1、Reverse transcription中心法則圖示第1頁/共78頁第一節 DNA的復制第2頁/共78頁DNA復制是一個由多種酶催化和有多種蛋白質參與的受到精密調控的過程； DNA是細胞中唯一具修復系統的生物大分子。第3頁/共78頁復制：復制：以親代（母鏈）以親代（母鏈）DNA為模板合成子代為模板合成子代DNA的過程。的過程。復制復制親代親代DNA子代子代DNA一、一、DNADNA復制的一般特征復制的一般特征第4頁/共78頁（一）半保留復制 DNA生物合成時，母鏈生物合成時，母鏈DNA解開解開為為兩股單鏈，各自作為模板按堿基配對規律，兩股單鏈，各自作為模板按堿基配對規律，合成與模板互補的子鏈

2、。子代細胞的合成與模板互補的子鏈。子代細胞的DNA，一股單鏈從一股單鏈從親代完整地接受親代完整地接受過來，另一股過來，另一股單鏈則完全單鏈則完全從新合成從新合成。兩個子細胞的。兩個子細胞的DNA都和親代都和親代DNA堿基序列一致。這種復制方堿基序列一致。這種復制方式稱為式稱為半保留復制半保留復制。半保留復制第5頁/共78頁DNA復制可能的三種方式第6頁/共78頁 半保留復制的證明：半保留復制的證明： Meselson Meselson 和和StahlStahl將同位素將同位素1515N N標記的標記的1515NHNH4 4ClCl加入大腸桿菌的培養基中培養加入大腸桿菌的培養基中培養1212代，

3、代，使大腸桿菌的使大腸桿菌的DNADNA都帶上都帶上1515N N的標記，然后的標記，然后將該大腸桿菌轉入將該大腸桿菌轉入1414N N的普通培養基中培養的普通培養基中培養后，分離子一代、子二代、子三代、子四后，分離子一代、子二代、子三代、子四代代DNADNA，進行，進行氯化銫氯化銫密度梯度離心，實驗密度梯度離心，實驗證明了證明了DNADNA的半保留復制。的半保留復制。第7頁/共78頁由Meselson和Stahl設計證明半保留復制的實驗的被譽為生物學最美麗的實驗第8頁/共78頁Meselson 和Stahl的證明DNA半保留復制的實驗流程 第9頁/共78頁1515N-DNAN-DNA的密度大

4、于的密度大于1414N-DNAN-DNA的密度的密度第10頁/共78頁第11頁/共78頁按半保留復制方式，子代按半保留復制方式，子代DNA與親代與親代DNA A的的堿基序列一致堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現了遺傳的傳信息，體現了遺傳的保守性保守性。遺傳的保守性，是物種穩定性的分子基礎，遺傳的保守性，是物種穩定性的分子基礎，但但不是絕對的不是絕對的。半保留復制的意義第12頁/共78頁DNADNA復制的起點和方式復制的起點和方式 復制起點：DNA復制總是從某一特定區域開始，這個特定區域是基因組內的一段特殊堿基序列，稱為復制起點，ori或O不同生物有不同

5、的復制起點，但都富含AT配對特征富含A T配對的區域經常處于開發與閉合的動態平衡之中，稱為DNA的呼吸作用。在原核生物中，復制起始點通常為一個，而在真核生物中則為多個。 第13頁/共78頁DNA復制起始區的特征第14頁/共78頁復制子復制子（replicon）一個復制子只含有一個復制起點。兩個相鄰起始點之間的兩個相鄰起始點之間的DNADNA片段，稱為一個復制子。片段，稱為一個復制子。復制子是獨立完成復制的功能單位。復制子是獨立完成復制的功能單位。 第15頁/共78頁AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCAT

6、GACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母鏈母鏈DNA 復制過程中形成復制過程中形成的復制叉的復制叉子代子代DNA 復制叉復制叉第16頁/共78頁電鏡下真核生物DNA的多個復制叉結構第17頁/共78頁復制叉的結構當DNADNA復制從起始區起動的時候，起始區的DNADNA雙鏈因發生解鏈而形成叉狀結構，這樣的結構被稱為復制叉 第18頁/共78頁大多數原核和真核生物復制時，大多數原核和真核生物復制時，DNA都是都是從從固定起始點固定起始點開始向兩個方向解鏈，形成兩個開始向兩個方向解鏈，形成兩個延伸

7、方向相反的復制叉，稱為延伸方向相反的復制叉，稱為雙向復制雙向復制。復制方向 （1） 雙向復制（bidirectional replication）（2）單向復制 從特定的位置開始，單方向進行復制。（3）不對稱的雙向復制 第19頁/共78頁雙向復制雙向復制單向復制單向復制第20頁/共78頁（三）、半不連續復制 1、 體內僅存在5 3的DNA聚合酶2、 先導鏈與后隨鏈（崗崎片段）第21頁/共78頁先導鏈先導鏈后隨鏈后隨鏈岡崎片段岡崎片段先導鏈：先導鏈：后隨鏈：后隨鏈：復制方向與解鏈方向一致復制方向與解鏈方向相反岡崎片段岡崎片段第22頁/共78頁第23頁/共78頁RNARNA引物引物DNADNA聚合

8、酶聚合酶 不能不能催化兩個游離催化兩個游離dNTPdNTP在在DNADNA模板上聚模板上聚合合 需要具需要具3 3-OH-OH的引物的引物RNARNA聚合酶聚合酶 能催化兩個游離能催化兩個游離NTPNTP在在DNADNA模板上聚合模板上聚合 提供提供3 3-OH-OH 引物最后被引物最后被DNADNA聚合聚合酶酶除去、補滿，再除去、補滿，再由連接酶連接由連接酶連接第24頁/共78頁發現（發現（19681968）：）： 同位素實驗，同位素實驗，3 3HdTHdT 短時間內為短時間內為DNADNA小片段小片段一段時間后一段時間后檢測檢測到到 DNADNA大片段。當用大片段。當用DNADNA連接酶的

9、變異株時，檢測到大量連接酶的變異株時，檢測到大量DNADNA片段的片段的積累。積累。證明證明DNADNA復制中有小片段合成。復制中有小片段合成。測定測定DNADNA小片段，遠遠大于合成小片段，遠遠大于合成DNADNA的一半。的一半。由于由于U U替代替代dTdT，被尿嘧被尿嘧啶啶- -N-N-糖基酶切除。糖基酶切除。在缺少尿嘧啶在缺少尿嘧啶- -N-N-糖基酶的突變植株中，糖基酶的突變植株中，檢測到一半檢測到一半3 3H H標記出現在標記出現在小片段（小片段（岡崎片段岡崎片段）中。）中。第25頁/共78頁二 DNA DNA復制的酶學1、使DNA鏈解離的酶l 解旋酶l 單鏈DNA結合蛋白l DN

10、A旋轉酶（拓撲異構酶）第26頁/共78頁（1）解螺旋酶）解螺旋酶(helicase)（DnaB 蛋白）：蛋白）：利用利用ATP供能，作用于氫鍵，使供能，作用于氫鍵，使DNA雙鏈雙鏈解開成為兩條單鏈解開成為兩條單鏈（2）單鏈）單鏈DNA結合蛋白結合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB)在復制中維持模板處于單鏈狀態并保護單在復制中維持模板處于單鏈狀態并保護單鏈的完整鏈的完整 E.Coli中的中的SSB 以四聚體形式存在，與以四聚體形式存在，與DNA結結合具有協同作用。合具有協同作用。DNADNA復制的酶學復制的酶學第27頁/共78頁1010 8 8

11、 局部解鏈后局部解鏈后（3）DNA拓撲異構酶(DNA topoisomerase) 拓撲異構酶：該酶能暫時性地切斷和重新連接雙鏈DNA，作用是將負超螺旋引入DNA分子。同復制有關。第28頁/共78頁解鏈過程中正超螺旋的形成解鏈過程中正超螺旋的形成第29頁/共78頁 此酶以DNA為模板合成一段RNA,這段RNA作為合成DNA的引物（Primer)。實質是以DNA為模板的RNA聚合酶。1、RNA引物酶：2 2、DNADNA復制過程中的酶復制過程中的酶第30頁/共78頁n(2) DNA聚合酶：n原料：原料：四種脫氧核苷三磷酸四種脫氧核苷三磷酸 （dATPdATP、dGTP dCTP dTTP)dGT

12、P dCTP dTTP)n需要模板：需要模板：以以DNADNA為模板鏈，合成子代為模板鏈，合成子代DNADNA，模板可以，模板可以是雙鏈，也可以是單鏈是雙鏈，也可以是單鏈DNADNA。合成產物與模板互補。合成產物與模板互補。n 需要引物：需要引物：一小段一小段RNA(RNA(或或DNADNA）為引物，在大腸桿）為引物，在大腸桿 菌中，菌中，DNADNA的合成需要一段的合成需要一段RNARNA鏈作為引物，引物含鏈作為引物，引物含3 3 -OH. -OH. n合成方向：合成方向：5 5 3 3 第31頁/共78頁第32頁/共78頁 DNAP I: 占聚合酶總活性的90% 在DNA修復中起作用(19

13、99年得到證明) 主要的DNA復制酶 在DNA修復中起作用（在1999年發現）在DNA修復中起作用（在1999年發現） DNA聚合酶家族第33頁/共78頁 在真核生物中，目前發現的DNADNA聚合酶有五種，分別命名為DNADNA聚合酶（pol pol ），DNADNA聚合酶（polpol），DNADNA聚合酶（polpol），DNADNA聚合酶（pol pol ），DNADNA聚合酶（polpol）。 其中，參與染色體DNADNA復制的是polpol（延長滯后鏈）和polpol（延長前導鏈），參與線粒體DNADNA復制的是polpol，polpol與DNADNA損傷修復、校讀和填補缺口有關，p

14、olpol只在其他聚合酶無活性時才發揮作用。 第34頁/共78頁參與參與DNA復制的酶復制的酶與蛋白因與蛋白因子子第35頁/共78頁（一）復制的起始（二）復制的延長（三）復制的終止三、DNA復制過程：第36頁/共78頁復制原點復制原點oriC和原點的識別：和原點的識別： DNA DNA的復制有特定的起始位點，叫做的復制有特定的起始位點，叫做復制原點復制原點。常用。常用ori C(ori C(或或o o）表示。大腸桿菌的復制原點）表示。大腸桿菌的復制原點ori Cori C由由245245個個bpbp構成，含兩組保守的重復序列：三個構成，含兩組保守的重復序列：三個13bp13bp的序列（富含的序

15、列（富含A A、T T的序列）和四個的序列）和四個9bp9bp的序列；許多生物的復制原點也都是的序列；許多生物的復制原點也都是富含富含A A、T T的區段的區段。第37頁/共78頁（一）復制起始（一）復制起始1 1、拓撲異構酶解開超螺旋。、拓撲異構酶解開超螺旋。2 2、Dna ADna A蛋白識別并在蛋白識別并在ATPATP存在存在下結合于四個下結合于四個9bp9bp的重復序列。的重復序列。3 3、在類組蛋白、在類組蛋白HUHU、ATPATP參與下，參與下， Dan ADan A蛋白變性蛋白變性1313個個bpbp的重復序的重復序列列, ,形成開鏈復合物。形成開鏈復合物。4 4 、Dna BD

16、na B借助于水解借助于水解ATPATP產生產生的能量在的能量在Dna CDna C的幫助下沿的幫助下沿5 5 33 方向移動，解開方向移動，解開DNADNA雙鏈，雙鏈，形成前引發復合物。形成前引發復合物。5 5、單鏈結合蛋白結合于單鏈。、單鏈結合蛋白結合于單鏈。6 6、引物合成酶（、引物合成酶（Dna GDna G蛋白）蛋白）開始合成開始合成RNARNA引物。引物。第38頁/共78頁第39頁/共78頁(二二) 鏈的延鏈的延長（岡崎片長（岡崎片段的合成）段的合成） 真核生物的真核生物的岡崎片段為：岡崎片段為：100-200bp100-200bp 原核生物的原核生物的岡崎片段為：岡崎片段為：10

17、00-2000bp1000-2000bp第40頁/共78頁 DNA DNA鏈的延伸鏈的延伸 在在DNADNA聚合酶聚合酶的催化下，的催化下，以四種以四種5 5 - -脫氧核苷三磷脫氧核苷三磷酸為底物，在酸為底物，在RNARNA引物的引物的3 3端以磷酸二酯鍵連接上脫端以磷酸二酯鍵連接上脫氧核糖核苷酸并釋放出焦氧核糖核苷酸并釋放出焦磷酸。磷酸。DNADNA鏈的延伸同時進鏈的延伸同時進行前導鏈和滯后鏈的合成。行前導鏈和滯后鏈的合成。兩條鏈方向相反。兩條鏈方向相反。 先導鏈先導鏈 后隨鏈后隨鏈 岡崎片段岡崎片段 半不連續復制半不連續復制岡崎模型岡崎模型第41頁/共78頁岡崎片段引物的切除、缺口的填補

18、和切口的連接岡崎片段引物的切除、缺口的填補和切口的連接:第42頁/共78頁(三三) 復制的終復制的終止止順時針終止陷阱順時針終止陷阱逆時針終止陷阱逆時針終止陷阱 Ter: Ter:終止陷阱，引起復制終止的特定區域，終止陷阱，引起復制終止的特定區域，20bp20bp的序列，終止的序列，終止利用物質利用物質TusTus可識別并結合，從而導致可識別并結合，從而導致DNADNA復制的終止。復制的終止。第43頁/共78頁真核生物復制特點真核生物復制特點真核生物真核生物DNADNA復制與原核生物復制與原核生物DNADNA復制的復制的不同點：不同點：真核真核DNADNA有多個復制原點；有多個復制原點；2 2

19、真核生物有多種聚合酶。真核生物有多種聚合酶。 3 3真核生物染色體為線性，末端具有端粒結構，由端粒酶合成真核生物染色體為線性，末端具有端粒結構，由端粒酶合成 4 4真核生物染色體復制涉及核小體結構真核生物染色體復制涉及核小體結構第44頁/共78頁從哺乳動物中分出種從哺乳動物中分出種DNA polDNA pol酶。分別為酶。分別為polpol、。 PolPol（4 4亞基）：有引物合成酶活性。具有合成亞基）：有引物合成酶活性。具有合成RNARNA后后45dNTP45dNTP的活性。無外切酶活性。持續性中等，約為的活性。無外切酶活性。持續性中等，約為100100核苷酸，完成滯核苷酸，完成滯后鏈后鏈

20、DNADNA復制。復制。 PolPol（2 2亞基）：有持續合成亞基）：有持續合成DNADNA鏈的能力，有鏈的能力，有3 3 5 5 核酸外切核酸外切酶活性（具有校正功能），完成前導鏈酶活性（具有校正功能），完成前導鏈DNADNA復制。復制。 PolPol（11亞基）：相當于亞基）：相當于E.E.colicoli的的polpol，是一種修復酶，具，是一種修復酶，具有有3 3 5 5 核酸外切酶活性。核酸外切酶活性。 PolPol（1 1亞基）：與損傷修復有關。亞基）：與損傷修復有關。 PolPol（2 2亞基）：是線粒體亞基）：是線粒體DNADNA合成酶（合成酶（3 3 55 外切酶）外切酶）

21、 第45頁/共78頁四、特殊類型的復制 （一） 線粒體復制 線粒體DNA 雙鏈閉環結構：重鏈、輕鏈 取代環復制（D環復制）第46頁/共78頁D-環復制線粒體和葉綠體DNA通常以D-環的方式進行復制。少數病毒，如腺病毒，也進行D-環復制 。催化線粒體DNA復制的酶是DNA聚合酶，兩條鏈的合成都需要先合成RNA引物，但都不形成岡崎片段，因此都是連續合成。 兩條子鏈的合成在時間上的不同步。 第47頁/共78頁D D環復制環復制（displacement replicationreplication）線粒體線粒體DNADNA的雙股鏈分為輕鏈的雙股鏈分為輕鏈和重鏈。它的復制是一種單和重鏈。它的復制是一種

22、單向不對稱的特殊復制方式向不對稱的特殊復制方式, ,稱稱為為環復制。環復制。復制從重鏈（鏈）的原點復制從重鏈（鏈）的原點開始，新合成的鏈置換原開始，新合成的鏈置換原來鏈，游離的單鏈稱為取代來鏈，游離的單鏈稱為取代鏈（鏈（displacementdisplacement）或環。）或環。 當鏈合成進行到約當鏈合成進行到約2/32/3時，時，輕鏈（鏈）的原點暴露出輕鏈（鏈）的原點暴露出來，并引發其合成，延伸方來，并引發其合成，延伸方向與鏈的相反。向與鏈的相反。 第48頁/共78頁D D環復制 第49頁/共78頁（二）、噬菌體和病毒DNA的復制1. 單鏈環狀DNA病毒的復制1、第一階段：以親本單鏈（）

23、為模板，合成 互補鏈（），形成閉合的雙鏈環狀復制形。2、第二階段：滾環復制。一個負鏈可以合成許多 正鏈，正鏈用于噬菌體包裝。3-OH5-P3-OH5-P第50頁/共78頁2. 線狀DNA病毒的復制 1、雙鏈線狀DNA的復制 有兩種起始類型：從DNA分子的中間起始 從DNA分子末端起始腺病毒DNA的復制：從DNA分子末端起始， 以單鏈置換形式進行。第51頁/共78頁圖 p116頁第52頁/共78頁（2）、單鏈線狀DNA的復制：微小病毒的復制圖 p118頁第53頁/共78頁RNA 模板模板逆轉錄酶逆轉錄酶DNA-RNA 雜雜化雙鏈化雙鏈RNA酶酶單鏈單鏈DNA逆轉錄酶逆轉錄酶雙鏈雙鏈DNA3. 逆

24、轉錄病毒的復制： 從單鏈RNA到雙鏈DNA的生成分三步第54頁/共78頁u 逆轉錄酶有三種活性：RNA指導的DNA聚合酶活性；RNase活性；DNA指導的DNA聚合酶活性。第55頁/共78頁u 逆轉錄過程： 逆轉錄病毒RNA與宿主tRNA分子互補形成局 部雙鏈，以tRNA為引物，合成DNA負鏈5端。 由RNaseH水解去除雜化雙鏈中的RNA 5端。 新合成DNA負鏈的3端跳到模板RNA的3端， 并通過兩條鏈上共同的R序列形成雜交鏈。 DNA負鏈向5端延伸。 RNaseH去除雜化雙鏈中的絕大部分RNA 。 第56頁/共78頁 RNaseH去除RNA和tRNA引物。 DNA正鏈的正鏈的3端跳到端跳

25、到DNA負鏈的負鏈的3端，端， 以兩條鏈共有的以兩條鏈共有的PBS序列雜交，形成局部雙鏈。序列雜交，形成局部雙鏈。 雙向延伸完成DNA雙鏈合成。 以剩余的一段RNA作引物合成DNA正鏈的3端。 第57頁/共78頁第58頁/共78頁第59頁/共78頁 （一）內源性損傷 1. DNA復制錯誤：錯配等 2. 堿基存在互變異構體，形成錯誤堿基配對 3. 自發的化學變化：脫嘌呤、脫氨基 4. 氧化作用損傷堿基一一 DNA DNA損傷類型損傷類型第60頁/共78頁（一）內源性損傷1、DNA的復制錯誤： 復制錯誤引起損傷，在DNA損傷中最為多見。2、由于堿基本身存在互變異構體，可能形成錯誤 的堿基配對。l

26、復制錯誤最多見于尿嘧啶（U）的滲入， 另外偶有其它堿基的滲入。第61頁/共78頁3、自發的化學變化：（1）脫嘌呤或脫嘧啶作用：是指DNA分子上丟掉了嘌呤堿或嘧啶堿，形成無堿基位點，稱為AP部位 (apyrimidine，apurine site , AP)。 在生理狀態下，脫嘌呤是脫嘧啶的20倍。（2）脫氨基作用：即胞嘧啶、腺嘌呤及鳥嘌呤 的環外氨基自發丟失。 胞嘧啶尿嘧啶；腺嘌呤次黃嘌呤； 鳥嘌呤黃嘌呤。脫氨基所至的堿基轉 變可影響DNA的復制，由此產生突變。第62頁/共78頁4、氧化作用損傷堿基：代謝產生活性氧基團，使DNA氧化損傷第63頁/共78頁（二）外源性損傷（二）外源性損傷 物理因

27、素物理因素 化學因素化學因素 紫外線損傷（共軛雙鍵）紫外線損傷（共軛雙鍵） 電離輻射損傷（電離輻射損傷（X X線線/ / 線）線） 亞硝酸鹽亞硝酸鹽 C UC U 5-5-溴尿嘧啶溴尿嘧啶 5-BU A 5-BU A 氮芥類氮芥類 烷化劑烷化劑 羥胺羥胺 C- A C- A GG第64頁/共78頁 物理因素： 由紫外線、電離輻射、X X射線等引起的DNADNA損傷。其中，X X射線和電離輻射常常引起DNADNA鏈的斷裂，而紫外線常常引起嘧啶二聚體的形成，如TTTT，TCTC，CCCC等二聚體。這些嘧啶二聚體由于形成了共價鍵連接的環丁烷結構，因而會引起復制障礙。 第65頁/共78頁 化學因素：堿

28、基類似物：5-BU,5-BU,齊多夫定堿基修飾劑：亞硝酸、烷化劑第66頁/共78頁二二 DNA DNA損傷在藥物評價中的應用損傷在藥物評價中的應用遺傳毒性試驗：檢測DNA損傷以及損傷的固定多種方法組合實驗第67頁/共78頁 誘變育種 常用誘變劑：射線、烷化劑、堿基類似物、移碼突變劑等三三 DNA DNA損傷與抗生素菌種誘變損傷與抗生素菌種誘變第68頁/共78頁v 在長期的進化過程中，生物體演化出了一整套十分有效的DNA損傷修復系統，包括： 糾正偶然復制錯誤的系統復制修復 DNA聚合酶的35校讀功能 DNA糖苷酶修復系統 錯配修復系統等第三節 DNA修復 復制后修復：主要包括 重組修復系統、SOS修復系統。 修復環境因素致DNA損傷的系統損傷修復 主要包括：光修復系統、切除修復系統第69頁/共78頁1、尿嘧