1、第四章 萃取法第一節 溶劑萃取法 廣義的溶劑萃取法(solvent extraction)包括液-固萃取和液-液萃取：液-固萃取又稱浸取、浸提液-液萃取指用一種溶劑將物質從另一種溶劑（如發酵液）中提取出來的方法。溶劑萃取法優點： 操作可連續化，速度快，生產周期短； 對熱敏物質破壞少； 采用多級萃取時，溶質濃縮倍數大、純化度高。缺點： 由于有機溶劑使用量大，對設備和安全要求高，需要各項防火防爆等措施。 一、基本概念 （一）萃取與反萃取 被提取的溶液稱為料液，其中欲提取的物質稱溶質，而用以進行萃取的溶劑稱為萃取劑(extractant) 達到萃取平衡后，大部分溶質轉移到萃取劑中，這種含有溶質的萃取

2、劑溶液稱為萃取液，而被萃取出溶質以后的料液稱為萃余液。 萃取一般指用有機溶劑將物質從水相轉移到有機相的過程。 反萃取(stripping或back extraction)是將萃取液與反萃取劑（一般為水溶液）相接觸，使某種被萃入有機相的溶質轉入水相的過程，可看作是萃取的逆過程。 （二）、分配定律 能斯特分配定律：在一定溫度、一定壓力下，某一溶質在互不相溶的兩種溶劑間分配時，達到平衡后，在兩相中的活度之比為一常數。如果是稀溶液，可以用濃度代替活度，即： K 稱為分配系數 應用分配定律時，須符合下列條件： 必須是稀溶液，即適用于接近理想溶液的萃取體系； 溶質對溶劑的互溶度沒有影響； 溶質在兩相中必須

3、是同一分子形式，即不發生締合或解離。 在萃取過程中，溶質在兩相的分子形式常常并不相同，仍然采用類似分配定律的公式作為基本公式。這時候溶質在萃取相和萃余相中的濃度，實際上是以各種化學形式進行分配的溶質總濃度，它們的比值以分配比(distribution ratio)表示： （三）、萃取因素 萃取因素也稱萃取比，其定義為被萃取溶質進入萃取相的總量與該溶質在萃余相中總量之比。通常以E表示。若以Vl和V2分別表示萃取相和萃余相的體積，M1和M2分別表示溶質在萃取相和萃余相中的平衡濃度。萃取因素（E）為： （四）、分離因素料液中的溶質并非是單一的組分，除了所需產物（A）外，還存在有雜質（B）。分離因素(

4、separation factor)，常用表示，其定義為：在同一萃取體系內兩種溶質在同樣條件下分配系數的比值 二、溶劑萃取法的基本原理 抗生素在不同的pH條件下，可以有不同的化學狀態，其分配系數亦有差別，若適度改變pH，可將抗生素自水相轉入有機相，或從有機相再轉入水相，這樣反復萃取，可以達到濃縮和提純的目的 三、萃取方法和理論收率的計算 （一）單級萃取 萃取因素E為 式中 VF料液體積；Vs萃取劑的體積；C1溶質在萃取液的濃度； C2溶質在萃余相的濃度；K表觀分配系數； m濃縮倍數萃余率：理論收率：例如： 潔霉素在20和pH10.0時表觀分配系數（丁醇/水）為18。用等量的丁醇萃取料液中的潔霉

5、素，計算可得理論收率 若改用1/3體積丁醇萃取， 理論收率： （二）多級錯流萃取萃余率：理論收率 紅霉素在pH 9.8時的分配系數（醋酸丁酯/水）為44.5，若用1/2體積的醋酸丁酯進行單級萃取，則： 理論收率 若用1/2體積的醋酸丁酯進行二級錯流萃取，則 理論收率多級逆流萃取n級萃取后，萃余率為： 理論收率為 青霉素在0和pH2.5時的分配系數（醋酸丁酯/水）為35，若用1/4體積的醋酸丁酯進行二級逆流萃取， 則： n2，理論收率 若改為二級錯流萃取，第一級用1/4體積的醋酸丁酯，第二級用1/10體積的醋酸丁酯，則 第二節 影響溶劑萃取的因素一、乳化和破乳化（一）乳狀液的形成和穩定條件 乳化

6、劑多為表面活性劑。分子結構特點：一般是由親油基和親水基兩部分組成的，即一端為親水基團或極性部分 ，另一端為疏水性基團或非極性部分（烴鏈） 。 乳化劑使乳狀液穩定與以下因素有關：（1）界面膜形成 （2）界面電荷的影響 （3）介質黏度 每一種表面活性劑都有親水和疏水基團，兩種基團的強度的相對關系稱為HLB值（hydrophile-lipophile balance）。完全不親水（HLB=0）和完全親水（HLB=20）的兩種極限乳化劑作為標準，其它表面活性劑的HLB值就處于這兩種極限值之間。 （二）、影響乳狀液類型的因素 1相體積的影響 假定分散相為大小均勻的圓球，按緊密地堆積，圓球體積占總體積的7

7、4%。如水的體積占總體積小于26%時，只能形成WO型乳狀液；大于74%時，只能形成OW型乳狀液。 2乳化劑分子空間構型的影響 截面積小的一頭指向分散相，截面積大的一頭指向分散介質，所以一價金屬皂形成OW型乳狀液，而二價金屬皂形成WO型乳狀液， 3界面張力的影響 乳化劑聚集于界面形成薄膜，若兩相界面張力不等，則使膜彎曲，其凹面一側為界面張力較高的相，高界面張力這側的液體易形成內相。 4容器壁性質的影響 親水性強的容器易得OW型乳狀液，親油性強的容器易形成WO型乳狀液。 （三）、乳狀液的破壞 1、加入表面活性劑 2、離心3、加電解質4、加熱5、吸附法破乳6、高壓電破乳7、稀釋法（四）、常用的去乳化

8、劑1.陽離子表面活性劑（1）十二烷基三甲基溴化銨（1231） CH3(CH2)10CH2(CH3)3N+Br （2）溴代十五烷吡啶（PPB）2.陰離子表面活性劑 陰離子表面活性劑，如亞油酸鈉、十二烷基磺酸鈉、石油磺酸鈉等 3其他破乳劑 如用溴代四烷基吡啶作去乳化劑，因其既易溶于水，又易溶于醋酸丁酯中，既能破壞WO型，也能破壞OW型乳狀液，比PPB破乳完全，用量為0.03%0.05%。它能降低青霉素提取時隨廢液的損失，提高收率。 二、pH的影響1、pH影響弱酸或弱堿性藥物的分配系數2、pH也影響藥物的穩定性例：用醋酸丁酯提取芐基青霉素，在0、pH2.5時測得K表=30，KP=10-2.75，可求

9、得 可按下式計算表觀分配系數和水相pH的關系： 可得，當pH=4.4時，K表=1。當pH4.4時，青霉素從醋酸丁酯相轉移到水相，稱為反萃取。 三、溫度和萃取時間的影響 高溫不穩定 高溫時溶劑間互溶度增大四、鹽析作用的影響 由于鹽析劑與水分子結合，降低了藥物在水中的溶解度，使其易轉入有機相； 鹽析劑降低有機溶劑在水中的溶解度；鹽析劑增大萃余相比重，有助于分相。 五、溶劑種類、用量及萃取方式 分配系數愈大愈好，若分配系數未知，則可根據“相似相溶”的原則，選擇與藥物結構相近的溶劑； 選擇分離因素大于1的溶劑； 料液與萃取溶劑的互溶度愈小愈好；盡量選擇毒性低的溶劑。 溶劑的化學穩定性高，腐蝕性低，沸點

10、不宜太高，揮發性要小，價格便宜，來源方便，便于回收。 如潔霉素20，pH10.0時，分配系數（丁醇水）=18，根據萃取方式理論收得率的計算方法，得出： 第三節 萃取過程和溶劑回收一、混合1、攪拌罐2、管式混合器3、噴嘴式混和器4、氣流攪拌混和罐二、液-液兩相分離 離心機三、溶液回收（一）、單組分溶劑回收 簡單蒸餾 或精餾（二）、低濃度溶劑回收 先簡單蒸餾,后精餾 精餾：塔底102，塔頂91，蒸餾物為恒沸混和物，含水量為28%-29%，超過水在醋酸丁酯中溶解度（20，1.4%）。三、回收與水部分互溶并 形成恒沸混和物的溶劑 四、回收完全互溶的混和溶劑 并不形成恒沸混和物 如丙酮-丁醇混和溶劑，由

11、于其沸點相差較大（丙酮沸點為56.1，丁醇沸點為117.4），采用精餾方法很易得到純組分。如果混和溶劑要反復使用，則不需要將它們分成純組分，只需經過蒸餾方式除去不揮發物質，然后測定混和溶劑的比例，再添加不足的溶劑使達到要求。 第四節 雙水相萃取 雙水相萃取技術(two-aqueous phase extraction) ，又稱水溶液兩相分配技術，它利用不同的高分子溶液相互混合可產生兩相或多相系統，靜置平衡后，分成互不相溶的兩個水相，利用物質在互不相溶的兩水相間分配系數的差異來進行萃取的方法，稱為雙水相萃取法。 特點：能保留產物的活性，操作可連續化，可純化蛋白質25倍。一、雙水相的形成 如葡聚糖

12、與聚乙二醇按一定比例與水混合，靜置平衡后，分成互不相溶的兩個水相，上相富含PEG，下相富含葡聚糖 二、雙水相萃取的基本概念 （一）相圖 相圖右上部為兩相區，左下部為均相區，兩相與均相的分界線叫雙節線。組成位于A點的系統實際上由位于C、B兩點的兩相所組成，BC稱為系線。當系線向下移動時，長度逐漸減小，表明兩相的差別減小，當達到K點時，兩相間差別消失，K點稱為臨界點。 （二）分配系數 影響分配系數的因素包括很多，如粒子大小、疏水性、表面電荷、粒子或大分子的構象等，這些因素微小的變化可導致分配系數較大的變化，因而雙水相萃取有較好的選擇性。分配系數K與溶質的濃度和相體積比無關： 三、影響雙水相萃取的因

13、素 （一）、成相高聚物的分子量 一般原則:對于給定的相系統，如果一種高聚物被低分子量的同種高聚物所代替，被萃取的大分子物質,如蛋白質、核酸、細胞粒子等，將有利于在低分子量高聚物一側分配。 如以Dextran 500(MW 500 000)代替Dextran 40（MW 40 000）,即增大下相高聚物的分子量，被萃取的低分子量物質如細胞色素C分配系數增加并不顯著。然而，被萃取的大分子量物質，如過氧化氫酶的分配系數可增大到原來的67倍。（二）成相聚合物濃度 界面張力 一般來說，雙水相萃取時，如果相系統組成位于臨界點附近，則蛋白質等大分子的分配系數接近于1。高聚物濃度增加，系統組成偏離臨界點，蛋白

14、質的分配系數也偏離1，即K1或K1 （三）、電化學分配 鹽類的影響 鹽對帶電大分子的分配影響很大。各種鹽的分配系數存在著微小的差異，產生了相間電位。由于蛋白質等大分子在水溶液中常帶有電荷，相間電位造成的靜電力能影響所有帶電大分子和帶電細胞粒子在兩相中的分配。例如，DNA萃取時，離子組分微小的變化可使DNA從一相幾乎完全轉移到另一相。（四）、疏水效應 選擇適當的鹽組成，相系統的電位差可以消失。排除了電化學效應后，決定分配系數的其它因素，如粒子的表面疏水性能即可占主要地位。成相高聚物的末端偶聯上疏水性基團后，疏水效應會更加明顯，此時，如果被分配的蛋白質具有疏水性的表面，則它的分配系數會發生改變。

15、（五）、溫度及其它因素 溫度的影響是間接的，它主要影響相的高聚物組成，只有當相系統組成位于臨界點附近時，溫度對分配系數才具有較明顯的作用。 pH對酶的分配系數也有很大關系，特別是在系統中含有磷酸鹽時，如圖4-18所示。由于pH的變化會影響磷酸鹽是一氫化物還是二氫化物磷酸鹽的存在，而一氫化物磷酸鹽對界面電位有明顯的影響。 Dextran、FiColl、淀粉、纖維素等高聚物具有光學活性,它們應該可以辨別分子的D、L型。因此，對映體分子在上述高聚物相系統中具有不同的分配特征。同樣，一種蛋白質對D或L型能選擇性地結合而富集于一相中，可將此用于手性分配。例如，在含血清白蛋白的相系統中，D、L型色氨酸可獲

16、得分離。 四、雙水相萃取的應用 雙水相系統平衡時間短，含水量高，界面張力低，為生物活性物質提供了溫和的分離環境。它還具備操作簡便、經濟省時、易于放大。據報道，系統可從10ml直接放大到1m3規模（105倍）,而各種試驗參數均可按比例放大，產物收率并不降低。 例如PEG-Dextran系統特別適用于從細胞勻漿液中除去核酸和細胞碎片。系統中加入0.1mol/L NaCl可使核酸和細胞碎片轉移到下相（Dextran相）,產物胞內酶位于上相，分配系數為0.11.0。選擇適當的鹽組分，經一步或多步萃取，可獲得滿意的分離效果。如果NaCl濃度增大到25mol/L，幾乎所有的蛋白質、酶都轉移到上相，下相富含

17、核酸。 五、雙水相萃取技術的發展 （一）、廉價雙水相體系的開發 （二）、雙水相親和分配 （三）、液體離子交換劑 ( liquid ion exchanger) 如用PEG6000-(H2PO4)4來分離純化干擾素時，其分配系數可高達170，而雜蛋白的分配系數只有0.04。值為4250，這是一般方法所不能達到的。 第五節 反膠束萃取反膠束（reversed micelle），也稱反膠團或反微團，是表面活性劑分散在連續的有機相中自發形成的納米尺度的一種聚集體。 一、基本原理表面活性劑溶于非極性溶劑中，并使其濃度超過臨界膠束濃度，便會在有機溶劑內形成聚集體，非極性基團在外，極性基團則排列在內，形成一

18、個極性核，此極性核具有溶解極性物質的能力。當含有此種反膠束的有機溶劑與蛋白質的水溶液接觸后，蛋白質及其他親水性物質能夠溶于極性核內部的水中，由于周圍的水層和極性基團的保護，蛋白質不與有機溶劑接觸，從而不會造成失活。 二、反膠束體系 在反膠束萃取的早期研究中多用季胺鹽，目前用得最多的是AOT，其化學名為丁二酸乙基己基酯-磺酸鈉。 三、反膠束萃取過程 反膠束選擇性分離目標蛋白質包括兩個過程:萃取過程(forward extraction)和反萃取過程(backward extraction)。萃取過程:目標蛋白質從主體溶液轉移至反膠束溶液中的過程；反萃取過程:目標蛋白質從反膠束溶液中轉移至第二水相

19、(或以固體的形式游離出來)的過程。這些過程可連續操作，反膠束可在兩套系統中循環。 反膠束相 混合器1 分離器1 混合器2 分離器2進料 前萃取 后萃取出料四、影響因素 表面活性劑的種類 早期用一種表面活性劑,現在混合體系的研究較多 水相pH值 決定蛋白質表面帶電基團的離子化狀態,與表面活性劑的頭部基團有相互作用.溫度 提高溫度可使反膠束排斥水,起濃縮作用 離子強度 降低帶電蛋白與反膠束極性基團的相互作用,并導致高離子強度下反膠束顆粒變小親和反膠束萃取 導入親合配基,提高萃取率和選擇性五、應用舉例 （一）蛋白質類藥物 如蛋白酶、脂肪酶等（二）、氨基酸 親水性不同,疏水氨基酸主要在反膠束界面;親水

20、性氨基酸在反膠束內部極性水中 （三）、抗生素 如膽甾醇-D-丙氨酰胺-D-丙氨酸酯（四）、核酸 第六節 超臨界流體萃取法 超臨界流體（supercritical fluid ，簡稱SCF）萃取技術，又稱壓力流體萃取、超臨界氣體萃取、臨界溶劑萃取等，是利用處于臨界壓力和臨界溫度以上的一些溶劑流體所具有特異增加物質溶解能力來進行分離純化的技術。 一、基本原理 當氣體物質處于其臨界溫度(Tc)和臨界壓力(Pc)以上時，不會凝縮為液體，只是密度增大，具有許多特殊的物理化學性質：流體的密度接近于液體的密度,粘度接近于氣體；在臨界點附近,超臨界流體的溶解度對溫度和壓力的變化非常敏感；利用CO2作為萃取劑主

21、要有以下優點: (1) 二氧化碳超臨界溫度(Tc=31.06)是所有溶劑中最接近室溫的，可以在3540的條件下進行提取,防止熱敏性物質的變質和揮發性物質的逸散。(2)在CO2氣體籠罩下進行萃取,萃取過程中不發生化學反應;又由于完全隔絕了空氣中的氧,因此,萃取物不會因氧化或化學變化而變質。(3)由于CO2無味、無臭、無毒、不可燃、價格便宜、純度高、容易獲得,使用相對安全。(4)CO2是較容易提純與分離的氣體,因此萃取物幾乎無溶劑殘留,也避免了溶劑對人體的毒害和對環境的污染。(5) CO2擴散系數大而粘度小,大大節省了萃取時間,萃取效率高。 二、影響超臨界流體萃取的因素 （一）壓力的影響 壓力增加，絕大多數化合物溶解度都