1、綜合實(shí)驗(yàn)：多管發(fā)酵法測(cè)自來(lái)水大腸菌群組員：李妍、馬萬(wàn)貴、石真真、李招柳、池小輝一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、 學(xué)習(xí)檢測(cè)水中大腸菌群的方法，了解大腸菌群數(shù)量與水質(zhì)狀況的關(guān)系；2、 測(cè)定自來(lái)水是否符合飲用水的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)；3、 培養(yǎng)學(xué)生自主設(shè)計(jì)并完成實(shí)驗(yàn)的能力，激發(fā)學(xué)生的科研主動(dòng)性與積極性；4、 通過(guò)實(shí)驗(yàn)了解檢測(cè)水中大腸菌群的原理和方法。二、實(shí)驗(yàn)原理大腸菌群一一能在37c24-48h內(nèi)發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸與產(chǎn)氣、需氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽抱桿菌，易于培養(yǎng)和觀察。糞便中存在大量的大腸菌群細(xì)菌，并且它們與水中存在的腸道病原菌成正相關(guān)性。水中病原菌濃度很低，測(cè)定手續(xù)復(fù)雜，工作人員還有被感染傳播的危險(xiǎn)。所以檢測(cè)水的細(xì)菌學(xué)衛(wèi)生標(biāo)

2、準(zhǔn)，通常檢測(cè)大腸菌群。多管發(fā)酵法包括初發(fā)酵、平板分離和復(fù)發(fā)酵3個(gè)部分。初發(fā)酵中發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，根據(jù)培養(yǎng)基內(nèi)指示劑顏色變化及杜氏小管內(nèi)有無(wú)氣體，判斷是否為陽(yáng)性（液體培養(yǎng)基含有乳糖、蛋白月東和澳甲酚紫。由于許多細(xì)菌不能發(fā)酵乳糖，不生長(zhǎng)，而大腸菌群可發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸（有機(jī)酸），產(chǎn)氣（CQ+d）乳糖起選擇性碳源的作用。澳甲酚紫是PH指示劑（堿性條件：紫藍(lán)色；酸性條件：黃色，變色點(diǎn)PH=6.7）,當(dāng)大腸菌群的細(xì)菌利用乳糖產(chǎn)酸后，使原來(lái)的PH由中性下降呈酸性，培養(yǎng)基從紫色變?yōu)辄S色。另外，澳甲酚紫還具有抑制其他細(xì)菌（如芽抱桿菌）生長(zhǎng)的作用）。平板分離一般利用大腸菌群在伊紅美藍(lán)（EMB培養(yǎng)基）上形成紫色金屬光

3、澤菌落并結(jié)合革蘭氏染色進(jìn)行判斷（作為指示劑，大腸菌群發(fā)酵乳糖造成酸性環(huán)境時(shí)該兩種染料即結(jié)合成復(fù)合物，使大腸菌群產(chǎn)生帶核的、有金屬光澤的深紫色菌落。將符合大腸菌群菌落特征的菌落進(jìn)行革蘭氏染色，只有染色為革蘭氏陰性、無(wú)芽胞桿菌的菌落，才是大腸菌群菌落）。最后進(jìn)行復(fù)發(fā)酵進(jìn)一步證實(shí)。三、實(shí)驗(yàn)材料及用具1、 培養(yǎng)基：伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基（EMB培養(yǎng)基）、乳糖蛋白月東半固體培養(yǎng)基、乳糖蛋白培養(yǎng)液、3倍濃縮乳糖蛋白月東培養(yǎng)液2、 溶液和試劑：革蘭氏染色液、無(wú)菌水3、 儀器及用具：三角瓶（2個(gè)）、發(fā)酵用試管（32個(gè)）、發(fā)酵用燒瓶（4個(gè)）、杜氏小管（36個(gè)）、培養(yǎng)皿（12個(gè)）、移液管、接種環(huán)、酒精燈、記號(hào)筆、油鏡四、

4、操作步驟（一）水樣的采取1、自來(lái)水：先將自來(lái)水龍頭用火焰燒灼3min滅菌，再開(kāi)放水龍頭使水流5min后，以滅菌三角燒瓶接取水樣，以待分析2、池水：采用郵電學(xué)院噴泉水池中的水。取距水面10-15cm的深層水樣，先將滅菌的帶塞玻璃瓶，瓶口向下浸人水中，然后翻轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)，除去玻璃塞，水即流人瓶中，盛滿后，將瓶塞蓋好，再?gòu)乃腥〕觥＃ǘ┒喙馨l(fā)酵法檢測(cè)大腸菌群1、自來(lái)水的檢測(cè)（1）初發(fā)酵試驗(yàn)接種水樣總量為300ml:在2個(gè)含有50ml3倍濃縮的乳糖蛋白月東培養(yǎng)液發(fā)酵燒瓶（內(nèi)倒置杜氏小管）中，各加入100ml水樣。在10支含有5ml3倍濃縮乳糖蛋白月東培養(yǎng)液發(fā)酵管（內(nèi)倒置杜氏小管）中，各加入10ml水樣。混

5、勻后，37c培養(yǎng)24h,24h未產(chǎn)氣的繼續(xù)培養(yǎng)至48ho（2）平板分離：取出培養(yǎng)后的發(fā)酵管，觀察管中顏色變?yōu)辄S色者記錄為產(chǎn)酸，杜氏小管中有氣泡者記錄為產(chǎn)氣。將產(chǎn)酸產(chǎn)氣和只產(chǎn)酸的兩類發(fā)酵管（瓶）分別劃線接種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，37c下培養(yǎng)24h。挑選：深紫黑色、有金屬光澤；紫黑色、不帶或略帶金屬光澤；淡紫紅色、中心顏色較深的菌落（其初發(fā)酵管記錄為陽(yáng)性）的一部分進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢。（3）復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)：經(jīng)涂片、染色、鏡檢，如果是革蘭氏陰性無(wú)芽抱桿菌，則挑取菌落的另一部分，重新接種于乳糖蛋白月東培養(yǎng)液的復(fù)發(fā)酵管（內(nèi)倒置杜氏小管）中，每管可接種同一發(fā)酵管的典型菌落13個(gè)，37c培養(yǎng)24h。若為產(chǎn)酸產(chǎn)氣

6、者表明試管內(nèi)有大腸菌群存在，記錄為陽(yáng)性管，再根據(jù)初發(fā)酵實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性管（瓶）數(shù)查表9-10,即得總大腸菌群。表g-io大腸菌群槍數(shù)表接種水樣總量300ml100ml2份，10ml10份)100ml水量的陽(yáng)性瓶敷卜。ml水黃的陽(yáng)性管故0I_n比水樣中大腿菌群數(shù)1L水樣中大森菌群收IL水樣中大胸菌胖?jǐn)?shù)10<3411138IS,27,1327311IE3841424525tS3070Gnn369272743J208315】6Ig36股2304069>230；2、池水的檢測(cè)(1)將水樣稀釋成10-1與10.2.分別吸取lml101與10-2的稀釋水樣和lml原水樣，各注入裝有10ml乳糖蛋白月

7、東培養(yǎng)液發(fā)酵管中。另取10ml和100ml原水樣，分別注人裝有5ml和50ml三倍濃縮乳糖蛋白月東發(fā)酵液的試管(瓶)中。(3)初發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、平板分離和復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)(4)發(fā)酵結(jié)果查閱接種水樣總量為111.11ml檢索表。表XVT大腦備檢立惠接種水樣牯|111ml(tOOmL10mL1ml.0.EmlX1價(jià))接腫水一P/ml每升水樣中100IQ10,1大腸藻腓載一一<9一一4-9一+.石.一9.5+IB+一4-19.一+|=工工+一23-*2»+92一+一194+*iMfi+*一一230+*M)1+.十一23X0*一1+73HO*”大1b”發(fā)陽(yáng)性-*大及解炭斛性一五、結(jié)果記錄1、自來(lái)水多管發(fā)酵法實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄初發(fā)醉管數(shù)產(chǎn)酸產(chǎn)氣管數(shù)只產(chǎn)酸管數(shù)陽(yáng)性管數(shù)復(fù)發(fā)酵陽(yáng)性管數(shù)10大腸菌群數(shù)：2、池水多管發(fā)酵法實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄