1、文獻檢索與利用綜述作業生物技術1201 于鳳川1020512129檢索課題名稱：代謝工程改造釀酒酵母合成青蒿素1、 檢索目的：青蒿素（artemisine）是從中藥黃花蒿中提取的有過氧基團的倍半萜內酯抗瘧新藥。被WTO批準為世界范圍內治療腦型瘧疾和惡性瘧疾的首選藥物。但目前青蒿素的生物合成途徑仍未清晰。2、 文獻檢索范圍及檢索策略序號所檢索數據庫名稱檢索的數據庫收錄時間檢索結果（篇）1中國期刊全文數據庫（CNKI）1994-現在122中文科技期刊數據庫（重慶維普）1989-現在123中國學位論文全文數據庫（萬方）1977-現在154Calis外文期刊網CCC-3檢索詞：中文：1、酵母 2、青蒿

2、素 3、代謝 4、生物合成 5、基因工程 6、中間體英文：1、Yeast 2、artemisinin 3、metabolism 4、biosynthesis 5、geneticengineering 6、midbody檢索式：中文：酵母*青蒿素*（生物合成+代謝） （基因工程菌+酵母）*青蒿素*中間體英文：（Yeast or geneticengineering ) and artemisinin 三、檢索結果1、篇名：酵母中青蒿素作用靶點的探索作者：黃倩; 周兵;文獻來源：清華大學學報(自然科學版), Journal of Tsinghua University(Science and Te

3、chnology), 編輯部郵箱 2008年 03期摘要：為了驗證前人提出的青蒿素在瘧原蟲中靶點蛋白的可信性并尋找其直接作用的靶點,用酵母作為模式生物,對候選靶點在酵母中的同源蛋白進行基因改造,研究其對青蒿素抑制作用的影響,并利用與瓊脂糖偶聯的二氫青蒿素(DHA)尋找與之特異性緊密結合的酵母蛋白。研究發現酵母中的同源蛋白似乎沒有在青蒿素抑制中起關健作用;并且未找到能與DHA特異性緊密結合的酵母蛋白。結果表明:過去提出的青蒿素作用靶點可能不正確,并暗示青蒿素可能沒有特異專一的蛋白靶點或同時作用于多個靶點。2、篇名：青蒿素生物合成研究進展作者：靜一; 羅安才;文獻來源：安徽農業科學, Journa

4、l of Anhui Agricultural Sciences, 編輯部郵箱 2010年 04期摘要：綜述了青蒿素生物合成途徑及其關鍵酶3-羥基-3-甲基戊二酰CoA還原酶、法呢基焦磷酸合酶、紫穗槐-4,11-二烯合酶、紫穗槐-4,11-二烯P450單加氧酶。3、篇名：酵母代謝工程菌生產青蒿素中間體的研究作者：孔建強、王麗娜、朱平、程克棣、王偉文獻來源：2008全國藥用真菌學術研討會論文集摘要：青蒿素是重要的抗瘧藥物,紫穗槐-4,11-二烯是其中間體。本論文構建了兩種能生產紫穗槐-4,11-二烯的釀酒酵母工程菌:整合體型和質粒型.以朱欒倍半萜為標準品,對這兩種釀酒酵母的代謝產物進行GC-MS

5、檢測,發現都能產生紫穗槐-4,11-二烯,而且整合體型酵母工程菌紫穗槐-4,11-二烯的產量要高于質粒型,達到117 mgL-1朱欒倍半萜當量。4、篇名：基因工程酵母全合成青蒿素的策略作者：曾麗香、 馮麗玲 、ZENG Li-xiang 、FENG Li-ling 文獻來源：中外醫學研究 201008(14)摘要：目的 構建青蒿細胞色素P450單加氧酶(CYP71AV1)和青蒿醛11(13)雙鍵還原酶(DBR2)基因酵母表達載體,為在微生物體內重建青蒿素合成途徑打下基礎.方法 采用PCR擴增、片段連接表達載體、轉化大腸桿菌、雙酶切和序列分析鑒定重組子,并將CYP71AV1-DBR2雙基因表達載

6、體導入酵母菌中.結果 分別獲得1488 bp的CYP71AV1基因和1246 bp的DBR2基因,構建了重組子pESC-CYP-DBR2,測序結果與GenBank上已登錄的相應基因序列吻合,將其導入酵母菌后,已檢測到它們的表達.結論 成功構建了青蒿素前體合成基因的酵母表達載體,為下一步培育青蒿素全合成酵母工程菌打下了基礎。5、篇名：紫穗槐-4,11-二烯合酶及其代謝工程研究進展作者：孔建強; 黃勇; 沈君豪; 王偉; 程克棣; 朱平;文獻來源：藥學學報, Acta Pharmaceutica Sinica, 編輯部郵箱 2009年 12期摘要：紫穗槐-4,11-二烯合酶催化FPP(farnes

7、yl pyrophosphate,法尼基焦磷酸)生成青蒿素前體紫穗槐-4,11-二烯,是青蒿素生物合成途徑中的關鍵酶。本文對紫穗槐-4,11-二烯合酶的分子生物學和代謝工程研究進行了綜述。紫穗槐-4,11-二烯合酶編碼基因及其相關核酸序列已經得到了克隆。紫穗槐-4,11-二烯合酶cDNA全長1641bp,編碼546aa。紫穗槐-4,11-二烯合酶最適pH范圍較寬,但需要二價金屬離子作為輔酶才能發揮作用,其產物和底物的特異性不高。在紫穗槐-4,11-二烯合酶作用下,FPP首先進行的是1,6-合環,然后是1,10-合環,形成紫穗槐-4,11-二烯。由于紫穗槐-4,11-二烯合酶在青蒿素生物合成中具

8、有重要的意義,自從其基因被克隆測序后,先后被導入E.coli、S.cereviseae、煙草、擬南芥和A.nidulans,獲得了能產生紫穗槐-4,11-二烯的各種工程菌或細胞,研究通過不同方式提高工程菌中紫穗槐-4,11-二烯產量的方法。6、篇名：酵母工程菌制備紫穗槐-4,11-二烯的研究作者：孔建強; 沈君豪; 黃勇; 王偉; 程克棣; 朱平;文獻來源：藥學學報, Acta Pharmaceutica Sinica, 編輯部郵箱 2009年 11期摘要：構建了兩種能產生紫穗槐-4,11-二烯的釀酒酵母工程菌,其中附加體型工程菌W303-1BpYeDP60/G/ADS含有表達載體pYeDP6

9、0/G/ADS。整合體型工程菌W303-1BrDNA:ADS是將ADS基因的表達盒序列通過同源重組的方式整合到釀酒酵母W303-1B基因組中。GC-MS檢測發酵產物,結果表明這兩種工程菌均能產生紫穗槐-4,11-二烯,但附加體型工程菌產生的紫穗槐-4,11-二烯的產量要高于整合體型工程菌的產量。Southern雜交檢測表明,ADS基因以單拷貝的形式整合到W303-1B基因組中,低于附加體型工程酵母中的ADS基因拷貝數。這些結果表明,ADS基因的拷貝數與酵母工程菌中紫穗槐-4,11-二烯的產量呈正相關。7、篇名：Production of the antimalarial drug precur

10、sor artemisinic acid in engineeredyeast(酵母工程菌生產抗瘧藥物青蒿素的前體青蒿酸)作者：Ro, DK; Paradise, EM; Ouellet, M;文獻來源：Nature440, 940-943 (13 April 2006)摘要：Malaria is a global health problem that threatens 300500 million people and kills more than one million people annually1. Disease control is hampered by the occu

11、rrence of multi-drug-resistant strains of the malaria parasitePlasmodium falciparum2,3. Synthetic antimalarial drugs and malarial vaccines are currently being developed, but their efficacy against malaria awaits rigorous clinical testing4,5. Artemisinin, a sesquiterpene lactone endoperoxide extracte

12、d fromArtemisia annuaL (family Asteraceae; commonly known as sweet wormwood), is highly effective against multi-drug-resistantPlasmodiumspp., but is in short supply and unaffordable to most malaria sufferers6. Although total synthesis of artemisinin is difficult and costly7, the semi-synthesis of ar

13、temisinin or any derivative from microbially sourced artemisinic acid, its immediate precursor, could be a cost-effective, environmentally friendly, high-quality and reliable source of artemisinin8,9. Here we report the engineering ofSaccharomyces cerevisiaeto produce high titres (up to 100mgl-1) of

14、 artemisinic acid using an engineered mevalonate pathway, amorphadiene synthase, and a novel cytochrome P450 monooxygenase (CYP71AV1) fromA. annuathat performs a three-step oxidation of amorpha-4,11-diene to artemisinic acid. The synthesized artemisinic acid is transported out and retained on the ou

15、tside of the engineered yeast, meaning that a simple and inexpensive purification process can be used to obtain the desired product. Although the engineered yeast is already capable of producing artemisinic acid at a significantly higher specific productivity thanA. annua, yield optimization and ind

16、ustrial scale-up will be required to raise artemisinic acid production to a level high enough to reduce artemisinin combination therapies to significantly below their current prices.瘧疾是一種全球性的健康問題，威脅到300500000000人，造成一百萬多人死亡疾病控制是由多重耐藥菌株的瘧疾寄生蟲惡性瘧原蟲引起的。目前正在開發的合成抗瘧藥和瘧疾疫苗，預防瘧疾的療效有待嚴格的臨床鑒定。從黃花蒿中青蒿素.L提取的倍半萜

17、內酯過氧化物（菊科；俗稱青蒿），是非常有效的抗多藥耐藥瘧原蟲藥物，但供不應求。雖然青蒿素的全合成很困難，但青蒿素的合成中間體現在確實已經實現的。我們在這里報告工程酵母菌使用一個精心設計的甲羥戊酸途徑，紫穗槐二烯合成酶青蒿酸，和一種新的細胞色素P450單加氧酶（cyp71av1）從青蒿 執行三氧化紫穗槐-4,11-二烯為青蒿酸。這意味著一個簡單的和廉價的凈化過程可以用來獲得所需的產品。雖然酵母工程已經能夠生產青蒿酸，但產量優化和產業規模將需要提高將青蒿酸生產到足夠高的水平，降低青蒿素聯合療法的成本價格。8、篇名：酵母工程菌制備抗瘧藥物青蒿素前體的研究作者：孔建強、王偉、朱平、程克棣 文獻來源：2

18、008年生物產業技術研討會論文集摘要：克隆了青蒿素生物合成途徑的酶基因:紫穗槐-4,11-二烯合酶基因和紫穗槐-4,11-二烯氧化酶基因,將這兩個基因以及酵母的HMG-CoA還原酶基因,FPP合酶基因導入釀酒酵母WHT,構建分別能合成紫穗槐-4,11-二烯和青蒿酸的酵母代謝工程菌.通過GC-MS,在紫穗槐-4,11-二烯酵母工程菌中檢測到了紫穗槐-4,11-二烯,產量達13.1688L-1朱欒倍半萜當量；通過傅立葉回旋共振質譜,在青蒿酸酵母工程菌中檢測到了青蒿酸。9、篇名：Yeast Model Uncovers Dual Roles of Mitochondria in the Action

19、 of Artemisinin（由酵母模型來揭示線粒體在青蒿素合成中的作用） 作者：Wei Li, Weike Mo, Dan Shen,Libo Sun, Juan Wang,Shan Lu, Jane M Gitschier, Bing Zhou文獻來源：PLOS GENETICS卷:1期摘要：Artemisinins, derived from the wormwood herbArtemisia annua,are the most potent antimalarial drugs currently available. Despite extensive research, th

20、e exact mode of action of artemisinins has not been established. Here we use yeast,Saccharamyces cerevisiae,to probe the core working mechanism of this class of antimalarial agents. We demonstrate that artemisinins inhibitory effect is mediated by disrupting the normal function of mitochondria throu

21、gh depolarizing their membrane potential. Moreover, in a genetic study, we identify the electron transport chain as an important player in artemisinins action: Deletion ofNDE1orNDI1,which encode mitochondrial NADH dehydrogenases, confers resistance to artemisinin, whereas overexpression ofNDE1orNDI1

22、dramatically increases sensitivity to artemisinin. Mutations or environmental conditions that affect electron transport also alter hosts sensitivity to artemisinin. Sensitivity is partially restored when thePlasmodium falciparum NDI1ortholog is expressed in yeastndi1strain. Finally, we showed that a

23、rtemisinins inhibitory effect is mediated by reactive oxygen species. Our results demonstrate that artemisinins effect is primarily mediated through disruption of membrane potential by its interaction with the electron transport chain, resulting in dysfunctional mitochondria. We propose a dual role

24、of mitochondria played during the action of artemisinin: the electron transport chain stimulates artemisinins effect, most likely by activating it, and the mitochondria are subsequently damaged by the locally generated free radicals.青蒿素，來自青蒿，是目前可用的最有效的抗瘧疾藥物。盡管進行了廣泛的研究，主要的作用的精確模式尚未建立。這里我們使用的酵母，釀酒酵母，探

25、討這類抗瘧藥物的核心工作機制。我們表明，青蒿素的抑制作用是通過破壞線粒體的正常功能，通過去極化膜電位介導。此外，在遺傳研究中，我們確定的電子傳遞鏈中青蒿素的作用的一種重要的球員： NDE1 orndi1 缺失，其編碼線粒體NADH脫氫酶，抵抗青蒿素，而過度的 NDE1 或 Ndi1 大大增加靈敏度的青蒿素。突變或影響電子傳輸也改變宿主的敏感性對青蒿素的環境條件。靈敏度是部分恢復時，Ndi1 惡性瘧原蟲基因在酵母中表達 Ndi1 應變。最后，我們表明，青蒿素的抑制作用介導的活性氧物種。我們的研究結果表明，青蒿素的作用主要是通過與電子傳遞鏈的相互作用介導的膜電位的中斷，導致線粒體功能失調。我們提出

26、了青蒿素的行動中發揮了雙重作用：刺激線粒體電子傳遞鏈青蒿素的作用，最有可能通過激活線粒體，并隨后被本地產生的自由基。4、 綜述1、 簡要介紹檢索到每篇文獻的主要內容文獻1青蒿素的靶點蛋白一直沒有定論，前人的研究提出了若干個可能的作用靶點，但并沒有得到遺傳學上的證據。在本研究中，利用酵母作為模式生物，通過遺傳學的方法來驗證已有的候選靶點對青蒿素敏感性的影響，并采用生物化學的方法尋找青蒿素的作用靶點。已有的候選靶點在酵母中都有同源物，然而，我們并沒有看到它們作為青蒿素靶點的跡象。當然，青蒿素可能是通過多個靶點共同作用，所以其中一個基因的突變或過表達并不能對青蒿素的敏感性產生明顯響。因此，本研究結果

27、說明酵母中7個被測試過的候選靶點不是青蒿素在酵母中主要的或唯一的作用靶點。文獻2主要介紹了青蒿素的來源及發現，以及青蒿素的各種合成方法，如化學合成法，生物合成法及其他方法。探討了青蒿素生物合成的各種途徑，還列舉了各種實驗現象及結果來證明不同的說法。文章最后表明了對生物合成青蒿素的強烈的信心及支持。文獻3介紹利用代謝工程，將來源于不同生物的基因組合到酵母中，在酵母中重新構建一條青蘺素中間體生物合成途徑在未來有望成為這樣的方法。本試驗通過努力，獲得了能生產紫穗槐-4，11-二烯的酵母工程菌。結果表明，整合型酵母工程菌的紫穗槐-4，11-二烯產量明顯高于質粒型酵母工程菌。其中，整合型酵母工程菌的紫穗

28、槐-4，11-二烯產量達到117 mgL1朱欒倍半萜當量。ADS基因被整合到了基因上，這是一個多拷貝位點，因此，隨著ADS基因拷貝數的增加，整合體型AD工程菌的產量也上升了，甚至于超過了質粒型酵母工程菌。實驗證明，提高基因的拷貝數能有效地增加紫穗槐一4，1 1-二烯代謝工程菌中目的產物的產量。文獻4，到目前為止，還沒有任何一種基因工程微生物能全合成青蒿素。實驗在大腸桿菌中成功表達紫穗槐二烯合酶基因并合成紫穗槐二烯的基礎上，擬從青蒿中克隆CPY71AVI和DBR2基因，并插入酵母菌表達載體，導入攜帶ADS基因的酵母工程菌中，以便將前期已合成的紫穗槐二烯轉變成青蒿醛以及將青蒿醛轉變成雙氫青蒿醛，為

29、下一步培育青蒿素全合成酵母工程菌打下基礎。文獻5介紹了紫穗槐-4, 11-二烯合酶及其編碼基因的發現歷史，紫穗槐-4, 11-二烯合酶編碼基因的特點，紫穗槐-4, 11-二烯合酶特點，紫穗槐-4,11-二烯合酶基因成功克隆的策略和紫穗槐-4,11-二烯合酶作用機制以及紫穗槐-4,11-二烯合酶基因的代謝工程研究文獻6介紹了一種多拷貝外源基因同源重組的方法。為獲得高產紫穗槐-4,11-二烯和青蒿酸的工業用酵母工程菌奠定了基礎。可以利用該工程菌更便利地進行條件優化。ADS 基因整合到酵母基因組, 使釀酒酵母獲得了生產紫穗槐-4,11-二烯的性質, 從而克服了外源質粒不穩定的性質。隨著外源基因在釀酒

30、酵母中拷貝數的提高, 基因同源序列之間的相互作用會導致外源基因“反式失活”。因此, 怎樣解決目的產物增量和外源基因沉默之間的矛盾將是構建高效青蒿酸前體酵母工程菌的關鍵之一。文獻7本實驗構建的紫穗槐一4，1卜二烯酵母工程菌中，導入了三個基因：HMG-CoA還原酶基因，FPP合酶基因和紫穗槐-4，1 1-：烯合酶基因。通過紫穗槐一4，11一二烯合酶的作用，能將麥角固醇代謝途徑中的FPP催化形成紫穗槐-4，11-烯。為了提高進入紫穗槐一4，11一二烯代謝流中的FPP的供應，將萜類合成途徑中的限速酶基因HMGCoA還原酶基因和FPP合酶基因導入了酵母，提高這兩個酶基因在酵母中的拷貝數，增加FPP的供應

31、，提高紫穗槐一4，1l一二烯的產量。在青蒿酸代謝工程菌中，除了導入這三個基因之外，還導入紫穗槐-4，Ii-烯氧化酶基因，該基因能連續催化紫穗槐一4，1l一二烯生成青蒿醇，青蒿醛和青蒿酸。文獻8介紹了在本實驗中，我們從酵母克隆出HMGCoA還原酶(3-hydroxy一3一methylglutarylcoenzymeAreductase，HMGR)和FPP合酶(farnesyl diphosphate synthase，FPPS)基因：從青蒿中克隆出了紫穗槐一4，11一二烯合酶基因及紫穗槐-4，11-烯氧化酶基因。將這四個青蒿酸合成所必要的酶基因導入酵母中通過在酵母中重構一條青蒿酸的合成途徑，利用

32、釀酒酵母自身合成萜類的前體FPP，通過代謝工程制備出了青蒿素前體紫穗槐一4，11一二烯和青蒿酸文獻9介紹實驗使用釀酒酵母，探討這類抗瘧藥物的核心工作機制。我們表明，青蒿素的抑制作用是通過破壞線粒體的正常功能，通過去極化膜電位介導。此外，在遺傳研究中，確定的電子傳遞鏈中青蒿素的作用的一種重要的球員： NDE1 orndi1 缺失，其編碼線粒體NADH脫氫酶，抵抗青蒿素，而過度的 NDE1 或 Ndi1 大大增加靈敏度的青蒿素。突變或影響電子傳輸也改變宿主的敏感性對青蒿素的環境條件。靈敏度是部分恢復時，Ndi1 惡性瘧原蟲基因在酵母中表達 Ndi1 應變。最后，實驗表明，青蒿素的抑制作用介導的活性

33、氧物種。我們的研究結果表明，青蒿素的作用主要是通過與電子傳遞鏈的相互作用介導的膜電位的中斷，導致線粒體功能失調。我們提出了青蒿素的行動中發揮了雙重作用：刺激線粒體電子傳遞鏈青蒿素的作用，最有可能通過激活線粒體，并隨后被本地產生的自由基。2、 綜合以上文獻，介紹該課題的意義、國內外研究現狀和研究發展趨勢。（1） 該課題研究的意義 青蒿素（artemisine）是從中藥黃花蒿中提取的有過氧基團的倍半萜內酯抗瘧新藥。青蒿素對多種疾病具有治療作用。藥理學研究表明青蒿素對瘧原蟲紅細胞內期有直接殺滅作用，對組織期無效，在機體內吸收快，分布廣，排泄快。主要用于間日瘧、惡性瘧的癥狀控制，以及耐氯喹蟲株的治療，

34、也可用以治療兇險型惡性瘧，如腦型、黃疸型等。亦可用以治療系統性紅斑狼瘡與盤狀紅斑狼瘡。 青蒿素生物合成屬于異戊二烯代謝途徑的倍半萜分支途徑，萜類家族化合是植物體內一大類天然產物，其商業價值很高，例如很多的香料、香氣以及一些抗癌都屬于此類。青蒿素就是屬于此類。由于目前化學合成青蒿素成本較高且污染浪費較大，所以一般是從植物中提取青蒿素?，F在，人們又把研究的目光轉向微生物發酵合成青霉素。（2） 目前國內外研究現狀中國抗瘧新藥的研究源于1967年成立的五二三項目，其全稱為中國瘧疾研究協作項目，成立于1967年的5月23日,因絕密軍事項目,遂設代號523。歷經380多次鼠瘧篩選，1971年10月取得中藥

35、青蒿素篩選的成功。1972年從中藥青蒿中分離得到抗瘧有效單體，命名為青蒿素，對鼠瘧、猴瘧的原蟲抑制率達到100%。1973年經臨床研究取得與實驗室一致的結果、抗瘧新藥青蒿素由此誕生。1981年10月在北京召開的由世界衛生組織主辦的“青蒿素”國際會議上，中國青蒿素的化學研究的發言，引起與會代表極大的興趣，并認為“這一新的發現更重要的意義是在于將為進一步設計合成新藥指出方向”。1986年，青蒿素獲得新一類新藥證書，雙氫青蒿素也獲一類新藥證書。這些成果分別獲得國家發明獎和全國十大科技成就獎。2011年9月，中國女藥學家屠呦呦因創制新型抗瘧藥青蒿素和雙氫青蒿素的貢獻，獲得被譽為諾貝爾獎“風向標”的拉斯

36、克獎。這是中國生物醫學界迄今為止獲得的世界級最高級大獎。 近年來，青蒿素生產發展迅速，通過微生物發酵生產青蒿素前體已接近工業化規模,但目前還不能實現青蒿素在微生物體內的全合成。國外擬采取“兩步法”策略半合成青蒿素: 第一步是在微生物中獲得青蒿素前體, 第二步是利用化學方法將青蒿素前體轉變成青蒿素。 一旦成功產業化 必將帶來青蒿素生產方式的徹底變革, 也是緩解日益嚴重的青蒿素短缺局面的根本出路。 國外利用酵母工程菌生物合成青蒿酸及化學半合成青蒿素的生產工藝已經基本成型，而我國尚未育成類似的青蒿酸生物合成工程菌，即使擁有青蒿酸化學半合成青蒿素技術，也暫時無法派上用場。另一方面，鑒于生物轉化效率高、成本低、污染少等優勢，可以嘗試用生物轉化法替代化學轉化法，即通過單線態氧發生酵母菌與雙氫青蒿酸提取液混合發酵的方法進行青蒿素的生物半合成，將提取青蒿素后剩余的雙氫青蒿酸轉化為青蒿素。然而，國內外目前還沒有建立雙氫青蒿酸合成青蒿素的生物轉化技術。（3） 該課題研究發展趨勢 目前國內外還沒有一個研究小組將酵母工程菌中的青蒿素前體轉變成青蒿素, 其原因可能是酵母不具備青蒿素合成所需要的細胞環境。酵母工程菌中未檢測到青蒿素的原因可能有兩個：一是釀酒酵母中單線態氧缺乏，雙氫青蒿酸合成后不能轉變成青蒿素；二是青蒿素未被油相環境隔離而與細胞成分（如血紅素）發生烷基化反應，無法檢測到青