1、哈爾濱醫科大學博士學位論文文 獻 綜 述遺傳性疾?。╤ereditary disease）簡稱遺傳病，即遺傳物質改變所導致的疾病。遺傳的物質基礎是DNA，作為遺傳信息的載體，DNA分子中核苷酸的組成或序列變化可能使基因表達產物蛋白質的序列或結構發生改變，進而導致蛋白質功能異常。多數變異對機體的功能或健康無影響，并使機體對環境變化產生更大的適應能力，這種無害的突變稱為多態性（polymorphism）。但某些突變會影響機體的功能，并以一定的方式傳遞給后代，從而導致遺傳性疾病的發生。另外基因組的不穩定性同樣也可能導致遺傳病。遺傳性疾病的研究是醫學遺傳學的主要內容，也是人類遺傳學的重要突破口。遺傳性

2、疾病的研究通常采用基因定位的方法尋找致病基因，并通過研究基因突變與疾病發生的相關性，來進行遺傳病的診斷、篩查及相應的治療。白內障（cataract）是一種發病率高、嚴重危害人類生存質量的疾病，對其研究歷史已達一個世紀之久。在先天性白內障(congenital cataract)的分子遺傳學研究中，主要以家系研究為基礎，通過連鎖分析方法確定致病基因在染色體上的位置，并采用定位候選克隆策略，選取可能的候選基因進行突變分析，以期對疾病的發病機理有更加深入和透徹的認識。下面僅就遺傳性疾病、基因定位策略及其相關的遺傳學算法（主要為簡單疾病研究中的連鎖分析）及遺傳性先天性白內障的研究進展做綜合論述。一 遺

3、傳性疾病從環境與機體統一的觀點看，人的健康決定于人的遺傳結構與其周圍生活環境相互作用的平衡，遺傳物質或環境因素的改變均可導致這種平衡的破壞而產生疾病，因此可以說，任何疾病的發生都是遺傳因素與環境因素相互作用的結果。據此可將疾病大致分為以下三類： 遺傳因素起主導作用的疾??； 環境因素起主要作用的疾病； 遺傳因素與環境因素都很重要，遺傳因素提供了產生疾病的必要的遺傳背景，環境因素促使疾病表現出相應的癥狀和體征。 遺傳性疾病的特點遺傳性疾病通常具有先天性、終生性和家族性的特點。突變若發生在配子形成（gametogenesis）期，則雙親并沒有這類缺陷，而這個患病個體成為起始突變者，若患病個體存活下去

4、并能夠延續后代，他（她）就可能成為后代子孫患病的祖先，此現象稱建立者效應（founder effect）。但有些基因突變或染色體畸變具有致死性或明顯降低生殖力，以致這種缺陷不能傳遞到后代。遺傳性疾病常表現為先天性（如遺傳性先天性白內障）且終生患病，但先天性疾?。╟ongenital disease）并不都是遺傳病。在胎兒發育過程中，由于環境因素或母體條件的影響，可出現非遺傳性先天性疾病。而有些遺傳性疾病表現為晚發，尤其是那些由遺傳和環境條件共同支配表現型的遺傳性疾病，某些致病基因的作用僅在個體達到一定發育階段后才表現出來，遺傳性疾病通常表現為家族性，主要是因為同一家系中的成員可能共同具有某一致

5、病基因。但同一家系的成員長期處于相似的生活條件和環境中，使得那些受環境因素影響較大的非遺傳性疾病有時也具有家族性。同時一些遺傳性疾病（隱性遺傳病）僅在基因型為純合狀態下才表現出來，發病概率小，因而相似于散發性疾病。遺傳性疾病的發病中存在著異質性現象，臨床上完全相同或極為相似的癥候群可以由兩種或更多的基因突變所導致，如家族性腦海綿狀血管瘤（Cerebral cavernous malformation, CCM，OMIM#116860）等?？傮w說來，遺傳性疾病具有以下幾個特征： 垂直傳遞（vertical transmission）遺傳病不同于水平傳遞的傳染病，而是具有上代傳遞給下代的特點。但不

6、是每個遺傳病的家系中都能觀察到這一現象。因為有的患者是首次突變產生的病例，即為患病家系中患者的“始祖”；有些遺傳病特別是染色體異常的患者，由于活不到生育年齡或不育，以致在家系中觀察不到垂直傳遞的現象。 遺傳物質的突變或染色體畸變。 不是任何細胞的遺傳物質改變都可以傳給下一代，只有生殖細胞或受精卵的遺傳物質發生改變才可以傳給下一代。腫瘤是一種體細胞遺傳病，這種病變一般不能傳給下一代。 患者在親代和子代中以一定數量出現，即患者與正常家庭成員之間有一定的比例關系。 在有親緣關系的個體之間的婚配（近親婚配）所生育的子代中遺傳病發病率高于一般群體，且該病不延伸至無親緣關系的個體。 單卵雙生比異卵雙生患病

7、的機會大得多。 遺傳性病的分類依遺傳物質改變的不同，目前普遍將遺傳性疾病分為五類：單基因疾病或稱簡單疾?。╩onogenic or simple disorder）、多基因疾病或稱復雜疾?。╬olygenic or complex disorder）、染色體?。╟hromosomal disease）、線粒體遺傳?。╩itochondrial disease）和體細胞遺傳?。ò┌Y）。1 單基因疾病單基因疾病(monogenic disease)是指受一對主基因異常的影響而發生的疾病，它的遺傳符合孟德爾定律，也稱孟德爾式遺傳的疾?。∕endelian disease）。目前，人類單基因遺傳的性狀

8、有6,000多種。依傳遞方式不同，又可分為常染色體顯性遺傳病、常染色體隱性遺傳病、X連鎖(顯性和隱性) 遺傳病和Y連鎖遺傳病。 常染色體顯性（autosomal dominant, AD）遺傳病常染色體顯性遺傳病是指如果其致病基因位于常染色體上，以顯性的方式遺傳，即雜合時即可發病。如并指I型、軟骨發育不全和成骨不全癥I型。常染色體顯性遺傳病系譜圖有以下特征： 除新突變外每一患者的雙親中必有一患者； 患者的子女或同胞中患者與非患者的機會各為一半； 性狀的傳遞與性別無關，即男性與女性患者都可以將遺傳性狀傳遞給兒子或女兒，且患病機會均等； 患者的正常子女所生育的后代全部正常； 如該病不損害患者的生存

9、和生育，該性狀便呈垂直傳遞。常染色體顯性的遺傳方式包括完全顯性(complete dominance)、不完全顯性(incomplete dominance)或半顯性(semidominance)、共顯性（codominance）、從性顯性(sex-influenced dominance)、延遲顯性(delayed dominance)和不規則顯性(irregular dominance)。目前已知人類大約有3,000余種遺傳性狀（包括遺傳?。┦前闯Ｈ旧w顯性遺傳方式傳遞的。 常染色體隱性(autosomal recessive, AR)遺傳病如果一種疾病其致病基因位于常染色體上，傳遞方式是

10、隱性的，即雜合時并不發病，而是由攜帶者攜帶著致病基因向后代傳遞，直至隱性純合時才發病，以這種方式遺傳的疾病就稱為常染色體隱性遺傳病。這類異常已被認識到1,730種，如白化病。常染色體隱性遺傳病的系譜有如下特點： 患者雙親無病而肯定是攜帶者； 患者同胞中1/4將會患病而且男女患病機會均等； 患者子女一般并不發病，所以看不到連續傳遞，常為散發的病例； 在近親婚配的情況下，子女中發病風險增高。在致病基因頻率低的常染色體隱性遺傳病中，發病往往由近親婚配后所導致。 X連鎖遺傳病有些簡單遺傳病的致病基因位于X染色體上，在上下代之間隨著X染色體傳遞，稱為X連鎖遺傳(X-linkage inheritance

11、)。這類異常已被認識412種。包括X連鎖顯性(X-1inkage dominant, XD)和X連鎖隱性 (X-1inkage recessive, XR) 遺傳。X連鎖遺傳中基因傳遞的方式不同于常染色體遺傳，其存在著交叉遺傳 (criss-cross inheritance) 的現象。也即是男性的X連鎖基因只能是從母系傳來，并只傳遞給他的女兒。 X連鎖顯性遺傳病若是疾病的致病基因位于X染色體上，雜合時即可發病，稱為X連鎖顯性遺傳病，如遺傳性腎病。X連鎖顯性遺傳病系譜特征如下：A. 家系中女性患者多于男性患者；B. 患者雙親一方患??；如果雙親都無病，則該患者為起始突變者；C. 由于交叉遺傳，男

12、性患者的女兒全將發病兒子則正常的；女性患者的子女各有1/2發??；D. 連續傳遞即?？梢娺B續幾代中都有發病患者。 X連鎖隱性遺傳病若某種遺傳病的致病基因位于X染色體上，雜合時并不發病、直至純合時發病，稱為X連鎖隱性遺傳病，如假肥大型肌營養不良和甲型血友病。在這類遺傳病中，男性只有一條X染色體，稱為半合子(hemizygote)，因為Y染色體上無等位基因，所以男性也會表現出相應的疾病。X連鎖隱性遺傳病系譜特征如下： A. 家系中男性患者遠多于女性患者，在一些致病基因頻率低的疾病中，很少看到女性患者；B. 雙親無病時，兒子有l/2風險患?。慌畠簞t無患病風險；C. 由于交叉遺傳，患者的兄弟、姨表兄弟、

13、舅父、外甥存在患病風險；D. 因為一些XR病有致死效應，所以很少看到有男性中連續傳遞，多見經女性攜帶者傳遞。 Y連鎖遺傳病某些疾病的致病基因位于Y染色體上，隨Y染色體而傳遞，從男性傳給男性，稱為Y連鎖遺傳（Y-linkage inheritance）或全男性遺傳（holandric inheritance），這類異常已被認識19種，如無精子因子。2 多基因疾病除了單基因遺傳病外，臨床上還可見到另外一些在人群中發病率較高（1%）、常表現為家族性聚集傾向的性狀或疾病。常見性狀如身高、智商等，常見疾病如糖尿病、特發性高血壓、唇裂、腭裂和精神分裂癥等。這些遺傳性狀或遺傳病不決定于一對主基因，其遺傳基礎

14、是多對基因，這些基因對該遺傳性狀或遺傳病形成的作用是微小的，且效應大小不一，經積累、疊加或互補后可以形成明顯的表型，稱為微效基因（minor gene）、加性基因(additive gene)或修飾基因（modifier gene）。近些年研究表明，多基因疾病的遺傳基礎中除微效基因外，也有一些主基因的參與，并受環境因素的影響，所以這類疾病稱為多基因遺傳(ploygenic inheritance)病或稱多因子遺傳(multifactorial inheritance)病，又稱復雜疾病(complex disorder)。遺傳基礎和環境因素共同作用決定人體是否易于患病稱易感性（susceptib

15、ility），在群體多基因遺傳病中呈正態分布，當達到一個限度即閾值（threshold）后個體即表現發病。多基因病的遺傳常見如下特點： 發病有家族性聚集傾向，患者親屬發病率高于群體發病率，但繪成系譜后不符合任何一種單基因遺傳方式，同胞中發病率遠低于1/2或1/4，即不符合AD、AR、XD或XR； 患者雙親、同胞、子女的親緣系數相同，均為1/2，有相同的發病風險。這與AR病不同，AR病患者雙親和子女般并不發病，而肯定是攜帶者，患者同胞的發病風險為1/4； 隨著親屬級別的降低，患者親屬的發病風險迅速降低，群體發病率愈低的病種中，這種特征愈明顯，這與AD病中親屬級別每降低一級，發病風險降低1/2的情

16、況也是不同的； 近親婚配時，子女的發病風險也增高，但不如AR病那樣顯著； 發病率有種族(或民族)差異，這表明不同種族(或民族)的基因庫是不同的。3 線粒體遺傳病在有性生殖中，受精方式的約束決定了線粒體病的母系遺傳現象。曾有一些學者提出某些疾病可能屬細胞質遺傳，直到1987年Wallace等通過對線粒體DNA突變和Leber病的關系進行研究后，才明確提出線粒體DNA突變可引起人類的疾病。短短的十幾年，這一領域的發展十分迅速。現已發現人類100余種疾病與線粒體DNA突變有關，如線粒體心肌病、帕金森等。4 染色體病染色體病是先天性染色體數目異?；蚪Y構畸變而引起的疾病。數目異常包括整倍體（如三倍體、四

17、倍體）和非整倍體（如亞二倍體，超二倍體）數目異常，結構畸變包括缺失、重復、倒位、易位等斷裂、連接和環狀染色體等。染色體的行為對基因組穩定性有著十分重要的作用，因此當出現數目和結構異常時常引起多種疾病或綜合征，對機體危害極為嚴重，甚至可能致死。臨床上常見的染色體遺傳病有Klinefelter綜合征、Turner綜合征、Downs綜合征等。5 體細胞遺傳病體細胞中遺傳物質改變導致的疾病稱為體細胞遺傳病。體細胞中遺傳物質的改變，一般不向后代傳遞。在各種腫瘤的發病中都涉及到了特定組織中染色體和癌基因或抑癌基因的變化，所以是體細胞遺傳病。 遺傳性疾病的研究方法遺傳性疾病研究最主要的方法是以家系研究為基礎

18、的連鎖分析（linkage analysis）和以群體研究為基礎的連鎖不平衡分析(linkage disequilibrium analysis，又稱等位基因關聯分析，allelic association)，兩者都是利用分布于人類基因組內高度多態的遺傳標記（genetic marker）來尋找致病基因所在的染色體區域。遺傳圖譜（genetic map）又稱連鎖圖譜(linkage map)或遺傳連鎖圖譜(genetic linkage map)，是指人類基因組內基因以及專一的多態性遺傳標記相對位置的圖譜。多態性遺傳標記是建立遺傳圖譜的要素，也正是由于遺傳標記的發展，使得遺傳圖譜的研究經歷了從

19、經典的基因連鎖圖譜到現代的DNA標記連鎖圖譜的過程。在經典遺傳學中，重組體在群體中出現的機率（即重組率）可以反映同一條染色體上兩個座位間的相對距離和位置關系。因此經典的遺傳圖譜主要研究多樣性基因所構成的連鎖群（linkage group）以及連鎖群中各基因的線性關系，它可以顯示一個連鎖群內等位基因的順序，但不能告訴人們某個基因的具體位置，更不能克隆這一基因。經典的遺傳圖譜只是停留在遺傳學的表象階段，其實際利用價值不大?，F代遺傳圖譜概念最早由Botstein提出，其精髓在于將單純的表型研究深入到DNA分子的本質上去，即表型多樣性對應于DNA分子的多樣性。1 遺傳標記及其相關參數 遺傳標記目前為止

20、遺傳標記共經歷了三代的發展，伴隨著遺傳標記的發展，人類也開始逐步了解基因組的結構與功能。 第一代遺傳標記第一代標記是一類經典的遺傳標記。最初主要是利用蛋白質或免疫學的標記，如ABO血型位點標記、HLA位點標記等。但是由于已知的多態的蛋白質很少，等位基因的數目有限且無法獲得足夠的信息量和檢測技術的繁瑣等因素，限制了人類基因組的遺傳分析工作，這促使人們設法從DNA上尋找標記。70年代中后期建立起來的限制性片段長度多態性（Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP）是第一代多態性DNA標記。這類標記在整個基因組中確定的位點數目可達105以上。RFLP

21、主要研究對象是各種形式的序列水平上的DNA限制性多態性，包括單堿基改變、插入或缺失突變、長度重復多態性等引起酶切位點的獲得或丟失，經限制性內切酶特異性切割后，由于DNA一個“點”上變異所造成的“能切”與“不能切”的兩種狀況可產生不同長度的片段（即等位片段，allele），再通過凝膠電泳來顯示這一長度的多態性，并從片段多態性的信息與疾病表型間的關系進行連鎖分析，找到致病基因。這一方法最成功應用是在發病率較高、病情嚴重的Huntington舞蹈癥基因的定位。雖然RFLP遍布于整個基因組，但有其局限性，即由于酶切只能產生23個片段，可提供的信息量有限，有時還需要用放射性同位素標記的DNA片段為探針檢

22、測RFLP，因而又存在著工作環境和費用等問題。 第二代遺傳標記第二代遺傳標記即大量可變數量串聯重復（variable number tandem repeat, VNTR），比第一代標記物有很大的優越性，包括微衛星（microsatellite）和小衛星（minisatellite）等。微衛星標記系統也稱簡短串聯重復（short tandem repeat, STR），于1989年被發現和建立，重復單位為2-6個核苷酸，其最突出的優點是：在基因組中分布較廣，數目多；由于CA等簡短重復不受進化上的選擇，以至于在同一位點中數目變化很大，具有高度多態性，提供的信息量相對很大；符合孟德爾遺傳規律。這樣

23、就可以為連鎖分析提供足夠多的遺傳信息，又加之利用PCR及電泳進行檢測的手段相對容易，可以實現操作自動化，使得這一系統成為目前在基因定位的研究中應用最多的標記系統，并用做大規?；蚪M掃描方法的基礎。微衛星系統使人類基因組的遺傳制圖與連鎖分析發生了革命性的變化，在一定程度上推動了許多復雜的多基因遺傳病的研究。1996年初，法國Gnthon實驗室與美國國立衛生研究院幾個中心合作，建立了有5,264個以STR為主體的遺傳標記，兩個標記之間的平均距離為0.7cM，即兩個位點之間有0.7的幾率進行遺傳重組(1)。 第三代遺傳標記隨著基因組研究的發展，1996年美國麻省理工學院（MIT）的人類基因組研究中心

24、負責人Lander ES又提出了一類新的稱作SNP（Single Nucleotide Polymorphism, SNP）的遺傳標記系統(2)，即單核苷酸多態性標記，也稱第三代遺傳標記系統。人類群體中有很大的遺傳多樣性，而在大多數基因位點上都會有若干個等位型（alleles）；對每一個核苷酸來說，其突變率大約為10-9左右，這就意味著每一個核苷酸在任何一代人群中大約每1109個個體就會發生一次變異。由這種方式產生的單堿基變異就形成許多雙等位型標記（biallelic maker），這種標記平均約每1,000個堿基對就會有一個，在人類基因組中可達3106個。因此34個相鄰的這種標記構成的單倍型

25、（haplotype）就可以有816種，相當于一個微衛星標記形成的多態性，目前已知約有60,000個SNP位于基因外顯子區域，即85%的基因外顯子相距5kb就有1個已發現的SNP。這種標記的開發和應用摒棄了遺傳標記分析技術的“瓶頸”凝膠電泳，同時數目多、覆蓋密度大，為DNA芯片或微陣列技術應用于遺傳作圖提供了基礎，因此在基因定位研究中就有著其它標記不可比擬的優越性(3)。 多態性標記的相關參數能夠成為DNA標記的多態性位點必須具有足夠的信息度（informativeness）。衡量信息度的參數主要有多態信息含量（polymorphic information content, PIC）和雜合度

26、（heterozygosity）。標記的多態信息含量是家系中推斷得到的信息提供者的期望分數，理論上PIC應在01之間，PIC等于0時意味這一標記位點的等位片段只有一個，等于1時表示其等位片段無限多，一般認為PIC大于0.7的標記是高信息度的。雜合度是指隨機選擇的某個個體在某一標記位點上同時有兩個雜合的等位片段的可能性。PIC一般要比雜合度低，因此可以作為某些特殊交配條件下雜合度的校正量。標記系統的信息度對于遺傳病的基因定位是非常關鍵的，往往直接影響多態性標記連鎖圖譜的構建。目前典型的基因組掃描使用微衛星標記密度在10cM左右，雜合度大多在0.65-0.8之間，如Genthon的遺傳圖譜的終分辨

27、率為0.7。一般說來，在相同PIC值要求下，SNP圖譜的密度應為微衛星圖譜的2.25-2.5倍。這樣，在相同的信息提取效果下，使用10cM間隔的微衛星圖譜即300個左右的微衛星標記進行的初期連鎖分析，與4cM分辨率的約750個SNP圖譜差不多，但顯然后者對基因定位的范圍更窄。提高某個位點信息度和雜合度的方法是確定該位點相鄰近區域的其他多態性位點，一定范圍內多態性位點連鎖相所構成的單倍型就可以做為一個整體的標記位點去看待。2 基因定位與克隆建立起表型與基因型之間的關系是遺傳學的基本目標，人類遺傳學主要分析引起個體間表型差異的遺傳機制，醫學遺傳學則主要研究導致疾病發生的遺傳機制。然而，尋找決定表型

28、或疾病性狀的基因是非常困難的，因為無法象對待其它生物一樣對人體進行實驗干預。雖然孟德爾的遺傳規律很早就已經用于植物以及動物的育種工作，但在1980年提出使用遺傳多態性標記來進行全基因組連鎖分析之前，人們甚至是對于簡單的孟德爾遺傳病也沒有一個可以普遍使用尋找致病基因的方法。人類基因組計劃開展后，人們對自身基因組有了進一步的了解，隨著遺傳圖譜、物理圖譜、序列圖譜和基因圖譜的發展和完善，以及與此相應發展起來的技術和算法為人們提供了研究表型和基因型的紐帶，使人們認識到越來越多的疾病的直接病因及其發病機制?；蚨ㄎ?gene mapping)就是利用不同的方法將基因確定到染色體的實際位置上。在基因定位的

29、歷史上，1911年Wilson人類將紅綠色盲基因首次定位到X染色體上，開創了基因定位的先河?；诩夹g及方法的局限性，1968年前利用家系連鎖分析定位的基因都局限于X染色體， 1968 年Donahue利用系譜分析將Duffy血型基因定位于1號染色體上，這是人類首次將基因定位于常染色體上。1970年代以來，各種生物技術迅速興起，特別是體細胞雜交、重組DNA、分子雜交和PCR等技術的出現和應用，使得基因定位的方法愈益先進。隨著人類基因組計劃的正式啟動，基因定位更是迅猛發展，其成果是導致克隆了越來越多的致病基因，提高了對疾病產生的病因學認識，并開拓了先進的基因診斷和基因治療技術?；蚨ㄎ挥畜w細胞雜交

30、（somatic cell hybridization）、雜種細胞克隆嵌板(panel of clonal hybrids)、原位雜交（in situ hybridization, ISH）、熒光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization, FISH)、放射雜種(radiation gybrid)、同線同源定位、連鎖分析(linkage analysis)等方法。無論是哪種方法，都是試圖建立基因和疾病表型之間的某種可能聯系。其中連鎖分析既是最傳統又是與現代生物技術結合有新發展的重要基因定位方法。人類的各種遺傳病有6,000多種，許多遺傳病導致的表型與正常表型

31、相比形成了遺傳病的多樣性。利用表型多樣性與多態性的DNA標記間的連鎖分析，我們就可以將該致病基因定位于染色體的某一位置乃至某個標記附近，再通過各種其他手段，就有可能克隆到該基因，從而為揭示遺傳病的致病機理及進一步遺傳咨詢和治療奠定基礎。目前用于克隆的方法主要有4種： 定位克?。╬ositional cloning）定位克隆是伴隨著人類基因組計劃而發展起來的基因克隆的新策略，是通過疾病表型來觀察致病基因與多態性標記之間的連鎖關系，而將基因定位并進一步分離和克隆的策略。其起點是定位，即建立表型（包括疾?。┡c基因組中的某一區域之間的聯系，然后應用“物理圖譜”的物理標記來將經典遺傳學標記轉變為“物理標

32、記所代表的明確的基因組區域，再以相關區域的“鄰接克隆群”來篩選可表達的結構基因，即建立該區域的轉錄圖，然后比較患者與正常人這些結構基因的區別以確定與疾病相關的改變，最后確定疾病相關基因。定位克隆抓住了“表型”與“基因”之間的實質性聯系，而摒棄了在這兩者間發生的多途徑、多因子參與、漫長而復雜的生理生化過程。 功能克?。╢unctional cloning）人類的性狀（包括疾?。┒寂c蛋白質功能有關。功能克隆便是從蛋白質功能著手的基因分離策略，是利用基因的產物蛋白質或RNA推知相應基因的序列。功能克隆技術成熟、方法直接、費用較低，且不依賴于基因組信息。在許多研究中，由于對疾病癥狀的生理生化及有關蛋白

33、質了解甚少，因此功能克隆較為適用。其缺點是得不到每一基因的具體功能，也不易與人類遺傳性疾病取得從表型到遺傳型的一致性。鐮狀細胞貧血病的基因鑒定就是功能克隆的典型例子。 候選克?。╟andidate cloning）候選克隆策略是隨著人類基因組計劃的進展，已定位克隆的基因越來越多的情況下派生出來的一種新的捷徑。它是根據與遺傳疾病可能相關的生理特征，去進一步確定與這些生理特征相關的候選基因，再在這些候選基因上尋找與疾病表型可能相關的數據，以此確定致病基因的方法。候選克隆策略主要是對一些多基因或表型復雜的疾病較為適用，但其風險較大，而且受到許多尚未克隆的可能相關候選基因的限制。 定位候選克隆（pos

34、itional candidate cloning）定位候選克隆是定位克隆與其他幾種克隆手段的交叉和結合，是基于家系基礎上的遺傳性疾病研究最常用的方法，也是目前最有前途和發展前景的克隆策略。它是通過遺傳圖譜與連鎖分析先將致病基因定位于染色體的某一適當狹窄的區域，再對該區域中分布的基因位點一一進行篩選和確認從而找到與遺傳病相關的基因。其基本步驟如下： 搜集有價值的遺傳病家系并進行詳細的資料整理。對遺傳病家系要進行認真細致的資料整理工作，并采集家系成員外周血進行DNA提取。一個較大、多世代個體、親緣關系肯定的大家系，能在一定程度上排除座位異質性；而詳盡確鑿的臨床診斷不但能確定疾病的類型，還能排除家

35、系的臨床異質性，這些都為后續研究提供了良好的工作基礎； 應用連鎖分析的方法對疾病的遺傳位點進行定位。選擇足夠數量和適當密度的多態性遺傳標記對家系中成員的DNA進行基因掃描，可分初步掃描和精細掃描兩步進行，力求將致病基因精細定位至染色體適當狹窄區域； 用多個遺傳標記的基因分型組成家系成員的單倍型，根據單倍型重組情況盡可能縮小連鎖區域； 在已確定的染色體區域內，利用人類基因組數據庫中已有的數據，尋找與疾病的生理、生化及功能相關的候選基因； 對候選基因進行突變分析，尋找能夠引起蛋白質產物序列或結構改變、并引起功能障礙的病理性突變或其他改變，如單堿基改變、插入、缺失突變等，并確認與疾病發生相關的突變；

36、 對致病基因的突變進行功能研究，進一步確認其在疾病發病中的作用。從二十世紀八十年代晚期定位候選策略取得成功后，已經成功確定了幾百個遺傳病的基因，最成功的例子是囊性纖維化(CF)基因的定位與克隆。囊性纖維化是一種嚴重的常染色體隱性遺傳病，以前關于該基因的mRNA和蛋白質結構無任何資料。人們利用定位克隆策略將該基因定位于7q，并借助DNA標記進行遺傳分析將這一區域進一步縮小，通過“染色體步移”和“染色體跳躍”技術找到了致病基因，并將由基因結構推測得到的氨基酸序列和已知功能的蛋白質序列相比較獲得了有關基因功能的信息。這就為研究突變引起的基因功能改變開辟了廣闊的領域，并使人們進一步認識到基因突變與疾病

37、嚴重程度和病程變異之間的相互關系Vogel-Motulsky,1999。目前，由于人類基因組計劃的不斷完善，人類染色體上的大部分基因序列已知。隨著分子方法在生物學和醫學諸多領域的廣泛應用，不借助于任何已知的單基因性狀或疾病，而直接分析正?；虻姆椒ㄔ絹碓狡毡椤? 連鎖分析 連鎖（linkage）是一種遺傳現象，指當同一染色體上某些位點由于相距很近，在減數分裂過程中發生交換的機率較小，因此具有較大的機會連在一起從親代傳到子代。連鎖分析（linkage analysis）既是最早、較傳統的，又是與現代生物技術相結合有新發展的重要基因定位方法。隨著對多種疾病研究的深入，人們逐漸認識到以連鎖圖譜為工具

38、進行基因定位，進而采用基因克隆策略可以獲得從表型到基因型的直接聯系，具有不可比擬的優點。利用連鎖的原理研究致病基因與遺傳標記的關系，也就是根據基因座位的重組率來計算兩座位之間的遺傳距離。由于基因在染色體上呈直線排列，不同基因相互連鎖成連鎖群（linkage group），因此可以通過被定位的基因與同一染色體上另一基因或遺傳標記相連鎖的特點進行基因定位。 連鎖分析的原理生殖細胞中一對同源染色體上存在的兩個相鄰基因座位，在減數分裂時可以發生交換，距離越遠發生交換的機會越多，越有可能出現基因重組。重組率與成熟分離過程中遺傳物質的交換密切相關，染色體上位點之間的距離越遠，發生重組的可能性就越大；距離越

39、近，則重組的可能性就越小。確定位點之間遺傳距離通常借助統計學方法來進行。經典方法是計算位點間的重組分數（recombination fraction）或稱重組率（recombination rate），通常用q 表示，即兩個配對的基因間所有組合事件中發生重組的比率或發生交換的配子數占總配子數量的百分比率。1910年摩爾根提出同一染色體上兩個位點間在100次減數分裂中發生1次重組的機會時，即q 等于1時定義兩位點間的相對距離為1厘摩（centimorgan, cM），這一相對距離稱為遺傳距離（genetic distance）。嚴格地說，重組率并不等同于遺傳距離，僅僅在表示同一染色體上兩座位之間

40、關系時，重組率才等于遺傳距離。重組率q 介于0-50%，如果等于50%就意味著完全隨機組合而失去意義，也就是兩個不連鎖（位于不同染色體上或位于同一染色體上但相距甚遠）基因的重組率，其遺傳效應類似于位于不同染色體上的座位的“自由組合”。在遺傳圖譜上相距較遠的兩個基因座之間，由于二次重組的存在，重組值會變小，但不會超過50%。同一染色體上座位之間的遺傳學距離是可以累加的，人類基因組的遺傳大小為3,600cM。 連鎖分析的研究方法連鎖分析通常采用家系分析的方法，通過研究遺傳標記與致病基因位點在家系中的共分離現象來研究二者連鎖與否，從而確定致病基因位點。傳統的連鎖分析方法包括經典的優勢對數分數法和多點

41、連鎖定位法等，一般要提供諸如外顯率、擬表型率及遺傳模式等參數。為了克服傳統連鎖分析方法需要一定參數的缺點，在等位基因共享的基礎上發展起來許多非參數連鎖分析法，常用有受累同胞對（affected sib-pair, ASP）和受累家系成員（affected pedigree member, APM）法。其理論基礎是來源于同一祖先的致病基因由受累的親屬共占(identical by descent, IBD)的幾率要大于隨機分配的幾率。等位基因共占的分析方法較連鎖分析方法檢測樣本和DNA標記所需更多，僅是對家系要求降低，不需要完整的家系資料，兄弟、叔侄等配對資料也適用，因此可以作為傳統連鎖分析方法

42、的補充。 優勢對數分析法(logarithm of odds score, likelihood of odds score, Lods)連鎖分析中最常用和公認有效的是Morton 于1955年首次提出后經改進的Lod值法。它是指在給定q值的前提下，兩個遺傳位點連鎖的概率相對于不連鎖的概率比值的常用對數值，常用Z表示，q即發生交換的配子占總配子的數量比。公式為：Z(q)=log10 L(q)/L(1/2) ( 0q0.5)若Z(q)-2則可以排除連鎖；-2Z(q)1或Z(q)1，提示連鎖；Z(q)2，支持連鎖；Z(q)3，表明在給定q值的條件下連鎖的可能性比不連鎖的可能性等于或大于一千倍，提示

43、連鎖有極顯著意義，可定義為連鎖；對于X連鎖來說，LOD值或Z(q)2時，即可定義為連鎖。重組率的判斷為：q0.10為緊密連鎖（遺傳距離小于10cM；0.10q0.45表示兩位點不在同一條染色體上。Lod值法是一種參數方法，進行分析時要給出疾病的遺傳模式、疾病的基因頻率、外顯率、擬表型率等，這些參數須通過于臨床、流行病學資料來獲取。應用Lod值法對分析的家系有一些要求，雙親或單親(即其中一個親代)必須是雙雜合子(即所分析的兩個性狀均處于雜合狀態的個體)。這樣，人們便能通過兩雜合性狀在其子代中的連鎖和互換情況進行Lod值估算。Lod值法是一種序貫概率比檢驗法，其優點是：可用于分析較易獲得的二代小家

44、系資料，可以將不同的家系的資料合并處理；可用于雙重雜合子的連鎖相及親代基因型未知的情況；所需樣本量較小，一旦根據計算結果能作結論即可停止調查；估計基因重組率結果可靠。 多點連鎖定位法(multpoint linkage mapping)多點連鎖定位法可將一致病基因定位于遺傳標記的框架內。在分析兩個以上基因座數據時，多點連鎖分析是有用的。分析多基因座可建立一套基因座染色體的次序，為此應用三點雜交(three-point cross)法，比在一系列的兩點交換分析估計A、B和C三個基因之間的重組值更為有效。這類多點定位作圖的優點有助于克服標記的有限信息。在一家系中某些減數分裂可對標記A提供信息，而另

45、一些對A無信息，但對鄰近的標記B可提供信息，只有同時用標記A、B進行疾病基因連鎖分析才能提供信息?，F在已有提供很高信息的微衛星標記，這樣就可以構建一個有次序的多點標記框架來確定某一致病基因的位置。 受累同胞對分析法（affected sib-pair, ASP）該法由Penrose于1935年提出。應用ASP法檢出連鎖關系，并不依賴于遺傳模式，而是依賴于受累的患病同胞對是否共享等位基因。ASP法適用于分析具有2個或以上患病同胞和他們父母組成的小家系，主要對患病同胞中共有的遺傳標記和易感主基因相連鎖的單倍型進行分析，如果兩個位點不連鎖，就會符合孟德爾的獨立分配定律，此時1/4的受累同胞對共享父源

46、和母源遺傳標記的0個等位基因，1/2的受累同胞對共享等位基因中的1個等位基因，1/4的受累同胞對共享2個等位基因。如果遺傳標記與致病基因連鎖的，受累同胞對共享等位基因就會偏離這一比例。共有1個或者2個等位基因患病同胞對的比例會升高，共有0個等位基因的患病同胞對的比例則會降低。ASP法已經有許多統計分析方法比較成熟，如Suarez法、Green法、IBS法等， I型糖尿病和類風濕性關節炎就采用該方法進行分析的。對于發病晚而難于獲得幾個世代遺傳標記和發病狀態的數據者，Lod值法就無能為力，而ASP法仍可獲得明確結果。即使在疾病存在異質性時，ASP法仍具有較強的檢驗連鎖能力。 受累家系成員法（aff

47、ected pedigree member, APM）受累家系成員連鎖分析作為IBD的一種，是ASP法的一個推廣，是通過任何兩個有血緣關系受累親屬標記位點的分布來檢驗DNA標記與致病基因的分離是否獨立，從而推斷兩者是否連鎖的一種統計方法。從理論上講APM法不如ASP法，但仍具有以下優點：數據來源較廣、標記表型的檢測工作量小，數據處理簡捷；不需準確設定疾病的遺傳模型，適用于不符合孟德爾遺傳方式的復雜疾病的連鎖定位分析；可用于較難獲得多代標記基因型與發病狀態數據的遲發性遺傳病及發病后易易死的疾病。該方法已成功地運用于乳腺癌、Alzheimer等疾病的基因定位分析。APM法的缺點是不能提供致病基因位

48、點與連鎖標記位點之間的距離；需提供各標記等位基因的群體基因頻率數據；基因頻率的準確性對檢驗效能有很強影響；另外，標記位點的多態性程度也會影響APM的計算。 連鎖分析的軟件進行連鎖分析主要借助于各種各樣的計算機軟件，常用的有LINKAGE軟件包、GENEHUNTER以及用于構建連鎖圖的MULTIMAP、CRI-MAP和MAPMARKER等。LINKAGE軟件包是比較經典的連鎖分析軟件，適合于大家系的連鎖分析，其中每個個體只用少量遺傳標記即可進行分析。GENEHUNTER由于計算機運行速率的限制，一般只適用于不超過20人的小家系，每個個體須用大量遺傳標記進行分析，除了可用于單基因疾病的連鎖分析外，

49、GENEHUNTER還可以進行非參數分析。 連鎖分析的應用及其發展連鎖分析技術出現之前，人們只能通過表型對遺傳病的進行深入研究。因此“經典”的遺傳學分析不得不遵循這樣一條途徑：以表型為起點，由器官、組織、細胞、亞細胞結構逐層深入，直到獲取基因及其突變的有關信息。生化遺傳學的發展使人們可以從基因產物的水平（如酶缺陷）通過遺傳密碼將氨基酸的改變與DNA的變異聯系起來。但是這種方法的局限性在于，對某種疾病研究的初期不可能對病因有很深入的認識，而生化指標并不能準確無誤地指向某一缺陷，因此很難將疾病的表型與特定的遺傳缺陷聯系起來。簡單疾病的致病基因定位最成功的方法是連鎖分析，它采用家系樣品，尋找家系內遺

50、傳標記與疾病在傳遞中的分離情況。由于物理位置接近的位點比相距更遠的位點在減數分裂重組中更難分離開，因此與疾病狀態共分離的遺傳標記事實上提示了致病基因在染色體上的大致位置。連鎖分析的優點在于不依賴于對疾病病理和生理生化異常的了解。對于很多單基因疾病，只要提供足夠的家系及流行病學資料、適當可提供多態性信息的DNA標記、有效的統計方法和分析軟件，便可以利用連鎖分析方法將致病基因進行定位，從而為定位克隆策略提供了基礎。另一方面，連鎖分析也可以應用于疾病診斷，即使致病基因尚未被克隆，也可通過遺傳標記進行連鎖分析，將致病基因定位于染色體特定區域并以此來進行位置候選基因克隆。連鎖分析對致病基因進行定位，應選

51、擇足夠數量的覆蓋整個人類基因組的多態性遺傳標記。通常我們選擇ABI公司提供的經優化的、成套的微衛星標記，對家系中成員的樣本進行全基因組的初步掃描，經連鎖分析提示與疾病發生相關的染色體區域，進一步利用法國Gnthon實驗室提供的高密度遺傳標記對致病基因進行精細定位。對多個遺傳標記的基因分型排列每個家系成員的單倍型，根據單倍型的重組情況確定致病基因在染色體上的精細區域，盡可能縮小連鎖區域。通過單倍型在減數分裂過程中的重組現象可以把與疾病表型連鎖的單倍型區域縮小到較小的范圍。在定位區域內部或者附近利用人類基因組數據庫中已有的數據尋找與疾病的生理生化功能相關的候選基因選擇可疑基因作為候選基因，然后對其

52、進行DNA序列分析，查找突變并對其進行功能研究。傳統的連鎖分析在單基因遺傳病的基因定位中做出了很大的貢獻，但仍存在著一定的局限：首先，連鎖分析的分辨率常是以厘摩(cM)為單位，在人類基因組中這意味著幾百甚至上千個基因；其次，即使家系分析定位到了基因水平，找到的突變也很可能只是在特定家系中呈孟德爾方式傳遞，而對群體范圍的復雜疾病表型并沒多大幫助。另外復雜疾病外顯率很低，這意味著需要大量的可用信息才能檢測到關聯，而符合統計效力的大家系幾乎不可能找到。在簡單疾病基因定位的最后階段，人們也常使用連鎖不平衡分析，因為它利用群體來進行研究，有效地利用了過去歷史上許多世代發生的重組事件的影響，因此能進行基因

53、的精細定位。由于連鎖分析和連鎖不平衡分析各自的優缺，在復雜疾病的研究中人們常采用結合這兩種方法的“兩步法遺傳分析”來定位基因。這種方法先使用家系樣品和較為疏散的遺傳標記，通過連鎖分析定位大的候選區域；再使用家系樣品或基于群體的樣品對連鎖提示的區域進行高密度遺傳標記的連鎖不平衡分析來精細定位，現在已經有很多這方面的成功范例。隨著人們對遺傳性疾病的研究深入，連鎖分析的算法及軟件有了諸多改進，并且在復雜性疾病的基因定位中也起到了一定作用。二 遺傳性先天性白內障 圖1 眼球水平切面圖 晶狀體的生理構造眼是視覺器官，包括眼球、視路和眼附屬器。眼球由眼球壁和內容物組成，如圖1。眼球壁由外向內依次為纖維膜（

54、包括角膜和鞏膜）、血管膜（包括虹膜、睫狀體和脈絡膜）和視網膜。眼內容物包括房水、晶狀體和玻璃體，通常與角膜一起統稱為眼的屈光裝置，透明且具有一定的屈光指數，以保證光線通過。圖2 晶體剖面圖晶狀體（lens）也稱晶體，是眼屈光裝置的重要組成部分，具有獨特的屈光通透和折射功能，在視力調節中起重要作用。當看近物時，睫狀肌收縮，睫狀體向前方移動，睫狀小帶放松，晶狀體借彈性而變厚，屈光增強；反之，在看遠物時，睫狀肌舒張使睫狀小帶拉緊，晶狀體變薄。晶狀體還可濾去部分紫外線，對視網膜有保護作用。晶體發生病變時容易混濁產生白內障，從而引起視覺障礙。晶狀體為具有彈性的雙凸透明體，本身無血管和神經，其營養由房水和

55、玻璃體供給。晶狀體形似雙凸透鏡（如表2），分為前后兩面，前面的曲度較小，中心點為前極；后面的曲度較大，中心點為后極；兩面相接的邊緣為赤道。前后極間的直線叫晶體軸，軸的長度即晶體厚度為45mm，晶體直徑為9-10mm。晶體的組織結構為： 包圍整個晶體的囊； 位于前囊下的上皮細胞； 晶體細胞（晶體纖維）； 晶體懸韌帶。 晶體囊 （lens capsule）晶體囊是一層富有彈性和韌性的均質性透明薄膜，包繞著晶體上皮及晶體細胞，是晶體上皮細胞的分泌產物。晶體囊為上皮細胞的基底膜，囊與上皮緊密相連，兩者之間沒有任何間隙。上皮細胞代謝旺盛區（生發區）即赤道部的前囊及赤道部囊最厚；后囊為胚胎上皮細胞的產物，

56、出生以后后囊下已無上皮細胞，不再增厚，所以后囊最薄。 晶體上皮 （lens epithelium）晶體上皮位于前囊及赤道部囊下，新生晶體細胞表面為單層上皮細胞，后囊下沒有上皮（胚胎發育過程中后部上皮已形成原始晶體細胞）。晶體上皮分為中央部（前極部）、赤道部及介于兩者之間的中間部，中央部為靜止區，中間及赤道部為生發區，其中赤道部上皮細胞不斷增生形成新的晶體細胞，三區的上皮細胞結構相似。上皮細胞的細胞質內含有粗面內質網、游離核糖體，較小的線粒體，高爾基體、微管與微絲。上皮細胞逐漸向赤道部移行，細胞核呈圓形及橢圓形，并逐漸伸長，核膜界限清楚。 晶體細胞（lens celles）細胞為單層立方上皮，長

57、約8-10mm的六棱柱體，構成晶狀體的實質，是晶體代謝、合成及運轉過程的中心。赤道部細胞逐漸變長、脫核，排列規則，傳統上稱為晶體纖維（lens fibers）。晶體纖維的增加在赤道部終生不停，新生的纖維柔軟位于晶體外圍構成晶體皮質；舊的纖維被推向中心部脫水硬化形成晶體核。成人晶體按其形成的年齡不同而分為許多區，形成幾個密度不同的核，如圖3。 圖3 成年人晶體分區A：胚胎核； B：胎兒核； C：嬰兒核； D：成年核；E：皮質；F：晶體上皮細胞；G：囊膜 胚胎核：位于晶體最中央的透明區，由胎生1-3個月產生的原始晶狀體纖維組成。 胎兒核：位于胚胎核之外，由胎生3-8個月形成的晶體纖維構成。 嬰兒核

58、：自出生前數周到青春期形成的晶體纖維組成，位于胎兒核之外的薄層。 成人核：由青春期之后形成的晶體纖維組成。 皮質：位于前后囊下、上皮下最新形成的晶體纖維總稱皮質。成人眼晶體約有2,100-2,300個晶體細胞。表層的細胞比深層長，最年輕的細胞位于囊下。晶體細胞有規則地排列成行，縱貫整個皮質，終止于囊下不同深度的前皮質縫與后皮質縫即Y字縫。電鏡顯示：在赤道部形成的新的晶體細胞具有細胞核及見于上皮細胞內的細胞器。隨著新細胞的形成，老的晶體細胞向皮質內移位，細胞器逐漸減少以至消失，細胞核逐漸消失。深部皮質的晶體細胞僅有細胞膜，細胞質內含有均勻一致的細胞顆粒，偶爾可見殘留的細胞核。隨年齡增長，晶體核不斷增大變硬，同時由于新纖維不斷形成，晶體皮質亦增大。晶狀體的彈性逐漸減弱乃至消失，使晶狀體變扁，調節聚焦的能力減弱，形成老花眼，當晶狀體混