1、Sample & Assay Technologies- 1 -The Rotor-Gene Q應用培訓Sample & Assay Technologies- 2 -n5 種型號，滿足不同的需要oRotor-Gene Q 2Plex oRotor-Gene Q 2Plex HRM oRotor-Gene Q 5Plex oRotor-Gene Q 5Plex HRM oRotor-Gene Q 6Plex產品概況產品概況工作過程Sample & Assay Technologies- 3 -旋轉模式旋轉模式 儀器運行時轉盤速度 400 RPM (加熱和冷卻) 高速數據收集 樣品旋轉一次，數據

2、收集一次 (0.15 sec) 重力作用讓試劑都在管底 除去氣泡和濃縮 組分不會形成沉淀持續運動保證無差異 孔與孔間的溫度和光學400 RPM10 GSample & Assay Technologies- 4 -離心式鼓風機混勻腔體內的空氣腔體門關上，密封腔體內的空氣轉盤上的孔能讓空氣自由通過升溫升溫加熱開Sample & Assay Technologies- 5 -空氣進離心式鼓風機把空氣吸入腔體內腔體門打開，排出熱空氣加熱關轉盤上的孔能讓空氣自由通過降溫降溫離心式鼓風機混勻腔體內的空氣Sample & Assay Technologies- 6 -光學通路光學通路Sample & As

3、say Technologies- 7 -光學通路光學通路激發光發射光Sample & Assay Technologies- 8 -PCR 轉子和轉子和PCR管類型管類型 136 孔轉子孔轉子- 適用 0.2 ml 平蓋 PCR 管-推薦反應體積20 50 L 72 孔轉子孔轉子- 適用 0.1 ml PCR連管-推薦反應體積10 50 L -#981005；#981008-#981103；#981106Sample & Assay Technologies- 9 -轉盤轉盤 72- 72 個樣品-Rotor-Disc 72，管容積50 L -推薦反應體積20 25 L -需要密封膜和加熱器

4、轉盤轉盤 100- 100個樣品-Rotor-Disc 100，管容積30 L-推薦反應體積15 25 L -需要密封膜和加熱器加熱器，#9019725Rotor-Disc 72，# 981301Rotor-Disc 100，# 981311密封膜，#981601PCR 轉子和轉子和PCR管類型管類型 2Sample & Assay Technologies- 10 -加熱器加熱器用來密封 Rotor-Disc密封后不能取下工作流程預熱取下膜中間的封紙把膜放在 Rotor-Disc正上方放進入加熱器中，拉下壓桿等警報音響，從加熱器中取出注意 至少放置10秒冷卻把膜多余的部分撕走小心地從加熱板上

5、取下Rotor-DisckSample & Assay Technologies- 11 -開始開始點擊此圖標運行設置運行設置Sample & Assay Technologies- 12 -運行設置運行設置 - Quick Start 模式模式選擇模板Sample & Assay Technologies- 13 -運行設置運行設置 - Quick Start 模式模式選擇轉子Sample & Assay Technologies- 14 -運行設置運行設置 - Quick Start 模式模式確定步驟之HoldSample & Assay Technologies- 15 -運行設置運行設

6、置 - Quick Start 模式模式確定步驟之CyclingSample & Assay Technologies- 16 -運行設置運行設置 - Quick Start 模式模式確定步驟之Cycling關于 AcquiringSample & Assay Technologies- 17 -運行設置運行設置 - Quick Start 模式模式確定步驟之Cycling關于 AcquiringSample & Assay Technologies- 18 -運行設置運行設置 - Quick Start 模式模式確定步驟之Melt選做Sample & Assay Technologies-

7、19 -運行設置運行設置 - Advanced 模式模式選擇模板Sample & Assay Technologies- 20 -運行設置運行設置 - Advanced 模式模式選擇轉子Sample & Assay Technologies- 21 -運行設置運行設置 - Advanced 模式模式輸入信息Sample & Assay Technologies- 22 -運行設置運行設置 - Advanced 模式模式步驟和檢測設置Sample & Assay Technologies- 23 -運行設置運行設置 - Advanced 模式模式步驟和檢測設置之確定步驟與Quick Start模

8、式的確定步驟同Sample & Assay Technologies- 24 -運行設置運行設置 - Advanced 模式模式步驟和檢測設置之Gain OptimisationSample & Assay Technologies- 25 -運行設置運行設置 - Advanced 模式模式步驟和檢測設置之Gain OptimisationSample & Assay Technologies- 26 -運行設置運行設置 - Advanced 模式模式Channel 設置需要的數據收集通道，如果設置了多個通道，確定后有后續的相應通道的對話框彈出。Tube Position 保證所選的位置是能夠

9、反應并發熒光的(一般是標準品)。Target Sample Range 與所用的檢測化合物有關：嵌入式染料嵌入式染料(Intercalating dyes )應設置為1-3Fl單位；探針染料探針染料(Probes)一般一般應設置為 5-10Fl 單位；Quenched FRET 檢測 應設置為70-80 Fl 單位，因為隨著反應進行其熒光值將降低 。Acceptable Gain Range 應為默認的 -10 to +10步驟和檢測設置之Gain OptimisationSample & Assay Technologies- 27 -運行設置運行設置 - Advanced 模式模式步驟和檢

10、測設置之Gain OptimisationSample & Assay Technologies- 28 -運行設置運行設置 - Advanced 模式模式設置完成Sample & Assay Technologies- 29 -關于Long range:在到達設置的循環數后，每一循環該步驟（一般設置變性階段）都增加增加1秒秒。關于Touchdown: 在到達設置的循環數后，每一循環的該步驟（一般設置退火階段）都降低降低1。Melt: 從一個較低溫度升到一個較高溫度，溶劑的特性，與核酸的特有屬性。HRM:High Resolution Melt，高分辨率的熔解曲線，只有在裝了HRM硬件的儀器上

11、才能運用。運行設置運行設置 - 額外設置額外設置 1Sample & Assay Technologies- 30 -關于Optical Denaturation Cycling: 用熒光強度來判斷變性是否完成運行設置運行設置 - 額外設置額外設置 2Sample & Assay Technologies- 31 -運行設置補充說明運行設置補充說明- Data Acquisition設置運行程序時要設置數據采集點數據采集點可以在任何的一個步驟的終結時，并以藍色的點作標記。可以通過點擊“Acquiring”作數據收集的設置。從列表中選擇需要的數據收集通道，可以選擇多通道。點擊“Dye Chart

12、”可觀測數據收集通道的信息，包括激發光和發射光波長，可以應用的染料或顯色劑。在程序的任何或所有步驟都能設數據收集點。Sample & Assay Technologies- 32 -當數據曲線飽和，會在縱坐標100處形成橫線。 設置和調整設置和調整Gain 值值 1設置Gain值，讓所有收集到的數據都在檢測器(PMT)能檢測的范圍內 如果Gain值：- 過低 信號會因埋沒在在本底噪聲內而漏掉； - 過高 信號會超出范圍 (飽和). 如果熔解曲線中，開始的一段時間縱坐標100處形成橫線，熔解曲線應用較低的Gain設置來收集數據，但無需再重復做擴增反應。Sample & Assay Technol

13、ogies- 33 -實際數據的不會因Gain值設置而改變，Gain值設置改變了也能反映實際的數據變化趨勢。每個數據采集通道的Gain值范圍是 -10 10：-10為最低的敏感度；+10 最高敏感度。 0481026-2-4-6-8-1024816326412825651210242048Gain值設置每增加1，對PMT的輸入電壓約能增加2倍，這樣對熒光檢測的敏感度能增加2倍。Gain值的設置不可能每次都適用，最好能在hold階段根據實驗的奔底而做出改變。使用 Auto-Gain設置能自動檢測反應初始時的熒光強度，設定出合適的Gain值。當使用Auto-Gain 設置時，在運行初始會出現該界面

14、。設置和調整設置和調整Gain 值值 2Sample & Assay Technologies- 34 -編輯樣品編輯樣品1. 命名樣品2. 選擇樣品的 “Type”： Unknown None NTC Standard Positive control Negative control Calibrator4. Groups 用作統計分析5. Given Conc. 只有type是”Standard”時可編輯，用于制作標準曲線。3.是否選擇 Selected6. Color用于顏色區分圖表中不同的樣品。Sample & Assay Technologies- 35 -綜述: Absolute

15、 Quantification of mRNA using real time reverse transcription polymerase chain reaction assaysSA BustinJ. Mol. Endo 2000 25,169-193標準曲線通過已知濃度的cDNA/RNA建立 關鍵因素:- DNA/RNA 片段要純，單一片段- 移液準確- 標準樣品稀釋準確，平行性好絕對定量Sample & Assay Technologies- 36 -絕對定量標準曲線由5個或以上已知濃度樣品而確定。一般每個濃度的樣品做3個重復。如果每個梯度相差10倍，最理想的狀態是， PCR的效

16、率足夠高到達2，預期Ct值能相差3.162。3.162是10的平方根 。未知濃度的目標樣品，其濃度和熒光值的變化規律與標準曲線一致。Sample & Assay Technologies- 37 -5,00050,000500,0005,000,00050,000,000500,000,000CTamount1. 曲線上的Ct與濃度的log關系2. 標準曲線 3.根據標準曲線計算反應效率反應效率與斜率(m)相關E= 10(-1/m) 1E=1=100%.4.判定系數 (R2)表示假設值與真實值的相關性， 越接近1相關性越好。絕對定量與反應效率Sample & Assay Technologie

17、s- 38 -絕對定量Sample & Assay Technologies- 39 -絕對定量Absolute QuantitationSample & Assay Technologies- 40 -絕對定量Sample & Assay Technologies- 41 -絕對定量的準確性完全決定于標準樣品的準確性絕對定量Sample & Assay Technologies- 42 -參考文獻: Absolute Quantification of mRNA using real time reverse transcription polymerase chain reaction a

18、ssaysSA BustinJ. Mol. Endo 2000 25,169-193標準曲線由已知濃度的cDNA/RNA構建關鍵因素:- DNA/RNA 一定是純的，只有一種片段的- 移液準確- 稀釋準確平行性好- 未知濃度的樣品的點能落在標準曲線上絕對定量Sample & Assay Technologies- 43 -相對定量Analysis Quantitation Cycling A Green Show OK Threshold 手動調閾值，得出 Ct值Sample & Assay Technologies- 44 -熔解的特性是不同核酸的固有特性一般是用嵌入式染料分析PCR產物，加

19、熱熔解從雙鏈到單鏈不同的片段（如堿基序列不同，GC含量不同）有不同的熔解特性HRM十分敏感 ，能夠區分一個堿基改變而引起的差別 (e.g. SNPs)HRM 比較熔解曲線的型狀和溫度來區分不同樣品的特性HRM原理雙鏈產物雙鏈產物單鏈產物單鏈產物Sample & Assay Technologies- 45 -HRM 試劑嵌入式染料的熒光隨著雙鏈的解開而降低，其熒光強度與解鏈的特性相關高精度的溫度控制和 光學數據收集，能得到十分詳細和分辨率高的數據。Sample & Assay Technologies- 46 -HRM工作流程工作流程擴增設置正常的PCR步驟和HRM步驟，用嵌入式染料 (e.g SYTO 9)每個基因型都應設置Control(eg.已確定的wild-type, heterozygote, variant樣品) 檢測擴增曲線和擴增效率(擴增不好，HRM的結果也不好)HRM 分析運行HRM 分析指定controls1. 觀測結