1、 掌握石蠟切片制作的基本過程及其注意事項。 實驗材料: 植物材料、石蠟、酒精、二甲苯、番紅/固綠染色液等； 實驗儀器和器皿：石蠟切片機、展片機、染色缸、載玻片、蓋玻片等。石蠟制片的基本步驟石蠟制片的基本步驟1.取材取材2.固定、保存固定、保存3.脫水脫水4.透明透明5.浸蠟與包埋浸蠟與包埋6.切片切片7.粘片與烤片粘片與烤片8.脫蠟與復水脫蠟與復水9.染色染色10.切片脫水、透明和封固切片脫水、透明和封固1.取材取材 1.1 材料來源及部位：材料來源及部位：與觀察目的有關與觀察目的有關 種類種類 部位部位 發育階段發育階段 觀察橫切面還是縱切面？觀察橫切面還是縱切面？1.2 取材原則：取材原則

2、： 動作：快，輕，用力均勻動作：快，輕，用力均勻 體積合適（體積合適（5-10mm為宜）為宜） 刀要鋒利刀要鋒利2. 固定、保存固定、保存 目的目的-殺死各種酶，殺死各種酶，保持細胞的結構保持細胞的結構 固定液固定液 固定時間固定時間 固定后的處理固定后的處理 最常用的固定液為最常用的固定液為FAA。固定時間不受限制，短則。固定時間不受限制，短則 數小時，長可延至數月或數年。數小時，長可延至數月或數年。 配方：配方： 50或或70酒精酒精 90毫升毫升 冰醋酸冰醋酸 5毫升毫升 福爾馬林福爾馬林 5毫升毫升 柔軟材料用柔軟材料用50酒精，堅硬材料用酒精，堅硬材料用70酒精配制。酒精配制。 卡諾

3、氏卡諾氏(Carnoys)固定液：有極強的滲透力固定液：有極強的滲透力 固定根尖和花藥只需固定根尖和花藥只需40-60分鐘，時間太長不好分鐘，時間太長不好(不不能超一天能超一天)。 固定后用固定后用95酒精沖洗，在組織不能立即處理時，酒精沖洗，在組織不能立即處理時，需轉入需轉入70酒精中保存。配法有兩種：酒精中保存。配法有兩種： 固定組織時應注意：固定組織時應注意：保持組織新鮮，勿使其干燥，盡快固定處理。保持組織新鮮，勿使其干燥，盡快固定處理。組織塊不易過大過厚，厚度必須控制在組織塊不易過大過厚，厚度必須控制在0.3cm以內。以內。固定液必須有足夠的量，一般大于組織固定液必須有足夠的量，一般大

4、于組織20倍以上。倍以上。抽氣：使固定液盡快滲入材料內部，并排除材料內抽氣：使固定液盡快滲入材料內部，并排除材料內氣泡的干擾。氣泡的干擾。組織固定后的處理組織固定后的處理沖洗或漂洗：組織固定后應充分水洗，除去留在組沖洗或漂洗：組織固定后應充分水洗，除去留在組織內的固定液及其結晶沉淀，否則會影響以后的染織內的固定液及其結晶沉淀，否則會影響以后的染色效果。色效果。材料經過固定后，需要保存下來以備利用，通常使材料經過固定后，需要保存下來以備利用，通常使用的保存劑是用的保存劑是70%70%的酒精溶液，可以使一般的材料的酒精溶液，可以使一般的材料保存較長的時間而不至于變壞。保存較長的時間而不至于變壞。（

5、FAAFAA或卡諾固定或卡諾固定液固定不需要沖洗）液固定不需要沖洗）通常在冰箱中通常在冰箱中4 4存放。存放。3. 3. 脫水脫水 水和透明劑不能互溶，只有脫去水分后，才能讓透水和透明劑不能互溶，只有脫去水分后，才能讓透明劑進入。明劑進入。 凡用酒精配制的固定液，一律用同濃度的酒清洗。凡用酒精配制的固定液，一律用同濃度的酒清洗。 酒精為常用脫水劑，它既能與水相混合，又能與透酒精為常用脫水劑，它既能與水相混合，又能與透明劑相混。為了避免組織材料的急劇收縮，應按從明劑相混。為了避免組織材料的急劇收縮，應按從低濃度到高濃度遞增的順序進行低濃度到高濃度遞增的順序進行. 30%-50%-70%-85%-

6、95%-100%- 100% 每步每步30-60分鐘左右。分鐘左右。要求及注意事項要求及注意事項 保證脫水梯度和每一步脫水時間，水要完全脫凈。保證脫水梯度和每一步脫水時間，水要完全脫凈。 不同大小的組織塊脫水時間不同。不同大小的組織塊脫水時間不同。 不能過度脫水（過久使組織變脆、收縮）不能過度脫水（過久使組織變脆、收縮） 材料可以放在材料可以放在7070酒精中保存。酒精中保存。 正丁醇、叔丁醇、丙酮及二氧陸環等也可做脫水劑。正丁醇、叔丁醇、丙酮及二氧陸環等也可做脫水劑。4.4.透明透明 純酒精不能與石蠟相溶，還需用能與酒精和石蠟純酒精不能與石蠟相溶，還需用能與酒精和石蠟相溶的媒浸液，替換出組織

7、內的酒精。材料塊在相溶的媒浸液，替換出組織內的酒精。材料塊在這類媒浸液中浸漬，出現透明狀態，此液即稱透這類媒浸液中浸漬，出現透明狀態，此液即稱透明劑，透明劑浸漬過程稱透明明劑，透明劑浸漬過程稱透明. .常用的透明劑有二常用的透明劑有二甲苯、苯、氯仿、正丁醇等，各種透明劑均是石甲苯、苯、氯仿、正丁醇等，各種透明劑均是石蠟的溶劑。蠟的溶劑。 通常組織先經純酒精和透明劑各半的混合液浸漬通常組織先經純酒精和透明劑各半的混合液浸漬12小時，再轉入純透明劑中浸漬。小時，再轉入純透明劑中浸漬。 材料進入無水的透明劑中后，若透明劑變渾濁，說材料進入無水的透明劑中后，若透明劑變渾濁，說明材料中的水分未脫干凈，必

8、須回到前面一級無水明材料中的水分未脫干凈，必須回到前面一級無水的脫水劑中再次脫水（但是效果往往不好）。的脫水劑中再次脫水（但是效果往往不好）。 透明劑的浸漬時間則要根據組織材料塊大小及組織透明劑的浸漬時間則要根據組織材料塊大小及組織特性而定。特性而定。5.5.浸蠟與包埋浸蠟與包埋 用石蠟取代透明劑，使石蠟浸入組織而起支持作用。用石蠟取代透明劑，使石蠟浸入組織而起支持作用。 通常先把組織材料塊放在熔化的石蠟和二甲苯的等通常先把組織材料塊放在熔化的石蠟和二甲苯的等量混合液浸漬量混合液浸漬1 12 2小時或者過夜，再先后移入熔化小時或者過夜，再先后移入熔化的石蠟液中浸漬幾天。的石蠟液中浸漬幾天。 浸

9、蠟應在高于石蠟熔點浸蠟應在高于石蠟熔點33左右的溫箱中進行，以左右的溫箱中進行，以利石蠟浸入組織內。利石蠟浸入組織內。 石蠟熔點：石蠟熔點： 45-50 45-50 軟蠟軟蠟 55-60 55-60 硬蠟硬蠟材料較硬的，用熔點較高的石蠟包埋；材料較硬的，用熔點較高的石蠟包埋；切片較薄時（在切片較薄時（在8 8微米以下），用熔點較高的石蠟微米以下），用熔點較高的石蠟包埋；包埋；夏季采用熔點較高的石蠟（夏季采用熔點較高的石蠟（56,5856,58）, ,冬季宜選用冬季宜選用熔點較低的石蠟（熔點較低的石蠟（52,5452,54）。）。 石蠟的處理：石蠟的處理：新蠟應溶一次，增加密度。新蠟應溶一次，增

10、加密度。并用濾紙過濾去除雜質。并用濾紙過濾去除雜質。加加5%5%10%10%的蜂蠟的蜂蠟( (工蜂腹部下面四對蠟腺分泌物工蜂腹部下面四對蠟腺分泌物質質 ),),增加石蠟的韌性。增加石蠟的韌性。反復溶的舊蠟包埋效果更好。反復溶的舊蠟包埋效果更好。 程序：在溶蠟箱中進行，程序：在溶蠟箱中進行，55-60，恒溫。，恒溫。 浸蠟：二甲苯透明后的組織塊在二甲苯浸蠟：二甲苯透明后的組織塊在二甲苯石蠟（石蠟（1 1）中）中1次，在石蠟中次，在石蠟中2次，每次次，每次1-3天左右。天左右。 包埋：在室溫進行包埋：在室溫進行6. 切片切片 包埋好的蠟塊用刀片修包埋好的蠟塊用刀片修成規整的梯形，粘于小成規整的梯形

11、，粘于小木塊上。木塊上。 切片刀的銳利與否、蠟塊硬度適當都直接影響切切片刀的銳利與否、蠟塊硬度適當都直接影響切片質量，可用熱水或冷水等方法適當改變蠟塊硬片質量，可用熱水或冷水等方法適當改變蠟塊硬度。度。 通常切片厚度為通常切片厚度為812微米，切出一片接一片的蠟微米，切出一片接一片的蠟帶，用毛筆輕托輕放在紙上。帶，用毛筆輕托輕放在紙上。7. 粘片與烤片粘片與烤片 用粘附劑將展平的蠟片牢附于載玻片上，以免在用粘附劑將展平的蠟片牢附于載玻片上，以免在以后操作中材料脫落。以后操作中材料脫落。 在載玻片上涂抹粘片劑，再滴蒸餾水，放上蠟片，在載玻片上涂抹粘片劑，再滴蒸餾水，放上蠟片，至于展片臺上鋪展，最

12、后用濾紙吸除多余水分，至于展片臺上鋪展，最后用濾紙吸除多余水分，將載玻片放入將載玻片放入42溫箱中干燥。溫箱中干燥。常用的粘片劑為郝伯特常用的粘片劑為郝伯特(Haupt) 粘貼劑：粘貼劑：甲液：明膠甲液：明膠 1克克 蒸餾水蒸餾水 100毫升毫升 甘油甘油 15毫升毫升 苯酚苯酚 2克克乙液：甲醛乙液：甲醛 4毫升毫升 蒸餾水蒸餾水 100毫升毫升8. 脫蠟及復水脫蠟及復水干燥后的切片需脫蠟及復水才能在水溶性染液行染干燥后的切片需脫蠟及復水才能在水溶性染液行染色。用二甲苯脫蠟，再逐級經梯度酒精復水。色。用二甲苯脫蠟，再逐級經梯度酒精復水。 脫蠟（溶蠟）：將切片上的石蠟溶去。一般都用二脫蠟（溶蠟

13、）：將切片上的石蠟溶去。一般都用二甲苯溶脫蠟。如果脫蠟不徹底，材料的染色就困難。甲苯溶脫蠟。如果脫蠟不徹底，材料的染色就困難。 復水：脫蠟后的材料從高濃度的酒精溶液（復水：脫蠟后的材料從高濃度的酒精溶液（100%）開始，逐級進入低濃度的酒精溶液，最后一級通常開始，逐級進入低濃度的酒精溶液，最后一級通常是是30%酒精或水，使材料中的水分逐漸增加。如果酒精或水，使材料中的水分逐漸增加。如果不經過復水，材料脫蠟后直接進入染色劑中，材料不經過復水，材料脫蠟后直接進入染色劑中，材料將會嚴重變形，甚至難以染色。將會嚴重變形，甚至難以染色。 順序：順序：二甲苯二甲苯1/2 二甲苯二甲苯+1/2純酒精純酒精1

14、00%酒精酒精95酒精酒精85酒精酒精70酒精酒精50酒精酒精30酒精酒精水水染色染色 以上各級約需以上各級約需510分鐘。分鐘。9. 染色染色 染色的目的是使細胞組織內的不同結構呈現不同的染色的目的是使細胞組織內的不同結構呈現不同的顏色和足夠強的差異以便于觀察。顏色和足夠強的差異以便于觀察。 經染色可顯示細胞內不同的細胞器及內含物以及不經染色可顯示細胞內不同的細胞器及內含物以及不同類型的細胞組織。同類型的細胞組織。 根據觀察要求及研究內容采用不同的染色劑及染法。根據觀察要求及研究內容采用不同的染色劑及染法。 番紅與固綠染色法番紅與固綠染色法 番紅用番紅用l的水溶液，固綠用的水溶液，固綠用0.5的酒精液的酒精液(用用95的酒精配制的酒精配制) 染色步驟如下：染色步驟如下： 10. 切片脫水、透明和封固切片脫水、透明和封固 染色后的切片經梯度酒精脫水，二甲苯透明后，染色后的切片經梯度酒精脫水，二甲苯透明后，滴加適量（滴加適量（12滴）中性樹膠，再將潔凈蓋玻片滴）中性樹膠，再將潔凈蓋玻片傾斜放下，進行封片。傾斜放下，進行封片