1、第一節(jié)第一節(jié) 概述概述1、色譜法的概念、色譜法的概念概念概念 色譜法又稱(chēng)色層法、層析法，是用于多組分有機(jī)混合物的一種高效分離技術(shù)。特點(diǎn)特點(diǎn) 選擇性好、分離效能高、靈敏度高、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)。先進(jìn)性先進(jìn)性 已逐步實(shí)現(xiàn)儀器化、自動(dòng)化、高速化，并從分離手段發(fā)展到分析手段，應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大，分離的對(duì)象早已不限于有色物質(zhì)，但“色譜法”這一名稱(chēng)一直被沿用。范圍范圍 色譜法與現(xiàn)代新檢測(cè)技術(shù)和計(jì)算機(jī)技術(shù)相結(jié)合，已廣泛食品質(zhì)量與安全等的有關(guān)工作，如樣品中農(nóng)藥殘留量的測(cè)定、農(nóng)副產(chǎn)品分析、食品質(zhì)量檢驗(yàn)、生物制品的分離制備等。2、色譜法的起源、色譜法的起源1906年，俄國(guó)植物學(xué)家茨維特首創(chuàng)了這種分離技術(shù)，他把植物葉綠

2、體色素的石油醚浸漬液倒入一根裝有碳酸鈣吸附劑的細(xì)直玻璃柱中，再加入純石油醚，任其自由流下，原混合物開(kāi)始被分離成不同顏色的譜帶(色素的分離)，且以不同速度通過(guò)子，然后按譜帶顏色對(duì)混合物進(jìn)行鑒定分析。茨維特把這種分離結(jié)果稱(chēng)為色譜圖，把這種分離方法命名為色譜法（chromatography）。此后，出現(xiàn)了種類(lèi)繁多的各種色譜法。3、色譜法的本質(zhì)、色譜法的本質(zhì)色譜法共同的基本特點(diǎn)是具備兩個(gè)相：不動(dòng)的一相，稱(chēng)不動(dòng)的一相，稱(chēng)為固定相；另一相是攜帶樣品流過(guò)固定相的流動(dòng)體，稱(chēng)為固定相；另一相是攜帶樣品流過(guò)固定相的流動(dòng)體，稱(chēng)為流動(dòng)相為流動(dòng)相。 當(dāng)流動(dòng)相中樣品混合物經(jīng)過(guò)固定相時(shí)，就會(huì)與固定相發(fā)生作用，由于各組分在性

3、質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異，與固定相相互作用的類(lèi)型、強(qiáng)弱也有差異相互作用的類(lèi)型、強(qiáng)弱也有差異，因此在同一推動(dòng)力的作用下，不同組分在固定相滯留時(shí)間滯留時(shí)間長(zhǎng)短不同，從而按先后不同的次序從固定相中流出。 目前色譜法已廣泛應(yīng)用于許多領(lǐng)域，成為十分重要的分離分析手段。許多氣體、液體和固體樣品都能找到合適的色譜法進(jìn)行分離和分析。Temporal course淋洗液淋洗液慢慢中等中等快快4、色譜法的分類(lèi)、色譜法的分類(lèi)（1）按兩相狀態(tài)分類(lèi)氣體為流動(dòng)相的色譜稱(chēng)為氣相色譜（GC），氣固色譜（GS C）固定相是固體吸附劑；氣液色譜（GLC）固定相是固定液（附著在惰性載體上的一薄層有機(jī)化合物液體）。液體為

4、流動(dòng)相的色譜稱(chēng)液相色譜（LC），液固色譜（LSC）；液液色譜（LLC）。超臨界流體超臨界流體為流動(dòng)相的色譜稱(chēng)為超臨界流體色譜（SFC）。隨著色譜工作的發(fā)展，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)將固定液鍵合到載體表面，這種化學(xué)鍵合固定相的色譜又稱(chēng)化學(xué)鍵合相色譜（CBPC）。（2）按分離機(jī)理分類(lèi)l吸附色譜法：利用組分在吸附劑（固定相）上的吸附能力強(qiáng)弱不同而得以分離的方法。l分配色譜法：利用組分在固定液（固定相）中溶解度不同而達(dá)到分離的方法。l離子交換色譜法：利用組分在離子交換劑（固定相）上的親和力大小不同而達(dá)到分離的方法。l凝膠色譜法或尺寸排阻色譜法：利用大小不同的分子在多孔固定相中的選擇滲透而達(dá)到分離的方法。l親和色譜

5、法：最近，又有一種新分離技術(shù)，利用不同組分與固定相（固定化分子）的高專(zhuān)屬性親和力進(jìn)行分離的技術(shù)，常用于蛋白質(zhì)的分離。a.吸附色譜法 被分離物與吸附劑表面分子相互作用而被吸附，由于不同化合物結(jié)構(gòu)及性質(zhì)上的差異，在吸附劑上的吸附性能是不同的，在色譜分離過(guò)程中，用一定的溶劑系統(tǒng)洗脫柱子時(shí)，由于溶劑(洗脫劑)與混合物里各組分爭(zhēng)奪吸附劑的活性表面，解吸出來(lái)的組分與溶劑始終存在著對(duì)吸附劑的競(jìng)爭(zhēng)吸附，洗脫劑對(duì)不同的物質(zhì)的洗脫能力也是不同的。 因此吸附與解吸始終貫穿整個(gè)色譜過(guò)程，吸附與解吸是吸附色譜法的理論基礎(chǔ)。吸附過(guò)程無(wú)選擇性，吸附與解吸附過(guò)程可逆，但吸附強(qiáng)弱和先后順序都基本遵循“相似相吸附”的經(jīng)驗(yàn)規(guī)律。吸

6、附力最弱的組分隨溶劑首先流出。 硅膠、氧化鋁、聚酰胺。b.分配色譜 將兩相溶劑中的一相涂覆在硅膠等載體上作為固定相，再用與固定相不相混溶的另一相溶劑作為流動(dòng)相，物質(zhì)可在兩相溶劑相對(duì)做逆流移動(dòng)過(guò)程中不斷進(jìn)行動(dòng)態(tài)分配而得以分離。 正相色譜：固定相采用強(qiáng)極性溶劑，如水、緩沖溶液等，流動(dòng)相則用氯仿等弱極性溶劑，稱(chēng)之為正相(normal phase)色譜；反相色譜：以弱極性成分如石蠟油為固定相，流動(dòng)相則以水、乙腈、甲醇強(qiáng)極性溶劑，則兩相可以顛倒，稱(chēng)之為反相(reverse phase)色譜，更適合于水溶性成分的分離。 液液分配色譜的分離條件可以基于相應(yīng)的正相及反相分配薄層層析結(jié)果加以選定。c.離子交換色

7、譜 以離子交換樹(shù)脂或表面涂有液體離子交換樹(shù)脂的固體顆粒為固定相，裝在柱中，以水或含水溶劑為流動(dòng)相，使樣品溶液流過(guò)交換柱，溶液中的中性分子及具有與離子交換樹(shù)脂可交換基團(tuán)相反電荷的離子通過(guò)柱子從柱底流出，而具有相同電荷的離子則與樹(shù)脂上的交換基團(tuán)進(jìn)行離子交換并被吸附到柱上。由于不同離子與同一樹(shù)脂交換能力不同，移動(dòng)速度也不同，在柱上形成色譜帶，另選一適當(dāng)?shù)南疵搫?含有比吸附物質(zhì)更活潑的離子)進(jìn)行洗脫交換，可將吸附物質(zhì)按先后順序從柱上洗脫下來(lái)，即可實(shí)現(xiàn)不同組分物質(zhì)的分離。主要用于分離氨基酸，生物堿，糖類(lèi)化合物。 d.凝膠色譜法 也叫分子篩過(guò)濾，利用分子篩分離物質(zhì)的一種方法。所用載體，如葡聚糖凝膠，是不溶

8、于水，但可在水中膨脹的球形顆粒，具有三維空間的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。當(dāng)在水中充分膨脹后裝入層析柱中。 加入樣品，用同一溶劑洗脫時(shí)，由于凝膠網(wǎng)孔半徑的限制，大分子將不能滲入凝膠顆粒內(nèi)部(即被排阻在凝膠顆粒外部)，所以在顆粒間隙移動(dòng)，并隨溶劑一起從柱底先流出，小分子因可自由滲入并擴(kuò)散到凝膠顆粒內(nèi)部，故通過(guò)層析柱時(shí)阻力增大、流速變緩，較晚流出。 (1)葡聚糖凝膠 (2) 羥丙基葡聚糖凝膠(SephadexLH-20)。 樣品混合物中各個(gè)成分因分子大小各異，滲入至凝膠顆粒內(nèi)部的程度也不盡相同，故在經(jīng)歷一段時(shí)間流動(dòng)并達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，即按分子由大到小次序先后流出并得到分離。e.親和色譜(3)按固定相的外形分類(lèi)固定相裝于

9、柱內(nèi)的色譜法，稱(chēng)為。固定相呈平板狀的色譜法，稱(chēng)為，它又可分為薄層色譜和紙色譜。根據(jù)以上所述，將色譜法的分類(lèi)總結(jié)于下表中。第二節(jié)第二節(jié) 色譜流出曲線(xiàn)及有關(guān)術(shù)語(yǔ)色譜流出曲線(xiàn)及有關(guān)術(shù)語(yǔ)1、色譜流出曲線(xiàn)和色譜峰樣品各組分在色譜柱中得到分離后隨流動(dòng)相依次流出色譜柱，先后到達(dá)檢測(cè)器。經(jīng)檢測(cè)器把各組分的濃度信號(hào)轉(zhuǎn)變成電信號(hào)，然后用記錄儀或工作站軟件將組分的信號(hào)記錄下來(lái)，這種組分響應(yīng)信號(hào)大小隨時(shí)間變化所記錄下來(lái)的曲線(xiàn)稱(chēng)為色譜流出曲線(xiàn)，也叫做色譜圖。Relative Abundance色譜圖中曲線(xiàn)突起的部分稱(chēng)為色譜峰，由于響應(yīng)信號(hào)的大小或強(qiáng)度與物質(zhì)的量或物質(zhì)的濃度成正比，色譜流出曲線(xiàn)實(shí)際上是物質(zhì)的量或濃度時(shí)間曲

10、線(xiàn)。l 如果進(jìn)樣量很小，濃度很低，在吸附等溫線(xiàn)的線(xiàn)性范圍內(nèi)，色譜峰如果對(duì)稱(chēng)，可用Gauss正態(tài)分布函數(shù)表示： l式中：C不同時(shí)間t時(shí)某物質(zhì)在柱出口處的濃度，C0進(jìn)樣濃度，tr保留時(shí)間，標(biāo)準(zhǔn)偏差。)(21exp220rttCC2、基線(xiàn)在實(shí)驗(yàn)操作條件下，柱中僅有流動(dòng)相通過(guò)時(shí)，檢測(cè)器響應(yīng)訊號(hào)的記錄值，即圖中O-t線(xiàn)。它應(yīng)該是一條直線(xiàn)，若是斜線(xiàn)就稱(chēng)為基線(xiàn)漂移，如果基線(xiàn)出現(xiàn)上下波動(dòng)則稱(chēng)為噪聲。保持基線(xiàn)平穩(wěn)，是進(jìn)行色譜分析的最基本要求。3、峰高色譜峰頂點(diǎn)與基線(xiàn)之間的垂直距離，以h表示，如圖中BA。是色譜定量分析的依據(jù)之一。4、保留值(retention value)（1）死時(shí)間tm不被固定相吸附或溶解的物

11、質(zhì)進(jìn)入色譜柱時(shí)，從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰極大值所需的時(shí)間稱(chēng)為死時(shí)間，它正比于色譜柱的空隙體積，如圖中 OA。因?yàn)檫@種物質(zhì)不被固定相吸附或溶解，故其流動(dòng)速度將與流動(dòng)相的流動(dòng)速度相近測(cè)定流動(dòng)相平均線(xiàn)速時(shí)，可用往長(zhǎng)L與tm的比值計(jì)算。mtLu （2）保留時(shí)間tR試樣從進(jìn)樣開(kāi)始到柱后出現(xiàn)峰極大點(diǎn)時(shí)所經(jīng)歷的時(shí)間，稱(chēng)為保留時(shí)間，如圖中的 OB它相應(yīng)于樣品到達(dá)柱末端的檢測(cè)器所需的時(shí)間（3）調(diào)整保留時(shí)間tR 某組份的保留時(shí)間扣除死時(shí)間后稱(chēng)為該組份的調(diào)整保留時(shí)間，即 tR= tR-tm由于組份在色譜柱中的保留時(shí)間tR包含了組份隨流動(dòng)相通過(guò)柱子所需的時(shí)間和組份在固定相中滯留所需的時(shí)間，所以tR實(shí)際上是組份在固定相中停留的總

12、時(shí)間。 保留時(shí)間是色譜法定性的基本依據(jù)，但同一組份的保留時(shí)間常受到流動(dòng)相流速的影響，因此色譜工作者有時(shí)用保留體積等參數(shù)進(jìn)行定性檢定（4）死體積 Vm指色譜柱在填充后，柱管內(nèi)固定相顆粒間所剩留的空間、色譜儀中管路和連接頭間的空間以及檢測(cè)器的空間的總和當(dāng)后兩項(xiàng)很小而可忽略不計(jì)時(shí)，死體積可由死時(shí)間與流動(dòng)相體積流速F0（mLmin）計(jì)算： Vm = tm F0(5)保留體積VR指從進(jìn)樣開(kāi)始到被測(cè)組分在柱后出現(xiàn)濃度極大點(diǎn)時(shí)所通過(guò)的流動(dòng)相的體積。保留時(shí)間與保留體積的關(guān)系：VR = tRF0（6）調(diào)整保留體積VR某組分的保留體積扣除死體積后，為該組分的調(diào)整保留體積VR = VR-Vm(7) 相對(duì)保留值r2.

13、1 某組份2的調(diào)整保留值與組份1的調(diào)整保留值之比，稱(chēng)為相對(duì)保留值：由于相對(duì)保留值只與柱溫及固定相的性質(zhì)有關(guān)，而與柱徑、柱長(zhǎng)、填充情況及流動(dòng)相流速無(wú)關(guān)，因此，它是色譜法中，特別是氣相色譜法中，廣泛使用的定性數(shù)據(jù)。12121 . 2RRRRVVtt5、選擇因子在定性分析中，通常固定一個(gè)色譜峰作為標(biāo)準(zhǔn)（s），然后再求其它峰（i）對(duì)這個(gè)峰的相對(duì)保留值。此時(shí)，ri/s可能大于1，也可能小于1。在多元混合物分析中，通常選擇一對(duì)最難分離的物質(zhì)對(duì)，將它們的相對(duì)保留值作為重要參數(shù)。在這種特殊情況下，可用符號(hào)表示：式中， tr(i)為后出峰的調(diào)整保留時(shí)間，所以這時(shí)總是大于1的 。相對(duì)保留值往往可作為衡量固定相選擇

14、性的指標(biāo)，又稱(chēng)選擇因子。)()(stitrr6、區(qū)域?qū)挾壬V峰的區(qū)域?qū)挾仁墙M份在色譜柱中譜帶擴(kuò)張的函數(shù)，它反映了色譜操作條件的動(dòng)力學(xué)因素。度量色譜峰區(qū)域?qū)挾韧ǔＳ腥N方法： 即0.607倍峰高處色譜峰寬的一半，如圖中EF距離的一半。即峰高一半處對(duì)應(yīng)的峰寬，如圖中GH間的距離它與標(biāo)準(zhǔn)偏差的關(guān)系是： W1/2=2.354 即色譜峰兩側(cè)拐點(diǎn)上的切線(xiàn)在基線(xiàn)上的截距，如圖中IJ的距離。它與標(biāo)準(zhǔn)偏差的關(guān)系是：W=4 在相同的色譜操作條件下獲得色譜峰的區(qū)域?qū)挾戎翟叫。f(shuō)明色譜柱的分離效能越好，柱效越高。7.峰面積由色譜峰與基線(xiàn)之間所圍成的面積稱(chēng)為峰面積，用“A”表示，是色譜定量分析的基本依據(jù)，對(duì)理想的對(duì)稱(chēng)峰

15、，峰面積與峰高，半峰寬的關(guān)系為 A=1.065h W1/2。一組分的色譜流出曲線(xiàn)對(duì)色譜分析十分重要，從色譜圖上可以獲得以下信息：（l）根據(jù)色譜峰的個(gè)數(shù)，可以判斷樣品中所合組 份的最少個(gè)數(shù)。 （2）根據(jù)色譜峰的保留值(或位置），可以進(jìn)行定性分析。 (3) 根據(jù)色譜峰下的面積或峰高，可以進(jìn)行定量分析。 （4）色譜峰的保留值及其區(qū)域?qū)挾?，是評(píng)價(jià)色譜柱分離效能的依據(jù)。 （5）色譜峰兩峰間的距離，是評(píng)價(jià)固定相(和流動(dòng)相)選擇是否合適的依據(jù)。第三節(jié)第三節(jié) 色譜法基本原理色譜法基本原理l色譜分析的目的是將樣品中各組分彼此分離。l組分要達(dá)到完全分離，兩峰間的距離必須足夠遠(yuǎn)，兩組分分配系數(shù)相差越大，兩色譜峰間的

16、距離就越大。l但是兩峰間雖有一定距離，如果每個(gè)峰都很寬，以致彼此重疊，還是不能分開(kāi)。l因此，要從熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)兩方面來(lái)研究色譜行為。色譜分析的基本理論有兩個(gè)：一個(gè)是以熱力學(xué)平衡為基礎(chǔ)的塔板理論；另一個(gè)是以動(dòng)力學(xué)為基礎(chǔ)的速率理論，兩個(gè)理論相輔相成，較為滿(mǎn)意地揭示了色譜分析中的有關(guān)問(wèn)題和現(xiàn)象。1、分配系數(shù)K和分配比k（1）分配系數(shù)K分配色譜的分離是基于樣品組分在固定相和流動(dòng)相之間反復(fù)多次地分配過(guò)程，而吸附色譜的分離是基于反復(fù)多次地吸附一脫附過(guò)程。這種分離過(guò)程經(jīng)常用樣品分子在兩相間的分配來(lái)描述，而描述這種分配的參數(shù)稱(chēng)為分配系數(shù)K。它是指在一定溫度和壓力下，組分在固定相和流動(dòng)相之間分配達(dá)平衡時(shí)的濃度之

17、比值，即分配系數(shù)是由組分和兩相的熱力學(xué)性質(zhì)決定的。例：逆流分配色譜l取一系列試管，向1號(hào)管加入互不相溶的兩種溶劑，A溶劑為上相（動(dòng)相），B溶劑為下相（靜相），體積相等。l加入物質(zhì)Y（K=1）和物質(zhì)Z（K=1/3）的混合物，各組分物質(zhì)將按自己的分配系數(shù)在上下相中進(jìn)行分配。l平衡后，將上相轉(zhuǎn)移到2號(hào)管內(nèi)，其中含有相同體積的新下相，從1號(hào)轉(zhuǎn)移來(lái)的樣品將在2號(hào)管的上下相中再分配。l與此同時(shí)，向1號(hào)管內(nèi)加入新的上相，這里也將發(fā)生樣品的再分配。分配系數(shù)小的物質(zhì)Z沿一系列分溶管的“移動(dòng)”速度比分配系數(shù)大的物質(zhì)Y快。那么它流出色譜柱。每一種物質(zhì)在一系列分溶管中是相當(dāng)集中的，分溶曲線(xiàn)呈峰形，只要使用足夠數(shù)目的分

18、溶管，繼續(xù)進(jìn)行分配，就可以使兩峰彼此分來(lái)。一定量的某一溶質(zhì)在一定量的溶劑系統(tǒng)中分配時(shí)，轉(zhuǎn)移次數(shù)越多，即分溶管數(shù)越多，其分溶曲線(xiàn)越集中，即峰形窄而高，有利于各物質(zhì)的完全分離。（2）分配比k分配比又稱(chēng)容量因子，它是指在一定溫度和壓力下，組分在兩相間分配達(dá)平衡時(shí)，分配在固定相和流動(dòng)相中的質(zhì)量比。即 k值越大，說(shuō)明組分在固定相中的量越多，相當(dāng)于柱的容量大，因此又稱(chēng)分配容量或容量因子。它是衡量色譜柱對(duì)被分離組分保留能力的重要參數(shù)。k值也決定于組分及固定相熱力學(xué)性質(zhì)。它不僅隨柱溫、柱壓變化而變化，而且還與流動(dòng)相及固定相的體積有關(guān)。滯留因子Rs分配比k值可直接從色譜圖測(cè)得。設(shè)流動(dòng)相在柱內(nèi)的線(xiàn)速度為u，組分在

19、柱內(nèi)線(xiàn)速度為us，由于固定相對(duì)組分有保留作用，所以u(píng)su此兩速度之比稱(chēng)為滯留因子Rs。它反映了組分在流動(dòng)相中的分配比例數(shù)。例如，某組分完全不被固定相滯留，即該組分100分配在流動(dòng)相中。rmssttuuR(3)分配系數(shù)K 與分配比k的關(guān)系其中稱(chēng)為，它是反映各種色譜柱型特點(diǎn)的又一個(gè)參數(shù)。例如，對(duì)填充柱，其值一般為635；對(duì)毛細(xì)管柱，其值為60600。Cs，Cm分別為組分在固定相和流動(dòng)相中的濃度；Vm為柱中流動(dòng)相的體積，近似等于死體積；Vs為柱中固定相的體積。kVVkVmVmCCKsmmmssms/(4)分配系數(shù)K及分配比k與選擇因子的關(guān)系對(duì)A、B兩組分的選擇因子，用下式表示：上式表明：兩組分的K或

20、k值相差越大，則分離得越好。因此兩組分具有不同的分配系數(shù)是色譜分離的先決條件。 )()()()()()(AKBKAkBkAtBtrr2、踏板理論最早由Martin等人提出塔板理論，把色譜柱比作一個(gè)精餾塔，柱內(nèi)由許多想像的塔板組成,沿用精餾塔中塔板的概念來(lái)描述組分在兩相間的分配行為，同時(shí)引入理論塔板數(shù)作為衡量柱效率的指標(biāo)。該理論假定： （i）在柱內(nèi)一小段長(zhǎng)度H內(nèi)，組分可以在兩相間迅速達(dá)到平衡。這一小段柱長(zhǎng)稱(chēng)為理論塔板高度H。 （ii）以氣相色譜為例，載氣進(jìn)入色譜柱不是連續(xù)進(jìn)行的，而是脈動(dòng)式，每次進(jìn)氣為一個(gè)塔板體積（Vm）。 （iii）所有組分開(kāi)始時(shí)存在于第0號(hào)塔板上，而且試樣沿軸（縱）向擴(kuò)散可忽

21、略。 （iv）分配系數(shù)在所有塔板上是常數(shù)，與組分在某一塔板上的量無(wú)關(guān)。 為簡(jiǎn)單起見(jiàn)，設(shè)色譜往由5塊塔板（n=5，n為柱子的塔板數(shù)）組成，并以r表示塔板編號(hào)，r=1，2，n-l；某組分的分配比k=1。 根據(jù)上述假定，在色譜分離過(guò)程中，該組分的分布可計(jì)算如下： 開(kāi)始時(shí)，若有單位質(zhì)量，即m=1（例1mg或1g）的該組分加到第0號(hào)塔板上，分配平衡后，由于k=1，即ms=mm故mm=ms=0.5。當(dāng)一個(gè)板體積（lV）的載氣以脈動(dòng)形式進(jìn)入0號(hào)板時(shí)，就將氣相中含有mm部分組分的載氣頂?shù)?號(hào)板上，此時(shí)0號(hào)板液相（或固相）中ms部分組分及1號(hào)板氣相中的nm部分組分，將各自在兩相間重新分配。故0號(hào)板上所含組分總量

22、為0.5，其中氣液（或氣固）兩相各為0.25，而1號(hào)板上所含總量同樣為0.5，氣液（或氣固）相亦各為0.25。塔板號(hào)r0123進(jìn)樣mm0.5ms0.5進(jìn)氣1Vmm0.250.25ms0.250.25進(jìn)氣2Vmm0.1250.250.125ms0.1250.250.125進(jìn)氣3Vmm0.0630.1880.1880.063ms0.0630.1880.1880.063按上述分配過(guò)程，對(duì)于n=5，k=1，m=1的體系，隨著脈動(dòng)進(jìn)入柱中板體積載氣的增加，組分分布在柱內(nèi)任一板上的總量（氣液兩相中的總質(zhì)量）見(jiàn)表：經(jīng)N次轉(zhuǎn)移后，在各塔板上組分含量的分布符合（ ms + mm ）N的二項(xiàng)式展開(kāi)式。如N=4、k

23、=1時(shí)，展開(kāi)式為：對(duì)于各塔板上組分分布計(jì)算得到：0.063，0.25，0.375，0.25，0.063，由二項(xiàng)式展開(kāi)的值與上表相一致。 如果色譜柱的塔板數(shù)n大于50，組分在柱內(nèi)就可得到較多次的平衡分配，如果以組分流出色譜柱的濃度或量為縱坐標(biāo)對(duì)相應(yīng)的流出時(shí)間，作圖，所得到的色譜流出曲線(xiàn)趨于正態(tài)分布。此時(shí)，進(jìn)入色譜柱的流動(dòng)相塔板體積數(shù)N已足夠大，二項(xiàng)式分布完全可以用正態(tài)分布來(lái)表示。由塔板理論的流出曲線(xiàn)方程可導(dǎo)出理論塔板數(shù)n與色譜峰底寬度的關(guān)系。根據(jù)流出曲線(xiàn)的正態(tài)分布方程，可有另一表達(dá)式：m為組分質(zhì)量，Vr為保留體積，n為理論塔板數(shù)。當(dāng)V=Vr 時(shí)，C值最大，即)1 (2exp22rrVVnVmnC

24、rVmnC2maxl由流出曲線(xiàn)方程可推出n與保留時(shí)間tr、半峰寬W1/2、峰底寬W的關(guān)系：l從而求得理論塔板高度H，即：222/1)(16)(54. 5WtWtnrrnLH l從上兩式可以看出，色譜峰W越窄，塔板數(shù)n就越多，而理論塔板高度H就越小，柱效能越高。因此，n和H是描述柱效能的指標(biāo)。l通常填充色譜柱的n103，H1mm。而毛細(xì)管柱 n=105-106，H0.5mm。由于死時(shí)tm包括在tr中,而實(shí)際的tm不參與柱內(nèi)分配,所計(jì)算的n值盡管很大，H很小,但與實(shí)際柱效能相差甚遠(yuǎn)。所以，提出把tm扣除，采用和評(píng)價(jià)柱效能。222/1)(16)(54. 5wtwtnrreffeffeffnLHl塔板

25、理論用熱力學(xué)觀點(diǎn)形象地描述了溶質(zhì)在色譜柱中的分配平衡和分離過(guò)程，導(dǎo)出流出曲線(xiàn)的數(shù)學(xué)模型，并成功地解釋了流出曲線(xiàn)的形狀及濃度極大值的位置，還提出了計(jì)算和評(píng)價(jià)柱效的參數(shù)。l但由于它的某些基本假設(shè)并不完全符合柱內(nèi)實(shí)際發(fā)生的分離過(guò)程，例如，縱向擴(kuò)散是不能忽略的。l它也沒(méi)有考慮各種動(dòng)力學(xué)因素對(duì)色譜柱內(nèi)傳質(zhì)過(guò)程的影響，因此它不能解釋造成譜帶擴(kuò)張的原因和影響板高的各種因素，也不能說(shuō)明為什么在不同流速下可以測(cè)得不同的理論塔板數(shù)，這就限制了它的應(yīng)用。3、速率理論1956年荷蘭學(xué)者van Deemter等在研究氣液色譜時(shí)，他們吸收了塔板理論中板高的概念，并充分考慮了組分在兩相間的擴(kuò)散和傳質(zhì)過(guò)程，從而在動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ)上

26、較好地解釋了影響板高的各種因素。該理論模型對(duì)氣相、液相色譜都適用。 van Deemter方程的數(shù)學(xué)簡(jiǎn)化式為：式中u為流動(dòng)相的線(xiàn)速度；A，B，C為常數(shù)，分別代表渦流擴(kuò)散項(xiàng)系數(shù)、分子擴(kuò)散項(xiàng)系數(shù)、傳質(zhì)阻力項(xiàng)系數(shù)。CuuBAH(1)渦流擴(kuò)散項(xiàng)在填充色譜柱中，當(dāng)組分隨流動(dòng)相向柱出口遷移時(shí)，流動(dòng)相由于受到固定相顆粒障礙，不斷改變流動(dòng)方向，使組分分子在前進(jìn)中形成紊亂的類(lèi)似“渦流”的流動(dòng)，故稱(chēng)渦流擴(kuò)散，形象地如圖所示。 l由于填充物顆粒大小的不同及填充物的不均勻性，使組分在色譜柱中路徑長(zhǎng)短不一，因而同時(shí)進(jìn)色譜柱的相同組分到達(dá)柱出口的時(shí)間并不一致，引起色譜峰的變寬。色譜峰變寬的程度由下式?jīng)Q定：上式表明，A與填

27、充物的的大小和有關(guān)，與流動(dòng)相的性質(zhì)、線(xiàn)速變和組分性質(zhì)無(wú)關(guān)。為了減少渦流擴(kuò)散，提高柱效，使用細(xì)而均勻的顆粒，并且填充均勻是十分必要的。對(duì)于空心毛細(xì)管，不存在渦流擴(kuò)散，因此A0。（2）分子擴(kuò)散項(xiàng)B/u（縱向擴(kuò)散項(xiàng)） 縱向分子擴(kuò)散是由濃度梯度造成的。組分從柱人口加入，其濃度分布的構(gòu)型呈“塞子”狀。如圖所示。它隨著流動(dòng)相向前推進(jìn)，由于存在濃度梯度，“塞子”必然自發(fā)地向前和向后擴(kuò)散，造成譜帶展寬。分子擴(kuò)散項(xiàng)系數(shù)為 B2Dg 式中是填充柱內(nèi)流動(dòng)相擴(kuò)散路徑彎曲的因素，也稱(chēng)彎曲因子，它反映了固定相顆粒的幾何形狀對(duì)自由分子擴(kuò)散的阻礙情況。Dg為組分在流動(dòng)相中擴(kuò)散系數(shù)（cm2s-1）。另外，縱向擴(kuò)散與組分在色譜柱

28、內(nèi)停留時(shí)間有關(guān)，流動(dòng)相流速小，組分停留時(shí)間長(zhǎng)，縱向擴(kuò)散就大。因此，為降低縱向擴(kuò)散影響，要加大流動(dòng)相流速。對(duì)于液相色譜，組分在流動(dòng)相中的縱向擴(kuò)散可以忽略。（3）傳質(zhì)阻力項(xiàng)Cu 由于氣相色譜以氣體為流動(dòng)相，液相色譜以液體為流動(dòng)相，它們的傳質(zhì)過(guò)程不完全相同，現(xiàn)分別討論。a.氣相色譜對(duì)于氣液色譜，傳質(zhì)阻力系數(shù)C包括氣相傳質(zhì)阻力系數(shù)Cg和液相傳質(zhì)阻力系數(shù)Cl兩項(xiàng)，即氣相傳質(zhì)過(guò)程是指試樣組分從氣相移動(dòng)到固定相表面的過(guò)程。這一過(guò)程中試樣組分將在兩相間進(jìn)行質(zhì)量交換，即進(jìn)行濃度分配。有的分子還來(lái)不及進(jìn)入兩相界面，就被氣相帶走；有的則進(jìn)人兩相界面又來(lái)不及返回氣相。這樣，使得試樣在兩相界面上不能瞬間達(dá)到分配平衡，引

29、起滯后現(xiàn)象，從而使色譜峰變寬。對(duì)于填充柱，氣相傳質(zhì)阻力系數(shù)Cg為：式中k為容量因子。由上式看出，氣相傳質(zhì)阻力與填充物粒度dp的平方成正比、與組分在載氣流中的擴(kuò)散系數(shù)Dg成反比。gpgDdkkC222)1 (01.0液相傳質(zhì)過(guò)程是指組分從固定相的氣-液界面移動(dòng)到液相內(nèi)部，并發(fā)生質(zhì)量交換，達(dá)到分配平衡，然后又返回氣-液界面的傳質(zhì)過(guò)程。此時(shí)氣相中組分的其他分子仍隨載氣不斷向柱出口運(yùn)動(dòng)，于是造成峰形擴(kuò)張。液相傳質(zhì)阻力系數(shù)C1為：由上式看出，固定相的液膜厚度df薄，組分在液相的擴(kuò)散系數(shù)D1大，則液相傳質(zhì)阻力就小。降低固定液的含量，可以降低液膜厚度，但k值隨之變小，又會(huì)使C1增大。當(dāng)固定液含量一定時(shí)，液膜

30、厚度隨載體的比表面積增加而降低，因此，一般采用比表面積較大的載體來(lái)降低液膜厚度，但比表面太大，由于吸附造成拖尾峰，也不利分離。雖然提高柱溫可增大Dl，但會(huì)使k值減小，為了保持適當(dāng)?shù)腃l值，應(yīng)控制適宜的柱溫。 lflDdkkC22)1 (32將上面式總結(jié)，即可得氣液色譜速率板高方程這一方程對(duì)選擇色譜分離條件具有實(shí)際指導(dǎo)意義，它指出了色譜柱填充的均勻程度，填料顆粒的大小，流動(dòng)相的種類(lèi)及流速，固定相的液膜厚度等對(duì)柱效的影響。uDkkdDdkkuDdHlfrpgp)1 ( 32)1 (01. 02222222b.液相色譜對(duì)于液液分配色譜，傳質(zhì)阻力系數(shù)（C）包含流動(dòng)相傳質(zhì)阻力系數(shù)（Cm）和固定相傳質(zhì)系數(shù)

31、（Cs），即:其中Cm又包含流動(dòng)的流動(dòng)相中的傳質(zhì)阻力和滯留的流動(dòng)相中的傳質(zhì)阻力，即: 式中右邊第一項(xiàng)為流動(dòng)相中的傳質(zhì)阻力。當(dāng)流動(dòng)相流過(guò)色譜柱內(nèi)的填充物時(shí)，靠近填充物顆粒的流動(dòng)相流速比在流路中間的稍慢一些，故柱內(nèi)流動(dòng)相的流速是不均勻。 m是由柱和填充的性質(zhì)決定的因子。mpsmmpmmDdDdC22右邊第二項(xiàng)為流動(dòng)相中的傳質(zhì)阻力。這是由于固定相的多孔性，會(huì)造成某部分流動(dòng)相滯留在一個(gè)局部，滯留在固定相微孔內(nèi)的流動(dòng)相一般是停滯不動(dòng)的。流動(dòng)相中的試樣分子要與固定相進(jìn)行質(zhì)量交換，必須首先擴(kuò)散到滯留區(qū)。如果固定相的微孔既小又深，傳質(zhì)速率就慢，對(duì)峰的擴(kuò)展影響就大。sm是一系數(shù)，它與顆粒微孔中被流動(dòng)相所占據(jù)部分

32、的分?jǐn)?shù)及容量因子有關(guān)。液液色譜中固定相傳質(zhì)阻力系數(shù)（Cs）可用下式表示：sfssDdC2綜上所述，對(duì)液液色譜的Van Deemter方程式可表達(dá)為： 該式與氣液色譜速率方程的形式基本一致，主要區(qū)別在液液色譜中縱向擴(kuò)散項(xiàng)可忽略不計(jì)，影響柱效的主要因素是傳質(zhì)阻力項(xiàng)。uDdDdDduDdHsfsmpsmmpmmp)(22222（4）流動(dòng)相線(xiàn)速率對(duì)板高的影響a. LC和GC的H-u圖表明， 對(duì)于一定長(zhǎng)度的柱子，柱效越高，理論塔板數(shù)越大，板高越小。但究竟控制怎樣的線(xiàn)速度，才能達(dá)到最小板高呢？根據(jù)van Deemter公式分別作LC和GC的H-u圖，見(jiàn)圖（a）和（b）。由圖（a）和（b）不難看出：LC和G

33、C的H-u圖十分相似，對(duì)應(yīng)某一流速都有一個(gè)板高的極小值，這個(gè)極小值就是柱效最高點(diǎn)； LC板高極小值比GC的極小值小一個(gè)數(shù)量級(jí)以上，說(shuō)明液相色譜的柱效比氣相色譜高得；LC的板高最低點(diǎn)相應(yīng)流速比起GC的流速亦小一個(gè)數(shù)量級(jí)，說(shuō)明對(duì)于LC來(lái)說(shuō)，為了取得良好的柱效，流速不一定要很高。 b.分子擴(kuò)散項(xiàng)和傳質(zhì)阻力項(xiàng)對(duì)板高的貢獻(xiàn)（5）固定相粒度大小對(duì)板高的影響 固定相粒度對(duì)板高的影響是至關(guān)重要的。實(shí)驗(yàn)表明不同粒度，H-u曲線(xiàn)也不同（如圖）：粒度越細(xì)，板高越小，并且受線(xiàn)速度影響亦小。這就是為什么在HPLC中采用細(xì)顆粒作固定相的根據(jù)。當(dāng)然，固定相顆粒愈細(xì)，柱流速愈慢。只有采取高壓技術(shù)，流動(dòng)相流速才能符合實(shí)驗(yàn)要求。

34、4、分離度右圖說(shuō)明了柱效和選擇性對(duì)分離的影響。圖中（a）兩色譜峰距離近并且峰形寬。兩峰嚴(yán)重相疊，這表示選擇性和柱效都很差。圖中（b）雖然兩峰距離拉開(kāi)了，但峰形仍很寬，說(shuō)明選擇性好，但柱效低。圖中（c）分離最理想，說(shuō)明選擇性好，柱效也高。 由此可見(jiàn)，單獨(dú)用柱效或選擇性不能真實(shí)反映組分在色譜柱中分離情況，故需引人一個(gè)綜合性指標(biāo)。分離度是既能反映柱效率又能反映選擇性的指標(biāo)，稱(chēng)。分離度又叫分辨率，它定義為相鄰兩組分色譜峰保留值之差與兩組分色譜峰底寬總和之半的比值，即R值越大，表明相鄰兩組分分離越好。一般說(shuō)，當(dāng)R1時(shí)，兩峰有部分重疊；當(dāng)R1時(shí)，分離程度可達(dá)98；當(dāng)R15時(shí)，分離程度可達(dá)997。通常用R=1.5作為相鄰兩組分已完全分離的標(biāo)志。2121)(2)(211212wwttwwttRrrrrl下圖表示了不同分離度時(shí)色譜峰分離的程度。5、基本色譜方程分離度R的定義并沒(méi)有反映影響分離度的諸因素。實(shí)際上，分離度受柱效（n）、選擇因子()和容量因子（k）三個(gè)參數(shù)的控制。對(duì)于難分離物質(zhì)對(duì)，由于它們的分配系數(shù)差別小，可合理地假設(shè)k1k2=k，W1W2W 。最后推導(dǎo)整理出基本色譜方程式：l在實(shí)際應(yīng)用中，往往用neff。代替n，處理上式可得：l隨后推導(dǎo)出