1、課題課題2 2 多聚酶鏈式反應擴增多聚酶鏈式反應擴增DNADNA片段片段【課題背景課題背景】在刑事偵破案件中常需要對樣品在刑事偵破案件中常需要對樣品DNADNA進行分析，進行分析，PCRPCR技術能快速擴增技術能快速擴增DNADNA片段，在幾個小時內復制出上百萬份的片段，在幾個小時內復制出上百萬份的DNADNA拷貝，有效地解決了拷貝，有效地解決了因為樣品中因為樣品中DNADNA含量太低而難以對樣品進行分析研究的問題。現在含量太低而難以對樣品進行分析研究的問題。現在PCRPCR技術已廣泛應用于遺傳病的診斷、刑偵破案、古生物學、基因克技術已廣泛應用于遺傳病的診斷、刑偵破案、古生物學、基因克隆和基因

2、測序。隆和基因測序。【課題目標課題目標】1.1.理解理解PCRPCR的原理和反應過程的原理和反應過程2.2.嘗試嘗試PCRPCR技術的基本操作技術的基本操作3.3.討論討論PCRPCR技術的應用技術的應用PCRPCR儀儀 以“DNA復制”為背景材料，設計問題，導入新課，首先回顧DNA的結構和復制的有關知識，然后了解PCR技術的原理和應用，接著講解PCR技術的反應過程及具體實驗操作步驟，后以視頻觀看來再次學習實驗的知識點。最后通過課堂檢測完善所學內容。 通過對PCR反應過程的教學，應以讀圖識圖為主。教材中反應過程圖解詳細的描繪了參與PCR的各種組成成分；每一輪反應的三個基本步驟變性、復性、延伸；

3、每一步驟的作用。在教學中分析圖形的同時，結合教科書中的文字說明來加深理解。參與的組分參與的組分在在DNADNA復制中的作用復制中的作用解旋酶解旋酶DNADNA母鏈母鏈4 4種脫氧核苷酸種脫氧核苷酸DNADNA聚合酶聚合酶引物引物1.1.胞內胞內DNADNA復制的基本體系復制的基本體系一、基礎知識一、基礎知識打開打開DNADNA雙鏈雙鏈提供提供DNADNA復制的模板復制的模板合成子鏈的原料合成子鏈的原料催化合成催化合成DNADNA子鏈子鏈使使DNADNA聚合酶能夠從引物的聚合酶能夠從引物的33端開始連接脫氧核苷酸端開始連接脫氧核苷酸( (一）一）PCRPCR原理原理2.DNA2.DNA雙鏈方向與

4、復制關系雙鏈方向與復制關系（2 2）DNADNA聚合酶只能從聚合酶只能從3 3 端延伸端延伸DNADNA鏈，故鏈，故DNADNA復制需要引物。復制需要引物。（1 1）DNADNA的羥基的羥基“OH”OH”末端稱為末端稱為33端，而磷酸基團的末端稱為端，而磷酸基團的末端稱為55端。端。DNADNA合成總是從子鏈的合成總是從子鏈的5 5 端向端向3 3 端伸端伸3 3 端端5 5 端端3.PCR3.PCR原理原理（1 1）DNADNA的熱變性原理的熱變性原理通過控制溫度來控制雙鏈的解聚與結合通過控制溫度來控制雙鏈的解聚與結合變性：變性：8080100100C C的溫度范圍內，的溫度范圍內， DNA

5、DNA雙螺旋結構解體，雙鏈分開雙螺旋結構解體，雙鏈分開加熱變性加熱變性復性：復性：溫度緩慢降低后，兩條彼此分離的溫度緩慢降低后，兩條彼此分離的DNADNA鏈重新結合成雙鏈鏈重新結合成雙鏈緩慢冷卻復性緩慢冷卻復性（2 2）耐高溫的）耐高溫的Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶（3 3）緩沖液為）緩沖液為PCRPCR反應提供的物質反應提供的物質 DNADNA模板，分別與兩條模板鏈相結合的兩種引物，四種脫氧核苷酸，模板，分別與兩條模板鏈相結合的兩種引物，四種脫氧核苷酸，耐熱的耐熱的DNADNA聚合酶，同時通過控制溫度使聚合酶，同時通過控制溫度使DNADNA復制在體外反復進行復制在體外反復進行【方

6、法點撥方法點撥】細胞內復制和細胞內復制和PCRPCR不同點不同點 PCR PCR過程需要的引物不是過程需要的引物不是RNARNA，而是人工合成的，而是人工合成的DNADNA單鏈，其長度通單鏈，其長度通常為常為20203030個脫氧核苷酸個脫氧核苷酸 PCR PCR過程中過程中DNADNA的解旋不依靠解旋酶，而是通過對反應溫度的控制的解旋不依靠解旋酶，而是通過對反應溫度的控制來實現的來實現的（二）（二）PCRPCR的反應過程的反應過程PCRPCR一般要經歷三十多次循環，每次循環分為一般要經歷三十多次循環，每次循環分為變性、復性和延伸變性、復性和延伸三步三步(1)(1)變性變性溫度上升到溫度上升到

7、90 90 以上時，雙鏈以上時，雙鏈DNADNA解旋為單鏈。解旋為單鏈。(2)(2)復性復性溫度下降到溫度下降到50 50 左右，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單左右，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈鏈DNADNA結合。結合。溫度上升到溫度上升到72 72 左右，溶液中的四種脫氧核苷酸左右，溶液中的四種脫氧核苷酸(A(A、T T、C C、G)G)在在DNADNA聚合酶的作用下，根據堿基互補配對原則合成新的聚合酶的作用下，根據堿基互補配對原則合成新的DNADNA鏈。鏈。(3)(3)延伸延伸【方法點撥方法點撥】(1)72 (1)72 左右時，左右時，TaqDNATaqDNA聚合酶有最大活性，可使

8、聚合酶有最大活性，可使DNADNA新鏈由新鏈由55端端向向33端延伸。端延伸。(2)DNA(2)DNA聚合酶只能特異性地復制處于兩個引物之間的聚合酶只能特異性地復制處于兩個引物之間的DNADNA序列，使序列，使該段固定長度的序列呈該段固定長度的序列呈“指數式指數式”擴增。擴增。標準的標準的PCRPCR過程一般分為變性、復性、延伸三大步，這三大步需要過程一般分為變性、復性、延伸三大步，這三大步需要的溫度依次是的溫度依次是( () )A A92 92 、50 50 、72 72 B B72 72 、50 50 、92 92 C C50 50 、92 92 、72 D72 D80 80 、50 50

9、 、72 72 欄目鏈接【典型例題典型例題】A A【方法點撥方法點撥】1.1.變性：變性： 溫度上升到溫度上升到90 (9090 (9096 )96 )以上時，雙鏈以上時，雙鏈DNADNA解旋為單鏈解旋為單鏈2.2.復性：復性：溫度下降到溫度下降到50 (4050 (4060 )60 )左右時，兩種引物通過堿基左右時，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈互補配對與兩條單鏈DNADNA結合結合3.3.延伸：延伸：溶液中的四種脫氧核苷酸溶液中的四種脫氧核苷酸(A(A、T T、C C、G)G)在在Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶的作用下，根據堿基互補配對原則合成新的的作用下，根據堿基互補配對原

10、則合成新的DNADNA鏈鏈二、實驗操作二、實驗操作1.PCR1.PCR儀儀（一）設備及用具（一）設備及用具一臺能夠一臺能夠自動調控溫度自動調控溫度的儀器的儀器2.2.微量離心管微量離心管一種一種薄壁塑料管薄壁塑料管，總容，總容積為積為0.5ml0.5ml3.3.微量移液器微量移液器用于用于定量轉移定量轉移PCRPCR配方中的配方中的液液體，體，其上的一次性吸液槍頭用其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次一次更換一次1.1.準備準備2.2.移液移液（二）實驗操作步驟（二）實驗操作步驟按照按照PCRPCR反應體系的配方將所需用的試劑擺放在實驗桌上。反應體系的配方將所需用的試劑擺放在實驗桌上。用微量移液

11、器按照用微量移液器按照PCRPCR反應體系配方往微量離心管里面加反應體系配方往微量離心管里面加入各種試劑。入各種試劑。3.3.混合混合過程：過程：蓋嚴微量離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁。蓋嚴微量離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁。注意注意: :A.A.離心管口的蓋子一定蓋嚴，防止實驗中脫落或液體外溢。離心管口的蓋子一定蓋嚴，防止實驗中脫落或液體外溢。B.B.手指輕輕彈擊微量離心管的管壁，目的是使反應液混合均勻。手指輕輕彈擊微量離心管的管壁，目的是使反應液混合均勻。4.4.離心離心過程：過程：將微量離心管放在離心機上將微量離心管放在離心機上, ,離心約離心約10s10s。目的：目的：使反應液

12、體集中在離心管底部，提高反應效果。使反應液體集中在離心管底部，提高反應效果。循環數循環數變性變性復性復性延伸延伸第一次第一次9494C C，10min10min3030次次44，30s30s5555，30s30s7272，1min1min最后一次最后一次44，1min1min5555，30s30s7272，1min1min5.5.反應反應將離心管放入將離心管放入PCRPCR儀上，設置好儀上，設置好PCRPCR儀的循環程序。儀的循環程序。【注意事項注意事項】 避免外源避免外源DNADNA等因素的污染等因素的污染隔離操作區，所用微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使隔離操作區，所用微量離心管、槍

13、頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用必須進行高壓滅菌；用必須進行高壓滅菌；分裝試劑，簡化操作程序，使用一次性槍頭。分裝試劑，簡化操作程序，使用一次性槍頭。在在PCRPCR實驗操作中，下列說法不正確的是實驗操作中，下列說法不正確的是( () )A A在微量離心管中添加各種試劑時，只需一個槍頭在微量離心管中添加各種試劑時，只需一個槍頭B B離心管的蓋子一定要蓋嚴，防止液體外溢離心管的蓋子一定要蓋嚴，防止液體外溢C C用手輕彈離心管壁的目的是使反應液充分混合用手輕彈離心管壁的目的是使反應液充分混合D D離心的目的是使反應液集中在離心管部，提高反應效果離心的目的是使反應液集中在離心管部，提高反應效果變 式訓

14、練 欄目鏈接【典型例題典型例題】A A3.3.離心離心10s10s的目的是使反應液集中在離心管部，提高反應效果。的目的是使反應液集中在離心管部，提高反應效果。【方法點撥方法點撥】1.1.在微量離心管中添加各種試劑時，每吸取一種試劑后，移在微量離心管中添加各種試劑時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭必須更換，以確保實驗的準確性；液器上的槍頭必須更換，以確保實驗的準確性；2.2.離心管的蓋子一定要蓋嚴，防止實驗中脫落或液體外溢；離心管的蓋子一定要蓋嚴，防止實驗中脫落或液體外溢；（一）理論上（一）理論上DNADNA擴增數目的計算擴增數目的計算1.1.一條一條DNADNA，復制，復制n n次，次， D

15、NADNA為為2 2n n2.a2.a條條DNADNA，復制，復制n n次，次， DNADNA為為a a 2 2n n（二）實驗中（二）實驗中DNADNA含量的測定含量的測定1.1.原理原理可以通過計算可以通過計算DNADNA含量來評價擴增的效果，含量來評價擴增的效果，DNADNA在在260nm260nm的紫外線波的紫外線波段有一強烈的吸收峰，峰值的大小與段有一強烈的吸收峰，峰值的大小與DNADNA的含量有關的含量有關三、課題成果評價三、課題成果評價2.2.過程過程稀釋稀釋 2uLPCR2uLPCR反應液，加入反應液，加入98uL98uL蒸餾水，即將樣品進行蒸餾水，即將樣品進行5050倍稀釋倍

16、稀釋對照調零對照調零以蒸餾水作為空白對照，在波長以蒸餾水作為空白對照，在波長260nm260nm處，將紫外分光光度處，將紫外分光光度計的讀數調節至零計的讀數調節至零計算計算 取取DNADNA稀釋液稀釋液100uL100uL至比色杯中，測定至比色杯中，測定260nm260nm處的光吸收值處的光吸收值計算計算DNADNA含量（含量（ g g）50 x(260nm50 x(260nm的讀數）的讀數）x x 稀釋倍數稀釋倍數5050：1 1 g g /mL /mL的的DNADNA在厚度為在厚度為1cm1cm比色杯中的吸光值為比色杯中的吸光值為0.020.02紫外分光度計紫外分光度計比色杯比色杯四、四、

17、 課題延伸課題延伸PCRPCR技術是技術是8080年代中期發展起來的體外核酸擴增技術。年代中期發展起來的體外核酸擴增技術。 它具有特異、它具有特異、敏感、產率高、敏感、產率高、 快速、快速、 簡便、重復性好、易自動化等突出特點簡便、重復性好、易自動化等突出特點 例如：例如：PCRPCR產物每輪循環增加一倍，產物每輪循環增加一倍，3030輪循環擴增量達輪循環擴增量達2 23030個拷個拷貝（貝（10109 9拷貝）拷貝）【課堂小結課堂小結】一、一、PCRPCR原理原理1.1.變性：變性：溫度上升到溫度上升到90 (9090 (9096 )96 )以上時，雙鏈以上時，雙鏈DNADNA解旋為單鏈解旋

18、為單鏈2.2.復性：復性： 溫度下降到溫度下降到50 (4050 (4060 )60 )左右時，兩種引物通過堿基左右時，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈互補配對與兩條單鏈DNADNA結合結合3.3.延伸：延伸： 溶液中的四種脫氧核苷酸溶液中的四種脫氧核苷酸(A(A、T T、C C、G)G)在在Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶的作用下，根據堿基互補配對原則合成新的的作用下，根據堿基互補配對原則合成新的DNADNA鏈鏈二、二、PCRPCR操作操作1.1.準備準備2.2.移液移液3.3.混合混合4.4.離心離心5.5.反應反應PCRPCR過程與細胞內的過程與細胞內的DNADNA復制過程相比，主要有兩點不同，它們是（復制過程相比，主要有兩點不同，它們是（ ）PCRPCR過程需要的引物是人工合成的單鏈過程需要的引物是人工合成的單鏈DNADNA或或RNARNAPCRPCR過程不需要過程不需要DNADNA聚合酶聚合酶PCRPCR過程