核被膜核仁重新出現末期（telophase） 開始于細胞分裂后期，完成于細胞分裂末期 分裂溝：赤道板周圍處細胞表面下陷形成收縮環：由微絲束環繞細胞一周形成胞質分裂（cytokinesis）胞質分裂第三節細胞增殖調

12、控一、細胞周期調控的關鍵分子二、細胞周期檢測點難點：有點難，但很重要喔！一、細胞周期調控的關鍵分子細胞增殖是一個多階段、多因子參與，高度精確的過程，這個過程是由不同基因嚴格按照時間順序表達的結果，也是基因與環境因素相互作用的結果。細胞周期的調控是嚴格有序、極其復雜的過程，涉及多個因子在多層次上的作用1960s，LelandHartwell以芽殖酵母為實驗材料，發現cdc28基因cdc28基因編碼一個34KD的蛋白激酶，促進細胞通過G1/S檢測點研究背景budding yeast1970s，Paul Nurse以裂殖酵母為實驗材料發現cdc2基因cdc2基因編碼一個34KD的蛋白激酶，促進細胞通

13、過G2/M檢測點命名為周期蛋白依賴性蛋白激酶 研究背景Fission yeast1980s，Timothy Hunt以海膽為實驗材料發現細胞周期蛋白（Cyclin A和B）研究背景Leland H. Hartwell R. Timothy (Tim) Hunt Sir Paul M. Nurse 2001年10月8日Hartwell、Nurse和Hunt因對細胞周期關鍵調控分子的研究而獲諾貝爾生理學/醫學獎。周期蛋白 （Cyclin）周期蛋白依賴性蛋白激酶（Cyclin-dependent kinase，Cdk）周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制蛋白（Cdk inhibitor，CKI）細胞周期調控的

14、關鍵分子在細胞周期中呈周期性的積累和消失分子結構特點：含周期蛋白框、破壞框結構域Cyclin與Cdk形成二聚復合物，表現出激酶活性，Cdk為催化亞基，Cyclin為調節亞基在高等真核生物中，Cyclins主要包括 Cyclin A-H 8個成員周期蛋白（Cyclin）周期蛋白分類G1-Cyclins： Cyclin DG1/S-Cyclins：Cyclin ES-Cyclins：Cyclin AM-Cyclins：Cyclin BG1G1SG2Mconcentration與周期蛋白結合，進而表現出絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性在高等真核生物中至少有8種，即Cdk 1（Cdc 2）Cdk 8各種Cd

15、k在細胞周期內特定的時間被激活，通過磷酸化底物，驅使細胞完成細胞周期 周期蛋白依賴性蛋白激酶（Cyclin dependent kinase, Cdk）Cyclin磷酸化與去磷酸化(phosphorylation & dephosphorylation)CKICDK活性的調節因素CyclinCDKCKIPSubstrateSubstratePCDK/Cyclin活化位點：第161位的蘇氨酸（T161） 抑制位點：第14位的蘇氨酸（T14）抑制位點：第15位的酪氨酸（Y15） CDK1磷酸化位點CDK1CyclinBThr161Thr14Tyr15PPPPCDK1CyclinBThr161Thr

16、14Tyr15PPCDK1CyclinBThr161Thr14Tyr15PCDK1Thr161Thr14Tyr15PCDK1Thr161Thr14Tyr15CyclinBCDK1Thr161Thr14Tyr15CyclinBCyclinB degradationActive MPFMitosisCdc25Wee1Myt1inactiveRegulation of CyclinB/CDK1磷酸化調節蛋白質泛素化調節CyclinBCdk1CyclinBCdk1UbUbUbUbCdc20APC/CB細胞周期的驅動G1期：CyclinD與Cdk4、Cdk6結合，激活與DNA復制相關的基因表達G1-S期

17、：CyclinE與Cdk2結合，促使細胞通過G1/S檢測點，啟動DNA合成S期：CyclinA與Cdk2結合，使DNA復制得以延續M期：CyclinB與Cdk1結合，促進有絲分裂事件的發生G1/S transitionCDK2/CyclinE CDK4/6/CyclinD 活化RB 磷酸化E2F-1去抑制,激活轉錄G1S又稱細胞促分裂因子（mitosis-promoting factor）、M期促進因子（M phase-promoting factor ）是 Cdk1（Cdc2）和 Cyclin B 形成的復合物促進細胞由G2期進入M期 成熟促進因子（maturation-promoting

18、factor ，MPF ）CDK1CyclinBThr161Thr14Tyr15PG2MG2/M transition對CDK激酶活性起負性調控的蛋白質與CDK或Cyclin-CDK復合物結合，拮抗Cyclin，抑制CDK的激活CKI分為CIP/KIP和INK4兩大家族周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制蛋白（CKI）p21是CIP/KIP家族的典型代表與多種Cyclin-CDK復合物結合，抑制大多數Cdk的激酶活性與DNA復制聚合酶的功能亞基PCNA（增殖細胞核抗原）結合，直接抑制DNA的合成CIP/KIP家族p16是INK4家族的典型代表與Cyclin D競爭性結合Cdk4和Cdk6抑制Cdk 4和

19、Cdk 6的活性抑制Rb磷酸化阻止細胞由G1期進入S期INK4家族CKI 對細胞周期的調控CDKs/CyclinsMG1G2SCKIs: p15, p16, p21, p27Tumor suppressors: p53細胞周期調控二、細胞周期檢驗點（checkpoint）在長期進化過程中，細胞形成了一套保證細胞周期中DNA復制和染色體分配的監控機制，稱為細胞周期檢驗點 高等真核生物和酵母細胞中普遍存在負反饋調節機制 細胞周期檢驗點S checkpoint二、細胞周期檢驗點（checkpoint）DNA損傷檢驗點（DNA damage check point ）：檢測DNA有無損傷、合成有無錯誤

20、， DNA損傷、合成未完成，不能進入S期或M期G1/S檢驗點（G1/S checkpoint）G2/M檢驗點（G2/M checkpoint）早G1期和晚G1之間存在的一個特定檢驗點在酵母細胞中該點被稱為啟動點（start）高等真核細胞中該點被稱為限制點（ R點，restriction point ）G1/S檢驗點是控制細胞增殖的關鍵，由此細胞可能有3種不同命運的出現G1/S檢驗點繼續增殖細胞暫時不增殖細胞不增殖細胞DSBsSensorsTransducersEffectorsCell Cycle ArrestDNA RepairApoptosisDNA Damage Response (DDR)是控制細胞增殖的關鍵，由此細胞可能有3種不同命運的出現G2/M檢驗點繼續增殖細胞暫時不增殖細胞不增殖細胞CDK1CDK1離子輻射DNA損傷激活細胞周期檢驗點的信號傳導通路p53CHK2Pp21CDC25APCDK2p21CyclinECDK2p21CyclinEPPATMMDC153BP1MRNBRCA1MDC153BP1MR